TW202328166A - 針對新型冠狀病毒感染之ｍＲＮＡ疫苗之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

在本文中所提供的是編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之核糖核酸(RNA)，該S蛋白或其致免疫性片段包含至少一種非天然存在的胺基酸突變。在一些實施態樣中，該S蛋白係衍生自δ變異體。另外提供的是相關多核苷酸、載體、細胞、組成物、套組、製造方法及使用方法。

Description

針對新型冠狀病毒感染之ｍＲＮＡ疫苗之組成物及方法
所提供者係2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)之預防劑及治療劑、預防及治療。 相關申請案的交互參照
此申請案主張2021年08月11日申請的美國臨時申請案第63/232101號之優先權，該案之內容係以引用方式全部併入。
新型冠狀病毒(CoV)已多次跨越物種屏障，且一些已顯現成為重要的人病原體。在過去二十年，二種感染動物的冠狀病毒已進化並在人類引起爆發：嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒(SARS-CoV，2002，屬：β冠狀病毒( Betacoronavirus)，亞屬：嚴重急性呼吸道症候群β冠狀病毒亞屬( Sarbecovirus))及中東呼吸道症候群相關冠狀病毒(MERS-CoV，2012，屬：β冠狀病毒( Betacoronavirus)，亞屬：中東呼吸道症候群β冠狀病毒亞屬( Merbecovirus))。參見例如Drosten 等人， New Engl J Med.2003; 348:1967-1976；及Zaki 等人， New Engl J Med.2012; 367:1814-1820。
SARS-CoV-2 2019 (COVID-19) 是一種引起冠狀病毒疾病的冠狀病毒新病毒株。參見例如Zhu 等人， N Engl J Med. 2020, 382:727-733。根據世界衛生組織(WHO)於2021年7月26日發布的COVID-19每週流行病學更新和每週操作更新，全世界有近2億個確診病例及多於400萬個確診死亡病例。針對COVID-19尚無治癒療法，而類固醇已被用於住院成人的治療管理，且食品藥物管理局(FDA)已針對治療非住院的COVID-19個體的抗SARS-CoV-2抗體發出緊急使用授權(EUA)，諸如索托維單抗(sotrovimab)，以及凱西瑞單抗(casirivimab)及伊德維單抗(imdevimab)組合。參見例如COVID-19 Treatment Guidelines Panel. Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines. National Institutes of Health.，可於www.covid19treatmentguidelines.nih.gov獲得，最近於2021年7月27日造訪存取。
因此，對於SARS-CoV-2感染的有效預防及治療仍有急切需求。本揭露滿足此需求並提供相關優點功效。
在本文中所提供者係棘(s)蛋白或其免疫片段以及編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的棘(s)蛋白或其致免疫性片段之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。該S蛋白或其致免疫性片段包含下列者或基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：相較於例如諸如SEQ ID NO: 1或其變異體的SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白之至少一種非天然存在的胺基酸突變。在一些實施態樣中，該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含下列者的一或多者、或替代地基本上由下列者的一或多者組成、或又進一步由下列者的一或多者組成：絲胺酸(S)作為對應SEQ ID NO: 1的R682之胺基酸(R682S)、甘胺酸(G)作為對應SEQ ID NO: 1的R685之胺基酸(R685G)、脯胺酸(P)作為對應SEQ ID NO: 1的F817之胺基酸(F817P)、P作為對應SEQ ID NO: 1的A892之胺基酸(A892P)、P作為對應SEQ ID NO: 1的A899之胺基酸(A899P)、P作為對應SEQ ID NO: 1的A942之胺基酸(A942P)、P作為對應SEQ ID NO: 1的K986之胺基酸(K986P)、或P作為對應SEQ ID NO: 1的V987之胺基酸(V987P)。在一些實施態樣中，編碼棘(S)蛋白或其致免疫性片段之RNA不包含SEQ ID NO: 2。在一個態樣中，編碼S蛋白或其致免疫性片段之RNA包含SEQ ID NO: 55。在一些實施態樣中，該RNA係傳訊RNA (mRNA)。
在一些實施態樣中，該mRNA編碼S蛋白，該S蛋白進一步包含下列者、或基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：一或多種可見於SARS-CoV-2天然存在之變異體之突變(諸如δ變異體)。在一些實施態樣中，這些突變包含下列者的一或多者、或替代地由下列者的一或多者組成、或又進一步由下列者的一或多者組成：離胺酸(K)作為對應SEQ ID NO: 1的N440之胺基酸(N440K)、K作為對應SEQ ID NO: 1的E484之胺基酸(E484K)、精胺酸(R)作為對應SEQ ID NO: 1的T19之胺基酸(T19R)、***酸(F)作為對應SEQ ID NO: 1的V70之胺基酸(V70F)、異白胺酸(I)作為對應SEQ ID NO: 1的T95之胺基酸(T95I)、天冬胺酸(D)作為對應SEQ ID NO: 1的G142之胺基酸(G142D)、對應SEQ ID NO: 1的E156之刪除(E156Δ)、對應SEQ ID NO: 1的F157之刪除(F157Δ)、G作為對應SEQ ID NO: 1的R158之胺基酸(R158G)、纈胺酸(V)作為對應SEQ ID NO: 1的A222之胺基酸(A222V)、白胺酸(L)作為對應SEQ ID NO: 1的W258之胺基酸(W258L)、天冬醯胺酸(N)作為對應SEQ ID NO: 1的K417之胺基酸(K417N)、R作為對應SEQ ID NO: 1的K417之胺基酸(L452R)、K作為對應SEQ ID NO: 1的T478之胺基酸(T478K)、G作為對應SEQ ID NO: 1的D614之胺基酸(D614G)、R作為對應SEQ ID NO: 1的P681之胺基酸(P681R)、或N作為對應SEQ ID NO: 1的D950之胺基酸(D950N)。
在一些實施態樣中，該S蛋白或其致免疫性片段包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 5、6、7、10、11、或14之任一者或其各等效物之多肽。此揭露進一步提供編碼該等多肽及其等效物之RNA或DNA。在一些實施態樣中，該RNA包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 9、13、或16之多核苷酸或其各等效物。在一些實施態樣中，該RNA進一步包含3'非轉譯區(3’ UTR)、多腺苷酸化(多腺苷酸(多腺苷酸))尾及5'非轉譯區(5’ UTR)的一或多者。在一些實施態樣中，該RNA包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 32。SEQ ID NO: 9、13、16編碼S多肽。SEQ ID NO: 32係SEQ ID NO: 9，其進一步包含5及3’ UTR及多腺苷酸尾。
在一個態樣中，所提供的是多核苷酸，諸如DNA，其編碼如在本文中所揭示之RNA。亦提供的是編碼DNA之互補者。在一進一步態樣中，所提供的是載體，其包含如在本文中所揭示之多核苷酸。在一個實施態樣中，該載體係質體、視需要包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 33或其等效物。在又一進一步態樣中，所提供的是細胞，其包含下列者的一或多者：如在本文中所揭示之RNA、如在本文中所揭示之多核苷酸、或如在本文中所揭示之載體。在一個態樣中，所提供的是組成物，其包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：載劑(carrier)、視需要為醫藥上可接受之載劑及下列者之一或多者：如在本文中所揭示之RNA、如在本文中所揭示之多核苷酸、如在本文中所揭示之載體、或如在本文中所揭示之細胞。
另外，所提供的是製造如在本文中所揭示之DNA或RNA之方法。在一些實施態樣中，該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：在適合表現該DNA及/或RNA之條件下培養如在本文中所揭示之細胞。在其他實施態樣中，該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：在適合表現該RNA之條件下，將如在本文中所揭示之多核苷酸或載體與RNA聚合酶、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、鳥苷-5'-三磷酸(GTP)、及尿苷三磷酸(UTP)或經化學修飾之UTP (諸如N1-甲基假尿苷三磷酸)接觸。在進一步實施態樣中，如在本文中所揭示之方法進一步包含分離該DNA或該RNA。
在一個態樣中，所提供的是組成物，其包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：如在本文中所揭示之蛋白質、多肽、RNA或DNA及載劑，諸如醫藥上可接受之載劑。在一些實施態樣中，該醫藥上可接受之載劑包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：聚合奈米顆粒。在進一步實施態樣中，該聚合奈米顆粒包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：組胺酸-離胺酸共聚物(HKP)。在一些實施態樣中，該醫藥上可接受之載劑進一步包含脂質，視需要為下列者之一或多者：陽離子脂質(諸如Dlin-MC3-DMA，即MC3)、輔助者脂質(helper lipid)、膽固醇、或經PEG化之脂質。在一些實施態樣中，該醫藥上可接受之載劑包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施態樣中，該LNP包含下列者之一或多者：9-十七基 8-{(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一基氧基)己基]胺基}辛酸酯(SM-102)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧 (DLin-KC2-DMA)、二亞麻油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基) 9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七二酸酯(L319)、或其各等效物。在進一步實施態樣中，該LNP進一步包含下列者之一或多者：輔助者脂質、膽固醇、或經PEG化之脂質。進一步之醫藥上可接受之載劑可經加入該奈米顆粒組成物，例如磷酸鹽緩衝液及類似者。
在進一步實施態樣中，該醫藥上可接受之載劑進一步包含稀釋劑、佐劑、黏合劑、安定劑、緩衝液、鹽類、親脂性溶劑、或防腐劑。在一些實施態樣中，該奈米顆粒係自組裝奈米顆粒。在一進一步態樣中，所提供的是組成物，其包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：自組裝奈米顆粒，其包含如在本文中所揭示之RNA。在一些實施態樣中，該奈米顆粒包囊該RNA。在其他實施態樣中，該奈米顆粒係經便利地或非共價地連接至該RNA。
在一進一步實施態樣中，所提供的是製造該組成物之方法。在一些實施態樣中，該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：將如本文中所揭示之RNA與HKP接觸，從而使該RNA及該HKP係經自組裝成奈米顆粒。另外或替代地，該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：將如本文中所揭示之RNA與脂質接觸，從而使該RNA及該脂質係經自組裝成奈米顆粒。在進一步實施態樣中，該接觸步驟係在諸如NanoAssemblr Ignite之微流體混合器中進行。
在另一態樣中，所提供的是下列者之一或多者之方法：(a) 防止個體有症狀性SARS-CoV-2感染，(b) 在有需要之個體中誘發對SARS-CoV-2之免疫反應，(c) 在有需要之個體中減少SARS-CoV-2或其S蛋白與血管張力素轉化酶2 (ACE2)之結合，(d) 治療感染SARS-CoV-2之個體，或(e) 減少有需要之個體之SARS-CoV-2病毒負荷。該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：將下列者之一或多者投予該個體：如在本文中所揭示之RNA或DNA、如在本文中所揭示之多核苷酸、如在本文中所揭示之載體、或如在本文中所揭示之組成物。
在一個態樣中，所提供的是吸入系統，其包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：如在本文中所揭示之RNA或DNA、如在本文中所揭示之多核苷酸、如在本文中所揭示之載體、或如在本文中所揭示之組成物，及霧化器。
在另一態樣中，所提供的是製造嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之方法。該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：在適合表現該S蛋白或其致免疫性片段之條件下，培養如在本文中所揭示之細胞。在進一步實施態樣中，在本文中之方法進一步包含分離該S蛋白或其致免疫性片段。替代地或另外，該S蛋白或其致免疫性片段可藉由將包含該DNA及/或RNA之組成物投予個體來製造。
另外，所提供的是用於篩選減少或抑制SARS-CoV-2與其(視需要為在個體中或在該個體之細胞上或兩者)受體(諸如ACE2)結合之候選劑之方法。該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：從如在本文中所揭示之RNA表現棘(S)蛋白或其致免疫性片段，且在有或未有該候選劑存在或有不同濃度之該候選劑下，測量所表現之S蛋白或其致免疫性片段與諸如ACE2之該SARS-CoV-2受體之間之結合。在一些實施態樣中，相較於未有該候選劑，在有候選劑下，該所表現之S蛋白或其致免疫性片段與該SARS-CoV-2受體之間之結合減少，表明該候選劑減少或抑制SARS-CoV-2與其受體之結合。在一些實施態樣中，當增加該候選劑之濃度，所表現之S蛋白或其致免疫性片段與該SARS-CoV-2受體之間之結合降低，表明該候選劑減少或抑制SARS-CoV-2與其受體之結合。
在又一進一步態樣中，所提供的是篩選編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之RNA之方法。該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：將該RNA引入細胞，在適合表現該RNA之條件下培養該細胞，以及測量該細胞所分泌之IFN-α或IFN-β或兩者。在一些實施態樣中，該方法進一步包含：如果相較於編碼野生型S蛋白或其致免疫性片段之RNA，不分泌IFN-α或IFN-β或兩者都不分泌，或分泌的IFN-α或IFN-β或兩者較少，則選擇該RNA。
亦提供的是用於如本文中所述之方法之套組。在一些實施態樣中，該套組包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：使用說明及下列者之一或多者：如在本文中所揭示之RNA、如在本文中所揭示之多核苷酸、如在本文中所揭示之載體、如在本文中所揭示之組成物、或如在本文中所揭示之吸入系統。
[ 定義]
應當理解，本文使用的章節或小節標題僅用於組織目的，不應被解釋為限制及/或分離所描述的主題。
應當理解，本揭示不限於所描述的特定實施例，因此當然可以變化為限制性的，因為本揭示的範圍將僅由所附申請專利範圍限制。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與本揭示所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。或測試本揭示，現在描述優選的方法、裝置和材料，憑藉事先披露先於此類披露。
除非另有說明，否則本揭示的實踐將採用組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的常規技術，這些都在本領域的技術範圍內。參見例如Sambrook及Russell編輯，(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版；Ausubel等人編輯，(2007) Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology系列(Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson等人，(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人，(1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow及Lane編輯，(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique，第5版；Gait編輯，(1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利號4,683,195；Hames及Higgins編輯，(1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編輯，(1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos編輯，(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編輯，(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer及Walker編輯，(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg等人編輯，(1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))；Sohail (編輯) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)；及Plotkin等人，Plotkin's Human Vaccines，第7版(Elsevier)。
如在說明書和請求項中使用的，單數形式“a”、“an”和“the”包括複數引用，除非上下文另有明確規定。
如本文所用，術語“包含”旨在表示化合物、組成物和方法包括所列舉的元素，但不排除對組合具有任何重要意義的其他元素。因此，組成物基本上由如本文所定義的元素組成不會排除痕量污染物，例如，來自分離和純化方法和醫藥上可接受的載體、防腐劑等。意思是排除多於其他成分的痕量元素。由這些過渡術語中的每一個定義的實施方案都在本技術的範圍內。
所有數字名稱，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍，都是近似值，以1、5或10%的增量變化(+)或(-)，儘管並不總是明確說明所有數字名稱前面都有術語“關於”。
用語“大約”，如本文中所使用，當指涉諸如數量或濃度及類似者可測量值時，意在涵蓋指定數量的20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%的變化。
如本文所使用，比較用語，諸如高、低、增加、降低、減少、或其任何語法變化，可係指與參考物的某些變化。在一些實施態樣中，此變化可係指比參考物高約10%、或約20%、或約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90%、或約1倍、或約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約6倍、或約7倍、或約8倍、或約9倍、或約10倍、或約20倍、或約30倍、或約40倍、或約50倍、或約60倍、或約70倍、或約80倍、或約90倍、或約100倍或更多。在一些實施態樣中，此變化可係指參考物的約1%、或約2%、或約3%、或約4%、或約5%、或約6%、或約7%、或約8%、或約9%、或約10%、或約20%、或約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約75%、或約80%、或約85%、或約90%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%。
如本領域技術人員將理解的，出於任何和所有目的，本文揭示的所有範圍還包括任何和所有可能的子範圍及其子範圍的組合。
“可選的/視需要的(optional)”或“任選地/視需要地(optionally)”是指後面描述的情況可能發生也可能不發生，因此描述包括該情況發生的情況和不發生的情況。
如本文所用，“及/或”是指並涵蓋一個或多個相關所列項目的任何和所有可能組合，以及當以替代(“或”)解釋時缺少組合。
“實質上(Substantially)”或“基本上(essentially)”是指幾乎完全或完全，例如，某些給定數量的95%或更多。在一些實施態樣中，“實質上”或“基本上”是指95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%。
當用於描述本文揭示的任何成分、範圍、劑型等的選擇時，術語“可接受”、“有效”或“足夠”意指所述成分、範圍、劑型等適用於披露的目的。
在一些實施態樣中，組分名稱中的術語“第一” “第二” “第三” “第四”或類似術語用於區分和識別在其名稱中共享某些特徵的多於一個組分。例如，“第一RNA”及“第二RNA”用於區分兩個RNA。
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，也稱為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)或人類冠狀病毒2019(HCoV-19或hCoV-19)，是導致COVID-19(冠狀病毒病2019)的病毒，導致COVID-19大流行的呼吸道疾病。
每個SARS-CoV-2病毒顆粒的直徑為50-200奈米，包括一個線性、正義、單鏈RNA基因組(長約30,000個鹼基)和四種結構蛋白，稱為S(棘)、E(包膜)、M(膜)和N(核衣殼)蛋白。N蛋白持有RNA基因組，S、E和M蛋白共同構成病毒包膜。冠狀病毒S蛋白是糖蛋白，分為兩個功能部分(S1和S2)。在SARS-CoV-2中，棘蛋白是負責讓病毒附著在宿主細胞膜上並與之融合的蛋白質；具體來說，它的S1次單元催化附著，即S2次單元融合。表明SARS-Co-V2對人體細胞上的受體-血管緊張素轉換酶2(ACE2)具有足夠的親和力，可以將它們用作細胞進入的機制。由跨膜蛋白酶、絲胺酸2(TMPRSS2)引發的初始棘蛋白也被證明是進入細胞所必需的SARS-Co-V2。宿主蛋白神經纖毛蛋白1(NRP1)可能使用ACE2幫助病毒進入宿主細胞。當SARS-Co-V2病毒體附著到靶細胞後，細胞的TMPRSS2會切開病毒的棘蛋白，暴露出S2次單元中的融合肽，然後宿主受體ACE2。融合後，病毒體周圍形成核內體，將其與宿主細胞的其餘部分分開。當核內體的pH值下降或組織蛋白酶(一種宿主半胱胺酸蛋白酶)將其切割時，病毒體會逃逸，將RNA轉化為細胞並迫使細胞產生和傳播病毒的副本，從而感染更多的細胞。
SARS-CoV-2的遺傳變異在整個COVID-19大流行期間不斷出現並在世界範圍內傳播。B.1.1.7 (Alpha)、B.1.351 (Beta)、B.1.617.2 (Delta)和在美國流行的P.1 (Gamma)變種被歸類為關注變種。其他變種也存在，例如B.1.526(Iota)、B.1.427(Epsilon)、B.1.429 (Epsilon)、B.1.617(Kappa、Delta)、B.1.525(Eta)和P.2 (Zeta)。因此，本文使用的術語“SARS-CoV-2”可以指任何一種或多種或所有變異體。一些在實施方案中，本文使用的SARS-CoV-2是指首先在印度發現的delta變異體。在S蛋白的胺基酸突變之後：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R或D950N。以及包含ami的變異體K417N無酸突變。
感染SARS-CoV-2的個體可能會出現一系列臨床表現，從無症狀的無症狀SARS-CoV-2感染到有症狀的SARS-CoV-2感染並伴有危重症。可分為以下嚴重程度：疾病類別；但是，每個類別的標準可能會在臨床指南和臨床試驗中重疊或不同，並且患者的臨床狀態可能會隨著時間而改變。SARS-CoV-2感染當個體使用病毒學檢測SARS-CoV-2呈陽性但未表現出任何症狀( 例如，發燒、咳嗽、喉嚨痛、不適、頭痛、肌肉疼痛、噁心、嘔吐、腹瀉、味覺和嗅覺喪失)時發生與有症狀的SARS-CoV-2感染一致。根據美國國立衛生研究院的定義，當個體表現出與SARS-CoV-2感染相關的輕度、中度、重度或危重疾病時發生，但不限於發燒、咳嗽、喉嚨痛、不適、頭痛、肌肉疼痛、噁心、嘔吐、腹瀉、味覺和嗅覺喪失，但沒有呼吸急促、呼吸困難或胸部影像學異常。與SARS-CoV-2感染相關的疾病在臨床評估期間顯示下呼吸道疾病的證據或海平面室內空氣中的氧飽和度(SpO 2)≥94%。患有與SARS-CoV-2感染相關的嚴重疾病的個體在海平面室內空氣中的SpO 2＜94%，動脈血氧分壓與吸入氧分率(PaO 2/FiO 2) ＜300 mm Hg，呼吸頻率＞30次/分鐘，或肺浸潤＞50%。感染SARS-CoV-2的患者會出現呼吸衰竭、感染性休克及/或多器官功能障礙。
冠狀病毒感染的症狀包括但不限於輕微症狀，如疲勞、刺痛、手腳刺痛或麻木、頭暈、意識模糊、腦霧、全身酸痛、發冷、食慾不振、噁心、嘔吐、腹痛或不適、嗅覺喪失、味覺喪失、肌肉無力、畏光、淋巴結腫大、頭痛、咳嗽、乾咳、氣短、喉嚨痛、下肢無力/麻木、腹瀉、低血O 2、打噴嚏、流鼻涕或鼻後滴漏；嚴重症狀，如通氣使用、高燒、嚴重咳嗽、精神錯亂、癲癇發作、中風、全身炎症、細胞因數風暴；以及其他症狀，如發燒、腺樣體腫脹、肺炎、支氣管炎、和呼吸困難。
可以通過本領域已知的市售測試檢測冠狀病毒(例如SARS-COV-2)的病毒感染，例如可以使用聚合酶鏈反應(PCR)或免疫測定法。本文進一步包括使用本領域已知的測試。在一個實施態樣中，活動性病毒感染(active viral infection)是指持續感染，其中病毒正在複製並產生新病毒。這種活動性病毒感染可以使用聚合酶鏈反應(PCR)來檢測。適用於PCR的引子和探針的非限制性實例包括2019-nCoV CDC Probe and Primer Kit for SARS-CoV-2 (BioSearch Technologies，目錄號KIT-nCoV-PP1- 1000)、2019-nCoV Kit, 500 rxn (Integrated DNA Technologies (IDT)，目錄號10006606)及2019-nCoV Kit, 1000 rxn (Integrated DNA Technologies (IDT)，目錄號10006770)。亦參見www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html及www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/List-of-Acceptable-Commercial-Primers-Probes.pdf。進行此類測試的合適實驗操作程序可在以下網站找到：www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/ virus-requests.html、www.fda.gov/media/134922/download、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/ processing-sputum-specimens.pdf、 www.fda.gov/media/134922/download、 www.fda.gov/media/134919/download、 www.fda.gov/media/134922/download，最後訪問時間為2021年8月10日。在一些實施例態樣中，基於檢測抗體的COVID-19診斷分析與本文揭示者組合，諸如Lisboa Bastos M等人所討論者揭示(Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 2020 Jul 1;370:m2516. doi: 10.1136/bmj.m2516)。
其他市售測試包括但不限於下表中列出的那些。
SARS-CoV-2和COVID-19的市售測試
術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”可互換使用，並且在其最廣義上是指兩個或多個次單元胺基酸、胺基酸類似物或肽模擬物的化合物。)可以通過肽鍵連接。在實施方案中，次單元可以通過其他鍵連接，例如酯、醚等。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可包含蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數目沒有限制此處使用的術語“胺基酸”是指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸和D和L光學異構體、胺基酸類似物和擬肽。
如本文所用，術語“棘蛋白”、“棘糖蛋白”或“S蛋白”可互換使用，指的是從包膜病毒(如SARS-CoV-2)表面的脂質雙層突出的糖蛋白。在進一步的實施方案中，本文所用的S蛋白或其等效物還指S蛋白變異體(例如，天然存在的SARS-CoV-2變異體的S蛋白，例如delta變異體)、S蛋白突變體(例如，如本文揭示的突變的S蛋白)、S蛋白片段(例如致免疫性片段)或其任何組合(例如，用額外突變改造的天然存在的變異體或其片段)。
在一些實施態樣中，如本文中所使用的S蛋白包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：S1多肽或S2多肽或兩者。在一些實施態樣中，如本文中所使用的S蛋白是前驅蛋白，其包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：S1及S2兩者。此前驅體可藉由組織蛋白酶L(CTSL)、跨膜絲胺酸蛋白酶(TMPRSS2)或弗林蛋白酶加工成S1及S2，以產出成熟的S1及S2蛋白。在一些實施態樣中，如本文中所使用的S蛋白是蛋白質複體，其包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：成熟S1蛋白及成熟的S2蛋白。在其他實施態樣中，如本文中所使用的S蛋白係指S1蛋白。又在其他實施態樣中，如本文中所使用的S蛋白係指S2蛋白。在一些實施態樣中，前驅蛋白包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的多肽或其等效物。在一些實施態樣中，S1蛋白包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸(簡稱aa)13至胺基酸685之多肽或其等效物。在一些實施態樣中，S2蛋白包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸(簡稱aa)686至胺基酸1273之多肽或其等效物。在一些實施態樣中，S2蛋白包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸(簡稱aa)816至胺基酸1273之多肽或其等效物。S蛋白或其基因的進一步非限制性例示性序列可於下列者找到：Gene ID: 43740568 (檢索取自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/43740568，最後存取日2021年8月1日)、NCBI Reference Sequence: NC_045512.2 (檢索取自www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2/，最後存取日2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot: P0DTC2 (檢索取自www.uniprot.org/uniprot/P0DTC2，最後存取日2021年8月1日)，其以引用方式全部併入本文中。等效物等效物等效物。
在一些實施態樣中，S蛋白的片段(諸如致免疫性片段)包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：S蛋白的受體結合(RBD)。在一些實施態樣中，受體結合(RBD)係指來自病毒的短的致免疫性片段，它與特定的內源性受體序列結合以進入標靶細胞。在一些實施態樣中，RBD係指“棘”醣蛋白的一部分(S域)，它需要與內源性受體交互作用以促進膜融合及遞輸至胞質。在一些實施態樣中，如本文中所使用的RBD包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的aa 319至aa 541之多肽或其等效物。
如本文所用，術語“血管張力素轉化酶2 (angiotensin converting enzyme 2)”或“ACE2”是指附著細胞(視需要為位於腸、腎、睪丸、膽囊和心臟)的膜上的酶。ACE2充當某些冠狀病毒的細胞進入點，包括HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2。已知SARS-CoV-2棘蛋白本身會經由下調ACE2破壞上皮。在一些實施態樣中，用語“ACE2”係指人類ACE2。該蛋白或其基因的非限制性例示性序列可見於下列者：Gene Cards ID: GC0XM015494 (檢索取自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene= ACE2，最後存取日2021年8月1日)、HGNC: 13557 (檢索取自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/ 13557，最後存取日2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene: 59272(檢索取自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/59272，最後存取日2021年8月1日)、Ensembl: ENSG00000130234 (檢索取自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g= ENSG00000130234;r=X:15494566-15607236，最後存取日2021年8月1日)、OMIM®: 300335 (檢索取自omim.org/entry/300335，最後存取日2021年8月1日)、或UniProtKB/Swiss-Prot: Q9BYF1 (檢索取自www.uniprot. org/uniprot/Q9BYF1，最後存取日2021年8月1日)，其以引用方式全部併入本文中。
如本文所用，術語“跨膜絲胺酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2)”或“TMPRSS2”是指包含II型跨膜(結構)域、A類受體結構域、清道夫受體富含半胱胺酸結構域和蛋白酶結構域的蛋白質。該蛋白藉由蛋白酶截切和活化病毒套膜醣蛋白，促進病毒進入宿主細胞。被發現使用這種蛋白質進入細胞的病毒包括流感病毒和人類冠狀病毒HCoV-229E、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2。術語“TMPRSS2”是指人類TMPRSS2。該蛋白或其基因的非限制性例示性序列可見於下列者：Gene Cards ID GC21M041464 (檢索取自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMPRSS2，最後存取日2021年8月1日)、HGNC: 11876 (檢索取自www.genenames.org/ data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/11876，最後存取日2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene: 7113 (檢索取自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7113，最後存取日2021年8月1日)、Ensembl: ENSG00000184012 (檢索取自useast. ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000184012;r=21:41464300-41531116，最後存取日2021年8月1日)、OMIM®: 602060 (檢索取自omim.org/entry/602060，最後存取日2021年8月1日)、或UniProtKB/Swiss-Prot: O15393 (檢索取自www.uniprot.org/uniprot/O15393，最後存取日2021年8月1日)，其以引用方式全部併入本文中。
如本文所用，術語“組織蛋白酶L(Cathepsin L)”或“CTSL”是指一種蛋白質，它是肽酶C1家族的成員，以及由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成的二聚體，兩者均由單一蛋白質前驅體產生。此外，這種蛋白質切割SARS-CoV-2棘蛋白的S1次單元，其為病毒進入細胞所必需的。在一些實施態樣中，術語“CTSL”是指人類CTSL。該蛋白或其基因的非限制性例示性序列可見於下列者：Gene Cards ID GC09P087725 (檢索取自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CTSL，最後存取日2021年8月1日)、HGNC: 2537 (檢索取自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/2537，最後存取日2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene: 1514 (檢索取自www.ncbi.nlm. nih.gov/gene/1514，最後存取日2021年8月1日)、Ensembl: ENSG00000135047(檢索取自useast.ensembl.org/Homo_ sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000135047;r=9:87724051-87731469，最後存取日2021年8月1日)、OMIM®: 116880 (檢索取自omim.org/entry/116880，最後存取日2021年8月1日)、或UniProtKB/Swiss-Prot: P07711(檢索取自www. uniprot.org/uniprot/P07711，最後存取日2021年8月1日)，其以引用方式全部併入本文中。
如本文所用，術語“弗林蛋白酶(furin)”是指蛋白酶能夠在RX(K/R)R(SEQ ID NO：50，(RKR或RRR))共通基序上進行切割的酶。它還藉由在單鹼性S1/S2切割位點RRAR (SEQ ID NO: 48)蛋白水解棘蛋白，促進SARS-CoV-2的感染。這種切割對於棘蛋白介導的細胞-細胞融合和進入人類肺細胞至關重要。在一些實施態樣中，術語弗林蛋白酶指的是哺乳動物的弗林蛋白酶，如牛的弗林蛋白酶，例如參見UniProtKB Q28193，檢索取自www.uniprot. org/uniprot/Q28193，最後存取日為2021年8月10日。在一些實施態樣中，術語“弗林蛋白酶”指的是人類弗林蛋白酶。該蛋白或其基因的非限制性例示性序列可見於下列者：Gene Cards ID: GC15P090868 (檢索取自www. genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FURIN，最後存取日2021年8月1日)、HGNC: 8568 (檢索取自www. genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/8568，最後存取日2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene: 5045 (檢索取自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5045，最後存取日2021年8月1日)、Ensembl: ENSG00000140564(檢索取自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000140564;r=15:90868588-90883564，最後存取日2021年8月1日)、OMIM®: 136950 (檢索取自omim.org/ entry/136950，最後存取日2021年8月1日)、或UniProtKB/Swiss-Prot: P09958 (檢索取自www.uniprot.org/ uniprot/P09958，最後存取日2021年8月1日)，其以引用方式全部併入本文中。
在一些實施態樣中，蛋白質片段可以是致免疫性(免疫原性(immunogenic))片段。如本文所用，術語“致免疫性片段(immunogenic fragment)”是指這樣的多肽片段，其至少部分地保留其所來源的蛋白質的致免疫性。在一些實施態樣中，致免疫性片段至少約3個胺基酸(aa)長，或至少約4個胺基酸長，或至少約5個胺基酸長，或至少約6個胺基酸長，或至少約7個胺基酸長，或至少約8個胺基酸長，或至少約9個胺基酸長，或至少約10個胺基酸長，或至少約15個胺基酸長，或至少約20個胺基酸長，或至少約25個胺基酸長，或至少約30個胺基酸長，或至少約35個胺基酸長，或至少約40個胺基酸長，或至少約50個胺基酸長，或至少約60個胺基酸長，或至少約70個胺基酸長，或至少約80個胺基酸長，或至少約90個胺基酸長，或至少約100個胺基酸長，或至少約120個胺基酸長，或至少約150個胺基酸長，或至少約200個胺基酸長，或更長。在一些實施態樣中，S蛋白的致免疫性片段包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：S蛋白的RBD。
如本文所用，所關注/感興趣序列中的胺基酸(aa)或核苷酸(nt)殘基位置“對應於”參考序列中的鑑定位置，是指在感興趣的序列和參考序列之間的序列排列比對中，該殘基位置與鑑定的位置對齊。各種程式可用於執行此類序列比對，例如Clustal Omega和BLAST。在一個態樣中，可以使用BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi存取，最後存取日2021年8月1日)確定等效多核苷酸、蛋白質和相應序列。
如本文所用，胺基酸突變在本文中指稱為由整數分隔的兩個字母，例如T19R。第一個字母提供了要突變的原始胺基酸殘基的一個字母代碼；而最後一個字母提供了突變，如表示刪除的Δ，或突變的胺基酸殘基的一個字母代碼。，從N末端到C末端。在一些實施方案中，整數是突變胺基酸序列中突變胺基酸殘基的編號，任選地從SEQ ID NO: 1中對應於(例如對齊到)待突變的殘基或突變的殘基或兩者。在一些實施態樣中，整數是不含突變的胺基酸序列中待突變的胺基酸殘基的編號，視需要從N端到C端計數。在一些實施方案中，整數是突變胺基酸序列中的突變胺基酸殘基的編號，視需要從N端到C端計數。在一些實施方案中，整數是SEQ ID NO: 1中對應於(如排列比對)待突變殘基或突變殘基或兩者的胺基酸殘基的編號。
除非另有說明，否則在沒有明確敘述的情況下可以推斷，當本揭示涉及多肽、蛋白質、多核苷酸時，其等效物或生物學等效物在本揭示的範圍內。“其生物學等效物”是當提及參考蛋白質、多肽或核酸時，意在與“其等效物”同義，意指具有最小同源性(homology)同時仍保持所需結構或功能者。例如，等效物意指至少約70%的同源性或同一性(identity)，或至少80%的同源性或同一性，或者至少約85%的同源性或同一性，或者至少約90%的同源性或同一性，或者至少約95%的同源性或同一性，或者至少約96%的同源性或同一性，或者至少約97%的同源性或同一性，或者至少約98%的同源性或同一性，或者至少約99%的同源性或同一性(在一個態樣中，使用Clustal Omega比對程式來判定)並展現出與參考蛋白質、多肽或核酸實質等同的生物活性。或者，當提到多核苷酸時，其等效物是指在嚴苛條件下與參考多核苷酸或其互補序列雜交的多核苷酸。
參考多肽的等效物包含下列者、或基本上由下列者組成、或替代地由下列者組成：具有與參考多肽至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少約96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的胺基酸同一性的多肽(在一方面使用Clustal Omega比對程式確定)，或由在以下條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽對編碼參考多肽的多核苷酸的互補序列的高度嚴格條件，任選地高度嚴格條件包括約55℃至約68℃的溫育溫度；約1x SSC至約0.1x SSC的緩衝液濃度；約55%至約75%；以及約1x SSC、0.1x SSC或去離子水的洗滌溶液。
在一些實施例中，將第一序列(核酸序列或胺基酸)與第二序列進行比較，並且可以計算兩個序列之間的同一性百分比。第二序列在本文中可以稱為參考序列。序列的第二序列。
術語“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用並且指任何長度的核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構並且可以執行任何功能，以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段(例如，探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核醣體RNA、核酶，cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引子。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸結構可以是在多核苷酸組裝之前或之後給予。聚合後可進一步修飾多核苷酸，例如通過與標記組分綴合。該術語還指雙鏈和單鏈分子形式，以及已知或預測構成雙鏈形式的兩個互補單鏈形式中的每一個。
多核苷酸由四個核苷酸鹼基的特定序列組成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；當多核苷酸是RNA時，尿嘧啶(U)代表胸腺嘧啶。“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。這種字母表示可以輸入到具有中央處理單元的計算機中的數據庫中，並用於生物資訊學應用，例如功能基因組學和同源性搜索。
如本文所用的術語“RNA”是指其在本領域中普遍接受的含義。通常，術語RNA是指包含至少一個呋喃核糖苷部分的多核苷酸。該術語可包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA例如部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成的RNA、重組產生的 RNA，以及通過添加、缺失、取代及/或改變一個或多個核苷酸而不同於天然存在的RNA的改變的RNA。此類改變可以包括添加非核苷酸材料，例如在RNA的一個或多個核苷酸處。核酸分子中的核苷酸還可以包含非標準核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。稱為類似物或天然存在的RNA的類似物。在一些實施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。
“信使RNA”(mRNA)是指編碼一種(至少一種)多肽(一種天然存在的、非天然存在的或修飾的胺基酸聚合物)並且可以在體外轉譯產生編碼多肽的任何多核苷酸在一些實施方案中，本文揭示的mRNA包含或基本上由以下組成，或還進一步由至少一個編碼區、5'非轉譯區(UTR)、3'UTR、5'帽和poly-A組成尾巴。
疫苗接種是預防和控制疾病最成功的醫學方法。疫苗的成功開發和使用挽救了數千人的生命和大量資金。RNA疫苗的一個關鍵優勢是可以在實驗室中從DNA範本中生產RNA使用現成的材料，比傳統的疫苗生產更便宜、更快，這可能需要使用雞蛋或其他哺乳動物細胞。疾病，參見，例如，Maruggi 等人， Mol Ther .2019；27(4)：757-772。
臨床前和臨床試驗表明，mRNA疫苗在動物模型和人類中提供了安全和持久的免疫反應。針對傳染病的mRNA疫苗可被開發為預防或治療手段。表現傳染病原體抗原的mRNA疫苗已被證明可誘導有效的T細胞和體液免疫反應。參見例如Pardi等人，Nat Rev Drug Discov. 2018; 17:261–279。 與生產整個微生物、減毒活疫苗和次單位疫苗相比，產生mRNA疫苗的生產程序是無細胞、簡單和快速的。這種快速和簡單的生產過程使mRNA成為一種有前途的生物產品，有可能填補新出現的傳染病和對有效疫苗的迫切需求之間的空白。
如本文所用的關於核酸如DNA或RNA的術語“分離的”是指分別與大分子的天然來源中存在的其他DNA或RNA分離的分子。意指包括核酸片段，其是不是作為片段天然存在並且不會以自然狀態被發現。術語“分離的”在本文中也用於指多肽、蛋白質及/或與其他細胞蛋白質分離的宿主細胞。在其他實施例中，術語“分離的”“是指從成分、細胞和其他成分中分離出來，其中細胞、組織、多核苷酸、肽、多肽或蛋白質通常相關於例如，分離的細胞是從不同表型的組織或細胞中分離出來的細胞或基因型。寡核苷酸、肽、多肽或蛋白質，不需要“分離”來將其與天然存在的對應物區分開來。
在一些實施方案中，術語“工程化”或“重組”是指具有至少一種在參考物種的天然存在的蛋白質、多肽、修飾多核苷酸、菌株、野生型菌株或親本宿主菌株中通常不存在的。在實施方案中，術語“改造的”或“重組的”是指通過人為乾預合成，***到合適的表現載體中，該表現載體又用於轉化宿主細胞以產生異源蛋白質。
如本文所用，“互補”序列是指兩個核苷酸序列，當它們彼此反平行排列時，包含多個彼此配對的單獨核苷酸鹼基。核苷酸鹼基的配對形成氫鍵並因此穩定所形成的雙鏈結構由互補序列。不需要兩個序列中的每個核苷酸鹼基都相互配對才能將序列視為“互補”。例如，如果至少30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%的兩個序列中的核苷酸鹼基相互配對，序列可以被認為是互補的。在一些實施方案中，術語互補是指兩個序列中100%的核苷酸鹼基相互配對。此外，當兩個序列的總長度明顯不同時，序列仍然可以被認為是"互補"的。例如，15個核苷酸的引子，如果在引子與較長多核苷酸的特定區域反平行排列時，引子的多個單獨核苷酸鹼基與較長多核苷酸中的核苷酸鹼基配對，則可視為與含有數百個核苷酸的較長多核苷酸“互補”。核苷酸鹼基配對是本領域中已知的，例如在DNA中，嘌呤腺嘌呤(A)與嘧啶胸腺嘧啶(T)配對，嘧啶胞嘧啶(C)始終與嘌呤鳥嘌呤(G)配對；而在RNA中，腺嘌呤(A)與尿嘧啶(U)和鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對。此外，核苷酸鹼基在兩個互補序列中彼此反平行對齊，但不是一對，在本文中稱為錯配。
“基因”是指含有至少一個開放閱讀框(ORF)的多核苷酸，經轉錄和轉譯後能夠編碼特定的多肽或蛋白質。
術語“表現”是指產生基因產物，例如mRNA、肽、多肽或蛋白質。隨後被轉譯成肽、多肽或蛋白質。如果多核苷酸源自基因組DNA，則表現可包括剪接真核細胞中的mRNA。
“基因產物”或備選地“基因表現產物”是指當基因被轉錄和轉譯時產生的胺基酸(例如，肽或多肽)。在一些實施例中，基因產物可以指mRNA或其他RNA，例如干擾RNA，在基因轉錄時產生。
當應用於多核苷酸時，術語“編碼”是指如果在其天然狀態下或當通過本領域技術人員熟知的方法操作時，它可以被轉錄以產生多肽，則該多核苷酸被稱為“編碼”多肽多肽或其片段的mRNA，並任選地轉譯以產生多肽或其片段。反義鏈是此類核酸的互補鏈，並且可以從中推導出編碼序列。酸性序列編碼序列是指編碼胺基酸序列的核苷酸序列。
術語“化學修飾”和“化學修飾的”是指對腺苷(A)、鳥苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脫氧核苷的至少一種修飾位置、模式、百分比或群體。在一些實施方案中，該術語是指天然存在的5'-末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修飾。2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脫氮-偽尿苷、2-硫-1-甲基-偽尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫偽尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-偽尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-硫代-1-甲基假尿苷、4-硫代假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。已優化化學修飾核苷酸的離子以改善對疫苗製劑的免疫反應。在其他實施方案中，該術語不包括天然存在的5'-末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修飾。
在一些實施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，例如mRNA多核苷酸)包含非天然修飾的核苷酸，其在多核苷酸的合成期間或合成後被引入以獲得期望的功能或性質、連接、嘌呤或嘧啶鹼基，或可以通過化學合成或聚合酶在鏈的末端或鏈中的任何其他位置引入修飾。多核苷酸的任何區域都可以被化學修飾。
在一些實施態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高百分比的RNA殘基被本文揭示的一種或多種修飾來化學修飾。在一些實施態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%，至少約25%，至少約30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高百分比的RNA的尿苷殘基被本文揭示的一種或多種修飾來化學修飾。
在一些實施例中，本文揭示的RNA被優化。在一些實施例中，優化可用於匹配目標和宿主生物體中的密碼子頻率以確保正確折疊；偏置GC含量以增加mRNA穩定性或減少二級結構；最小化串聯重複可能損害基因構建或表現的密碼子或鹼基運行；定制轉錄和轉譯控制區；***或移除蛋白質運輸序列；移除/添加編碼蛋白質中的轉譯後修飾位點(例如糖基化位點)；添加、移除或改組蛋白質結構域；***或刪除限制性位點；修改核醣體結合位點和mRNA降解位點；調整轉譯速率以允許蛋白質的各個結構域正確折疊；
“3'非轉譯區”(3'UTR)是指mRNA的直接下游(即3')終止密碼子(即發出轉譯終止信號的mRNA轉錄物的密碼子)的區域，在一些實施方案中，如本文所用的3'UTR包含或基本上由SEQ ID NO: 18、22或24中的一個或多個組成，或進一步由其組成。
“5'非轉譯區”(5'UTR)是指直接位於起始密碼子(即由核醣體轉譯的mRNA轉錄物的第一個密碼子)上游(即5')的RNA區域，它不在一些實施方案中，本文所用的5'UTR包含或基本上由SEQ ID NO: 20或26組成，或還進一步由SEQ ID NO: 20或26之一或兩者組成。
“多腺苷酸尾巴”是mRNA的一個區域，它位於3'UTR的下游，例如直接下游(即3')，它包含多個連續的單磷酸腺苷。多腺苷酸尾巴可以包含10至300個單磷酸腺苷。或或者，在相關的生物環境中(例如，在細胞中，體內)，多腺苷酸尾巴起到保護mRNA免於酶促降解的作用，例如，在細胞質中，並有助於轉錄終止、mRNA從細胞核輸出和轉譯。在一些實施方案中，如本文所用的多聚腺苷酸尾包含，或基本上由以下組成，或還進一步由以下一項或多項組成：SEQ ID NO：27、28或30。
體外轉錄(IVT)方法允許範本指導合成幾乎任何序列的RNA分子。大量RNA轉錄物的合成(例如，從微克到毫克量)(貝克特 et al., Methods Mol Biol. 703:29-41 (2011)；Rio et al . RNA:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011, 205-220 ; Cell: A Molecular Approach. 4th ed. Washington DC: ASM Press, 2007, 262-299)。一般來說，IVT使用一個DNA範本，該範本具有目標序列上游的啟動子序列。例如T7、T3或SP6啟動子序列)，但許多其他啟動子序列可以可以耐受，包括那些從頭設計的。DNA範本的轉錄通常最好通過使用對應於特定噬菌體啟動子序列的RNA聚合酶來實現。包括但不限於T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶，IVT通常在dsDNA上啟動，但可以在單鏈上進行。
應當理解，可以使用任何合適的合成方法製備本文揭示的RNA。例如，在一些實施方案中，使用來自作為範本的單底鏈DNA的IVT和作為啟動子的互補寡核苷酸來製備RNA。單底鏈DNA可以作為RNA體外轉錄的DNA範本，可以從例如質體、PCR產物或化學合成中獲得。單底鏈DNA範本通常包括啟動子序列，例如，噬菌體啟動子序列，以促進IVT。使用單底鏈DNA和頂鏈啟動子互補寡核苷酸製備RNA的方法是本領域已知的。示例性方法包括但不限於，將DNA底鏈範本與頂鏈啟動子互補寡核苷酸(例如，T7啟動子互補寡核苷酸leotide、T3啟動子互補寡核苷酸或SP6啟動子互補寡核苷酸)，然後使用對應於啟動子序列的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或 SP6 RNA聚合酶)進行IVT。
還可以使用雙鏈DNA範本執行IVT方法。一些實施例中，將包含啟動子序列和編碼一個或多個目標表位的序列的單底鏈DNA範本與頂鏈啟動子互補寡核苷酸退火併進行PCR-延伸頂鏈以產生雙鏈DNA範本的類似過程。備選地或另外地，包含與底鏈啟動子序列互補且與編碼一個或多個感興趣的表位的序列互補的序列的頂鏈DNA被退火以底部鏈啟動子寡核苷酸並經過類似PCR的過程以延伸底部鏈以生成雙鏈DNA範本。類似PCR的循環範圍為1至20個循環，例如3至10個循環。在一些實施方案中，雙鏈DNA範本全部或部分通過化學合成方法合成。如本文所述的體外轉錄。
“在轉錄控制下”，在本文中也用作“指導表現”或其任何語法變體，是本領域熟知的術語，表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的轉錄和任選的轉譯取決於它與有助於啟動或促進轉錄的元件有效連接。
“可操作地連接”意指多核苷酸以允許它們在細胞中起作用的方式排列。
如本文所用，術語“調節序列”、“表現控制元件”或“啟動子”意指可操作地連接至待轉錄或複制的靶多核苷酸並促進靶多核苷酸的表現或複制的多核苷酸。
啟動子是表現控制元件或調節序列的一個例子。啟動子可以位於基因或其他多核苷酸的5'或上游，其為調節的基因轉錄提供控制點。對應於RNA聚合酶。在進一步的實施方案中，如本文所用的啟動子包含，或基本上由，或還進一步由T7啟動子，或SP6啟動子，或T3啟動子組成。合適的啟動子的非限制性實例在WO2001009377A1中提供。
“聚合酶”是指產生與預先存在的範本多核苷酸(DNA或RNA)互補的多核糖核苷酸序列的酶。SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。合適的聚合酶的非限制性實例進一步詳述於US10526629B2。
在一些實施方案中，術語“載體”意指重組載體，其保留感染和轉導非***及/或緩慢***細胞的能力並任選地整合到靶細胞的基因組中。載體的非限制性實例包括質體，奈米顆粒、脂質體、病毒、黏質體、噬菌體、BAC、YAC等。在一些實施方案中，質體載體可由市售載體製備。在其他實施方案中，病毒載體可由桿狀病毒、反轉錄病毒產生、腺病毒、AAVs等根據本領域已知的技術。一個實施方案中，載體是奈米顆粒，任選地是聚合物奈米顆粒或脂質奈米顆粒。
包含啟動子和多核苷酸可操作連接到其中的選殖位點的載體是本領域眾所周知的。此類載體能夠在體外或體內轉錄RNA，並且可從諸如Stratagene (La Jolla)的來源商購獲得，Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)。額外的、可能不合適的替代轉譯起始密碼子或其他可能在轉錄或轉譯水準上干擾或減少表現的序列。或者，共有核醣體結合位點可以是立即***起始密碼子的5'以增強表現。
“質體”是一種與染色體DNA分開的染色體外DNA分子，能夠獨立於染色體DNA進行複制。在許多情況下，它是環狀和雙鏈的。質體提供了一種在種群內進行水準基因轉移的機制微生物，通常在給定的環境狀態下提供選擇優勢。質體可能攜帶基因，在競爭環境中提供對天然存在的抗生素的抗性，或者所產生的蛋白質可能在類似情況下充當毒素。許多質體可商購用於此類用途。將要複製的基因***質體的副本中，該質體包含使細胞對特定抗生素產生抗性的基因和多選殖位點(MCS，或多連接子(polylinker))，這是一個包含幾個常用限制性位點的短區域，可以輕鬆實現在這個位置***DNA片段。質體的另一個主要用途是製造大量的蛋白質。在這種情況下，研究人員培養含有攜帶感興趣基因的質體的細菌。正如細菌產生蛋白質以賦予其抗生素抗性一樣，它也可以被誘導從***的基因中產生大量蛋白質。這是廉價而簡單的大量生產基因或它隨後編碼的蛋白質的方法。
“病毒載體”被定義為重組產生的病毒或病毒顆粒，其包含要在體內、離體或體外遞送到宿主細胞中的多核苷酸。如本領域技術人員所知，有DNA病毒構成I類和II類。RNA病毒和反轉錄病毒構成其餘類。III類病毒具有雙鏈RNA基因組。IV類病毒具有正單鏈RNA基因組，基因組本身充當mRNA類V類病毒有一個負鏈RNA基因組，用作mRNA合成的範本。RNA的形式；然而，一旦病毒感染細胞，RNA就會反轉錄成DNA形式，並整合到受感染細胞的基因組DNA中。病毒載體的實例包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、甲病毒載體等。還開發了甲病毒載體(alphavirus vector)，例如基於Semliki Forest病毒的載體和基於Sindbis病毒的載體，參見，Schlesinger 和Dubensky (1999) Curr . Opin . Biotechnol . 5:434-439和Ying, et al. (1999) Nat. Med. 本文使用的感染複數(MOI)是指每次添加的病毒顆粒數感染期間的細胞。
反轉錄病毒如伽馬反轉錄病毒及/或慢病毒包含(a)包含脂質和糖蛋白的包膜，(b)載體基因組，它是RNA(通常是二聚體RNA，包含5'端的帽和多腺苷酸尾巴在3'端側接LTR)衍生至靶細胞，(c)衣殼，和(d)蛋白質，例如蛋白酶。美國專利號6,924,123揭示了某些反轉錄病毒序列促進整合到靶細胞基因組中。該專利教示每個反轉錄病毒基因組包含稱為gag、pol和env的基因，它們編碼病毒蛋白和酶。這些基因的兩端兩側是稱為長末端重複序列(LTR)的區域。LTR負責前病毒整合和轉錄。它們還充當增強子-啟動子序列。換句話說，LTR可以控制病毒基因的表現。反轉錄病毒RNA的衣殼化是通過位元於病毒基因組5'末端的psi序列發生的。是i可分為三個元素的相同序列，分別稱為U3、R和U5。U3來源於RNA 3'端特有的序列。R來源於RNA兩端重複的序列，和U5來源於RNA 5'端獨有的序列。三種元素的大小在不同的反轉錄病毒之間可以有很大差異。對於病毒基因組。多(A)添加(終止)的位點在邊界處在右側LTR中的R和U5之間。U3包含原病毒的大部分轉錄控制元件，其中包括啟動子和多個增強子序列，這些序列對細胞和在某些情況下對病毒轉錄啟動蛋白有反應。
關於gag、pol、env本身的結構基因，gag編碼病毒的內部結構蛋白，gag蛋白經蛋白水解加工成成熟蛋白MA(matrix)、CA(capsid)和NC(nucleocapsid)，編碼反向轉錄酶(RT)，其中包含DNA聚合酶、相關的RNase H和整合酶(IN)，後者介導基因組的複制。
為了生產病毒載體顆粒，載體RNA基因組由編碼它的DNA構建體在宿主細胞中表現。“系統”通常包括在宿主細胞中表現的gag/pol和env基因之一或兩者。可以整合到宿主細胞基因組中，或者它們可以以多種方式的混合提供。
本文使用的術語“腺相關病毒”或“AAV”是指與該名稱相關的病毒類別的成員，屬於細小病毒科依賴細小病毒屬。已知該病毒的多種血清型適用於基因遞送；所有已知的血清型都可以感染來自各種組織類型的細胞。至少有11種按順序編號的AAV血清型是本領域已知的。可用於本文揭示的方法的非限制性示例性血清型包括11種血清型中的任何一種，例如AAV2、AAV8、AAV9或變異體或合成血清型，例如AAV-DJ和AAVPHP.B。AAV顆粒包含，或者基本上由，或進一步由三種主要病毒蛋白組成：VP1、VP2和VP3。AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVPHP.B或AAVrh74的專利或技術文獻。
基因遞送載體還包括 DNA/脂質體複合物、膠束和靶向病毒蛋白-DNA 複合物。還包含靶向抗體或其片段的脂質體可用於本文揭示的方法中。將本文所述的蛋白質直接引入細胞或細胞群可以通過蛋白質轉染的非限制性技術來完成，或者可以增強本文揭示的蛋白質的表現及/或促進其活性的培養條件是其他非限制性技術。
如本文所用，術語“調控序列”、“表現控制元件”或“啟動子”意指可操作地連接至待轉錄及/或複制的靶多核苷酸的多核苷酸，並促進表現及/或複制啟動子是表現控制元件或調節序列的實例。啟動子可位於基因或其他多核苷酸的5'或上游，其為調節的基因轉錄提供控制點。聚合酶II和III是啟動子的實例。
聚合酶II或“polII”啟動子催化DNA的轉錄以合成mRNA和大多數shRNA和微RNA的前體。polII啟動子的實例是本領域已知的並且包括但不限於磷酸甘油酸激酶(“PGK”)啟動子EF1-alpha；CMV(最小巨細胞病毒啟動子)；以及來自反轉錄病毒和慢病毒載體的LTR。
增強子是增加靶序列表現的調節元件。“啟動子/增強子”是包含能夠提供啟動子和增強子功能的序列的多核苷酸。功能。增強子/啟動子可以是“內源的”或“外源的”或“異源”。/啟動子是通過遺傳操作(即分子生物學技術)與基因並列放置的啟動子，使得該基因的轉錄由連接的增強子/啟動子指導。
“雜交”是指一個或多個多核苷酸反應形成複合物的反應，該複合物通過核苷酸殘基鹼基之間的氫鍵結合而穩定。該複合物可包含形成雙鏈結構的兩條鏈、形成多鏈結構的三條或更多條鏈-雜交反應可能構成更廣泛過程中的一個步驟，例如PCR反應的啟動，或核酶對多核苷酸的酶促切割。
雜交反應可以在不同“嚴緊度”的條件下進行。一般來說，低嚴緊度的雜交反應是在40℃左右的10x SSC或同等離子強度/溫度的溶液中進行。在50℃左右的6x SSC，並且高嚴格雜交反應通常在約60℃下在1 x SSC中進行。生理條件的非限制性示例是細胞中通常存在的溫度、離子強度、pH和Mg 2+濃度。
嚴格雜交條件的實例包括：約25℃至約37℃的溫育溫度；約6x SSC至約10x SSC的雜交緩衝液濃度；約0%至約25%的甲醯胺濃度；以及來自約4x SSC的洗滌溶液適度雜交條件的實例包括：約40℃至約50℃的溫育溫度；約9x SSC至約2x SSC的緩衝液濃度；約30%至約50%的甲醯胺濃度；約5x SSC至約2x SSC。高嚴格條件的實例包括：約55℃至約68℃的溫育溫度；約1x SSC至約0.1x SSC的緩衝液濃度；以及約1x SSC、0.1x SSC的洗滌溶液，通常，雜交孵育時間為5分鐘至24小時，洗滌步驟為1、2或更多，洗滌孵育時間約為1、2或15分鐘。0.15 M NaCl和15 mM檸檬酸鹽緩衝液。據瞭解，可以使用使用其他緩衝系統的SSC等價物。
當雜交以兩個單鏈多核苷酸之間的反平行構型發生時，該反應稱為“退火(annealing)”，這些多核苷酸被描述為“互補”。如果可以發生雜交，則雙鏈多核苷酸可以與另一個多核苷酸“互補”或“同源”在第一個多核苷酸和第二個多核苷酸的一條鏈之間。“互補性”或“同源性”(一個多核苷酸與另一個多核苷酸互補的程度)可以根據預期形成氫鍵的相對鏈中鹼基的比例來量化根據普遍接受的鹼基‑配對規則相互結合。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可以通過比較每個序列中的一個位置來確定，該位置可以為了比較的目的而對齊。被比較的序列被佔據相同的鹼基或胺基酸，則分子在該位置是同源的。序列之間的同源性程度是序列共用的匹配或同源位置數量的函數。“同源”序列共用小於40%的同一性，或或者，與本揭示的序列之一具有小於25%的同一性。在一些實施方案中，同一性是在兩個肽或多核苷酸之間在其全長上，或在兩者的較短序列上，或在較長序列上計算的兩者中的。
多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)具有一定百分比(例如，70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”與另一個序列意味著，當比對時，鹼基(或胺基酸)的百分比在比較兩個序列時是相同的。這種比對和百分比同源性或序列同一性可以使用本領域已知的軟件程式來確定，例如，(2007) Current Protocols in Molecular Biology。優選地，默認參數用於比對。一個比對程式是BLAST，使用默認參數。參數：遺傳密碼=標準；過濾器=無；鏈=兩者；截止=60；期望=10；PDB+GenBankCDS轉譯+SwissProtein+ SPupdate+PIR。這些程式的詳細資訊可在以下網址找到：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ，最後訪問時間為2021年8月1日。
在一些實施方案中，本文揭示的多核苷酸是RNA或其類似物，或其類似物。
在一些實施方案中，參考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物編碼由參考、參考或反向互補參考編碼的相同序列，任選地在高度嚴格的條件下。
另外或備選地，等同的核酸、多核苷酸或寡核苷酸是具有至少70%的序列同一性，或至少75%的序列同一性，或至少80%的序列同一性，或備選地至少85%的序列同一性，或備選地在至少90%的序列同一性，或者至少92%的序列同一性，或者至少95%的序列同一性，或者至少97%的序列同一性，或者至少98%的序列，或者至少99%的序列同一性與參考核酸、多核苷酸或寡核苷酸雜交的雜交，或者替代地，等價核酸在高嚴格條件下與參考多核苷酸或其互補物雜交，可以通過本文所述的一種或多種測定來鑑定。tide將編碼與參考或親本多核苷酸具有相同或相似功能的蛋白質或多肽。
術語“轉導”或“轉導”是指將外來核苷酸序列引入細胞的過程。在一些實施方案中，這種轉導是通過病毒或非病毒載體完成的。
“可檢測標記(Detectable label)”、“標記(label)”、“可偵測標記物(detectable marker)”或“標記物(marker)”可互換使用，包括但不限於放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料和蛋白質，包括酶。可檢測標籤也可以連接到本文所述的多核苷酸、多肽、蛋白質或組成物。
如本文所用，術語“標記”或可檢測標記意指直接或間接可檢測的化合物或組成物，其直接或間接綴合至待檢測的組成物，例如，N-末端組胺酸標籤(N-His)，磁性活性同位素，例如 115Sn、 117Sn和 119Sn，非放射性同位素，例如 13C和 15N，多核苷酸或蛋白質，例如抗體，以產生“標記的”組成物。將提供信號的多核苷酸表現***的序列，如綠色螢光蛋白(GFP)等。標記可以催化可檢測的底物化合物或組成物的化學變化。標記可適用於小規模檢測或更適用於高-輸送量篩選。d對磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料和蛋白質，包括酶。標記可以簡單地檢測到，也可以量化。簡單檢測到的響應通常包括以下響應：僅確認存在，而量化的響應通常包括具有可量化(例如，數字可報告)值的響應，例如強度、偏振或其他性質。或間接使用與另一種(例如，報導分子或指示劑)組分相關聯的發光團或螢光團。產生信號的發光標記的示例包括但不限於生物發光和化學發光。可檢測的發光響應通常包括oc的變化或oc用於發光標記化驗組分的合適的方法和發光體是本領域已知的並且例如描述於Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)。發光探針的例子包括但不限於、水母發光蛋白和螢光素酶。
如本文所用，術語“免疫偶聯物”包括與第二試劑締合或連接的抗體或抗體衍生物，例如細胞毒劑、可檢測試劑、放射性試劑、靶向劑、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、合成抗體、半合成抗體或多特異性抗體。
合適的螢光標記的例子包括但不限於螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、茋、螢光黃、Cascade Blue™和德克薩斯紅。描述了染料在 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第6版)中。
在一些實施方案中，螢光標記被功能化以促進與存在於細胞或組織表面中或表面上的細胞組分的共價連接，例如細胞表面標記、胺基、鹵代乙醯基、馬來醯亞胺、琥珀醯亞胺酯和磺醯鹵，所有這些都可用於將螢光標記連接到第二個分子。螢光標記的官能團的選擇將取決於連接到接頭、試劑、標記或第二標記試劑的位點。
如本文所用，純化標籤或標記物是指可用於純化與該標籤綴合的分子或組分的標籤，例如表位標籤(包括但不限於Myc標籤、人流感血凝素(HA)標籤、FLAG標籤)、親和標籤(包括但不限於穀胱甘肽-S轉移酶(GST)、聚組胺酸(His)標籤、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)或麥芽糖結合蛋白(MBP))，或螢光標籤。
“選擇標記”是指蛋白質或編碼在選擇性培養方案中生長的細胞存活或生長所必需的蛋白質的基因。典型的選擇標記包括編碼蛋白質的序列，其賦予對選擇劑例如抗生素的抗性，選擇標記的例子包括賦予抗生素抗性的基因，例如壯觀黴素、鏈黴素、四環素、胺芐青黴素、卡那黴素、G418、新黴素、博來黴素、潮黴素、甲胺蝶呤、麥草畏、草銨膦或草甘膦。
術語“培養”是指細胞或生物體在各種類型的培養基上或中的體外或離體繁殖(或表型)到親本細胞。
在一些實施方案中，本文揭示的細胞是真核細胞或原核細胞、293細胞或293細胞、293T細胞或a549細胞。
“宿主細胞”不僅指特定的主題細胞，而且指這種細胞的子代或潛在子代。親代細胞，但仍包括在本文所用術語的範圍內。細胞(HEK 293細胞或293細胞)、293T細胞或a549細胞。
“真核細胞”包括除單核細胞外的所有生命界。它們可以通過膜-結合核輕鬆區分。動物、植物、真菌和原生生物是真核生物或生物體，其細胞通過內膜和細胞骨架組織成複雜的結構。最具特徵的膜結合結構是細胞核。除非特別說明，否則術語“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。真核細胞或宿主的非-限制性實例包括猿猴、犬科動物、牛、豬、鼠、大鼠、鳥類、爬行動物和人類。
“原核細胞”通常缺乏細胞核或任何其他膜-結合細胞器，分為細菌和古細菌兩個域。此外，這些細胞的遺傳資訊不是染色體DNA，而是位於稱為質體的環狀結構中。細菌細胞非常小，大致相當於動物線粒體的大小(直徑約12微米，長約10微米)。原核細胞具有三種主要形狀：桿狀、球形和螺旋形。細菌細胞不像真核生物那樣經歷複雜的複製過程，而是***通過二元裂變。例子包括但不限於 芽孢桿菌、 大腸桿菌和 沙門氏菌。
“組成物”旨在表示活性劑和另一種化合物或組成物的組合，惰性(例如，可檢測試劑或標記)或活性的，例如佐劑、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等，並包括醫藥上可接受的載體。
載體還包括藥物賦形劑和添加劑蛋白質、肽、胺基酸、脂質和碳水化合物(例如，糖，包括單醣、二、三、四寡糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖和和多醣或糖聚合物)，它們可以單獨或組合存在，單獨或組合佔重量或體積的1-99.99%。示例性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重組人白蛋白(rHA)) 明膠、酪蛋白等。也可以起到緩衝作用的代表性胺基酸成分包括丙胺酸、精胺酸、甘胺酸、精胺酸、甜菜鹼、組胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、離胺酸、亮白酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、***酸、阿斯巴甜等。碳水化合物賦形劑也在本技術範圍內，其例子包括但不限於單醣，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；雙醣，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；葡聚醣、澱粉等；和糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
如本文所揭示的組成物可以是醫藥組成物。“醫藥組成物”旨在包括活性劑與惰性或活性載體的組合，使得該組成物適用於體外、體內或體外的診斷或治療用途體內。
“醫藥上可接受的載體”是指可用於本文揭示的組成物的任何稀釋劑、賦形劑或載體。醫藥上可接受的載體包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、緩衝物質、例如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態二氧化矽、鎂三矽酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。合適的藥物載體描述於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，標準參考文本在這個領域裡。關於預期的給藥形式，即口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿劑等，與常規藥學實踐一致。
如本文所用，術語“賦形劑”是指與藥物的活性成分一起配製的天然或合成物質，包括用於長期穩定、增加固體製劑或賦予活性成分治療增強的目的。在最終劑型中，例如促進藥物吸收、降低黏度或提高溶解度。
根據本揭示使用的組成物可以以劑量單位形式包裝，以便於給藥和劑量均勻性，計算出預定量的組成物以產生與其給藥相關的所需反應，即適當的途徑和方案。組成物的量也取決於從業者的判斷並且因人而異。影響劑量的因素包括個體的身體和臨床狀態、給藥途徑、治療的預期目標(緩解症狀與治癒)和效力，特定組成物的穩定性和毒性。劑型和治療或預防有效的量。
單位劑量、劑量或方案可以根據給定多核苷酸、載體、細胞、組成物或套組的IC50來確定，用於中和SARS-CoV-2多肽或多核苷酸，優選SARS-CoV-2棘的活性“IC50”是指50%抑制所需的多核苷酸、載體、細胞、組成物或套組的濃度。或者，有效量可由給定多核苷酸、載體、細胞、組成物或套組的EC50確定。“EC50”是指在體內獲得50%最大中和作用所需的血漿濃度。
如本文所用的組合意指組成物的單獨活性成分被單獨配製以組合使用，並且可以單獨包裝有或沒有特定劑量。
四分支組胺酸-離胺酸(HK)肽聚合物H2K4b 已被證明是大分子量DNA質體的良好載體(Leng 等人， Nucleic Acids Res2005； 33：e40.)，但相對低分子量siRNA的載體較差(Leng 等人， J Gene Med2005； 7：977-986.)。H2K4b的兩種富含組胺酸的肽類似物，即H3K4b 和H3K(+H)4b，被證明是siRNA的有效載體(Leng 等人，J Gene Med 2005; 7: 977-986；Chou等人，Biomaterials 2014; 35:846-855)，即使H3K(+H)4b似乎略微更有效(Leng等人，Mol Ther 2012; 20:2282-2290)。合適的HK多肽描述於WO/2001/047496、WO/2003/090719和WO/2006/060182中，各內容均以引用方式全部併入本文中。這些多肽具有離胺酸骨架(三個離胺酸殘基)，其中離胺酸側鏈ε-胺基和N-末端與各種HK序列偶聯。HK多肽載體可以通過本領域公知的方法合成，包括例如固相合成。
發現這種組胺酸-離胺酸肽聚合物(“HK聚合物”或“HKP”)作為mRNA載體出人意料地有效，並且它們可以單獨使用或與脂質體結合使用，以將mRNA有效遞送到靶細胞中。與PEI和其他載體類似，初步結果表明HK聚合物在攜帶和釋放核酸的能力上有所不同。然而，由於HK聚合物可以在肽合成儀上重複製造，它們的胺基酸序列可以很容易地改變，從而允許精細控制RNA的結合和釋放，以及含有HK聚合物和RNA的複合物的穩定性(Chou et al. Biomaterials2014; 35:846-855. Midoux 等人 Bioconjug Chem1999； 10：406-411。Henig 等人。美國化學學會雜誌1999； 121：5123-5126.)。
如本文所述，HK聚合物包含四個連接到三個離胺酸胺基酸核心的短肽分支。肽分支由不同構型的組胺酸和離胺酸胺基酸組成。聚合物)如式I所示，其中R代表肽分支和K是胺基酸L-離胺酸。
在式I中，其中K是L-離胺酸並且R 1、R 2、R 3和R 4中的每一個獨立地是組胺酸-離胺酸肽。R 1-4支鏈在本發明的HK聚合物中可以相同或不同當R分支是“不同的”時，該分支的胺基酸序列不同於聚合物中每個其他R分支。用於式I所示的本發明的HK聚合物的合適的R分支包括但不限於，以下R分支R A-R -J：
R A=KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK- (SEQ ID NO:38)
R B=KHHHKHHHKHHHKHHHK- (SEQ ID NO:39)
R C=KHHHKHHHKHHHHKHHHK- (SEQ ID NO:40)
R D=kHHHkHHHkHHHHkHHHk- (SEQ ID NO:41)
R E=HKHHHKHHHKHHHHKHHHK- (SEQ ID NO:42)
R F=HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK- (SEQ ID NO:43)
R G=KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK- (SEQ ID NO:44)
R H=KHHHKHHHKHHHKHHHHK- (SEQ ID NO:45)
R I=KHHHKHHHHKHHHKHHHK- (SEQ ID NO:46)
R J=KHHHKHHHHKHHHKHHHHK- (SEQ ID NO:47)
可用於mRNA組成物的特定HK聚合物包括但不限於其中R 1、R 2、R 3和R 4中的每一個相同且選自R A-R J的HK聚合物( 表 1)這些HK聚合物稱為H2K4b、H3K4b、H3K(+H)4b、H3k(+H)4b、H-H3K(+H)4b、HH-H3K (+H)4b、H4K4b、H3K(1+H)4b、H3K(3+H)4b和H3K (1,3+H)4b。與H3K4b相比，額外的組胺酸殘基在分支序列中標有下劃線。HK聚合物的命名如下： 1)對於H3K4b，分支中的優勢重複序列是-HHHK-(SEQ ID NO：49)，因此“H3K”是名稱的一部分；“4b”是指分支數； 2) H3K4b及其類似物的每個分支中有四個-HHHK-(SEQ ID NO：49)基序；第一個-HHHK-基序(SEQ ID NO：49)(“1”)最接近離胺酸核心； 3) H3K(+H)4b是H3K4b的類似物，其中在H3K4b 的第二個-HHHK-基序(SEQ ID NO：49)(基序2)中***了一個額外的組胺酸； 4) 對於H3K(1+H)4b和H3K(3+H)4b肽，在第一個(基序1)和第三個(基序3)基序中分別有一個額外的組胺酸； 5) 對於H3K(1,3+H)4b，在分支的第一個和第三個基序中都有兩個額外的組胺酸。
可以進行本領域公知的方法，包括凝膠阻滯測定、肝素置換測定和流式細胞術，以評估包含HK聚合物加脂質體的不同製劑在成功遞送mRNA中的性能。合適的方法描述於例如Gujrati 等人， Mol. Pharmaceutics11:2734-2744(2014)，和Pärnaste 等人， Mol Ther Nucleic Acids. 7: 1-10 (2017)。
也可以使用SMARTFLARE®技術(Millipore Sigma)檢測mRNA攝取到細胞中。這些智能光斑是附有序列的珠子，當識別細胞中的RNA序列時，會產生螢光增強，可以用螢光顯微鏡
其他方法包括測量mRNA的蛋白質表現，例如，編碼螢光素酶的mRNA可用於測量轉染效率。參見，例如，He 等人( J Gene Med. 2021 Feb;23(2):e3295)證明使用螢光素酶模型HKP和脂質體製劑遞送mRNA的功效。
在如上所述的螢光素酶模型中，H3K(+H)4b 和DOTAP(一種陽離子脂質)的組合在將mRNA攜帶到MDA-MB-231細胞(H3K(+H)4b/脂質體與脂質體，P＜0.0001)。作為mRNA載體的組合比單獨的聚合物和陽離子脂質載體分別高約3倍和8倍。並非所有HK肽都表現出與DOTAP脂質的協同活性。除了DOTAP，其他可與HK肽一起使用的陽離子脂質包括Lipofectin(ThermoFisher)、Lipofectamine (ThermoFisher)和DOSPER。
在上述螢光素酶模型中，H3k (+H)4b的D-異構體(其中分支中的L-離胺酸被D-離胺酸取代)是最有效的聚合物載體(H3k(+H)4b與H3K(+H)4b，P＜0.05)。mRNA的D-異構體/脂質體載體分別比單獨的H3k(+H)4b和脂質體載體有效近4倍和10倍。D-H3k (+H)4b/脂質組合比L-H3K (+H)4b/脂質結合更有效，這種比較沒有統計學差異。
體外核酸的載體參見，例如，Leng et al. J Gene Med2005; 7: 977-986; and Chou et al., Cancer Gene Ther2011; 18: 707-716.儘管有這些先前的發現，H3K(+H)4b作為mRNA的載體明顯更好與螢光素酶模型中的其他類似類似物相比( 表 2)。
重量：重量(HK：mRNA)比率下，它具有比H3K4b更高的mRNA轉染效率。在4：1的比率下，H3K (+H)4b的螢光素酶表現比MDA-MB-中的H3K4b高10倍231細胞沒有顯著的細胞毒性。此外，緩衝能力似乎並不是它們轉染差異的重要因素，因為H3K4b和H3K(+H)4b中的組胺酸百分比(按重量計)分別為68.9%和70.6%。
凝膠阻滯測定表明mRNA的電泳遷移率被HK聚合物延遲。阻滯效應隨著肽與mRNA重量比的增加而增加。然而，mRNA在H3K(+H)4b的比例為2:1時完全阻滯，而它並沒有完全被H3K4b阻滯。這表明H3K(+H)4b可以形成更穩定的複合物，這有利於其成為mRNA遞送的合適載體。
通過肝素置換試驗進一步證實H3K(+H)4b肽與mRNA的結合更緊密。將不同濃度的肝素添加到與mRNA和HK形成的複合物中，觀察到，特別是在較低濃度下對於肝素，H3K4b聚合物比H3K(+H)4b聚合物更容易釋放mRNA。這些數據表明H3K(+H)4b可以與mRNA結合併形成比H3K4b更穩定的複合物。
用花青-5標記的螢光素酶mRNA，使用流式細胞術比較H3K4b和H3K(+H)4b複合物攝取到MDA-MB-231細胞中。在不同時間點(1、2和4h)，H3K(+H)4b多聚複合物比H3K4b多聚複合物更有效地導入細胞。(+H)4b，P＜0.001)。有趣的是，不與內吞小泡重疊的不規則形狀的H3K4b多聚複合物可能是細胞外的，而不是用H3K(+H)4b複合物觀察。
眾所周知，HK聚合物和陽離子脂質( 即DOTAP)顯著且獨立地增加了質體的轉染。參見，例如，Chen 等人， Gene Ther2000；7：1698-1705。因此，這些脂質是否與HK一起值得注意的是，H3K(+H)4b和H3k(+H) 4b載體是比DOTAP脂質體更好的mRNA載體。H3K(+H)4b和DOTAP脂質體的組合在將mRNA攜帶到MDA中的能力方面具有協同作用-MB-231細胞。脂質體或H3K(+H)4b。值得注意的是，並非所有HK肽都表現出與DOTAP脂質的活性提高。H3K4b和DOTAP載體的組合作為螢光素酶mRNA的載體不如DOTAP脂質體有效。(+H)4b載體被發現在r攜帶mRNA進入細胞的能力。參見，例如，He 等人， J Gene Med，2020年11月10日：e3295。
在一些實施方案中，載體，例如NKP奈米顆粒，還包含陽離子脂質、PEG修飾的脂質、甾醇和非陽離子脂質。陽離子脂質是中性脂質，甾醇是膽固醇。-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)和二((Z)-非 2-en-1-基)9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
在一些實施方案中，載體是脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施方案中，LNP具有約50nm至約200nm的平均直徑，或進一步由脂質組成，特別是可電離的陽離子脂質，例如，本文揭示的 SM-102、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)，或二((Z)-非-2-en-1-基)9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。描述了另外的示例性脂質奈米顆粒組成物及其製備方法，例如，在Semple等人(2010) Na 28: 172-176；Jayarama等人(2012年)，Angew. Chem. Int. Ed.，51:8529-8533；和Maier等人每一篇的內容均通過引用整體併入本文。
在一個實施例中，本文使用的術語“疾病”或“病症”是指SARS-CoV-2感染、被診斷患有SARS-CoV-2感染的狀態、疑似患有SARS-CoV-2的狀態。CoV-2感染，或感染SARS-CoV-2的高危狀態被診斷為有症狀的SARS-CoV-2感染的狀態，疑似有症狀的SARS-CoV-2的狀態感染，或處於有症狀的SARS-CoV-2感染的高風險狀態。
在一個實施例中，本文使用的術語“疾病”或“病症”是指COVID-19、被診斷患有COVID-19的狀態、疑似患有COVID-19的狀態或處於高危狀態患有COVID-19。在一個實施例中，本文使用的術語“疾病”或“病症”是指有症狀的COVID-19、被診斷為有症狀的COVID-19的狀態、被懷疑患有有症狀的狀態COVID-19，或處於出現有症狀的COVID-19的高風險狀態。
如本文所用，術語“動物”是指活的多細胞脊椎動物生物體，該類別包括例如哺乳動物和鳥類。例如，猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、獼猴等)、家養動物(如狗和貓)、農場動物(如馬、牛、山羊、綿羊、豬)和實驗動物(如小鼠、蝙蝠、大鼠、兔、豚鼠)。
術語“個體”、“宿主”、“個體”和“患者”在本文中可互換使用，指的是動物，通常是哺乳動物。包括人類、非人類靈長類動物(例如，猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子)、獼猴等)、家養動物(如狗和貓)、農場動物(如馬、牛、山羊、綿羊、豬)和實驗動物(如小鼠、大鼠、蝙蝠、兔、豚鼠)。兒童、嬰兒或子宮內的哺乳動物)。
如本文所用，個體疾病的“治療”或“治療”是指(1) 預防症狀或疾病在易感或尚未表現出疾病症狀的個體中發生；(2) 抑制疾病或阻止其發展；或(3) 改善或引起疾病或疾病症狀的消退。如本領域所理解的，“治療”是獲得有益或期望的結果，包括臨床結果的方法。技術、有益或期望的結果可以包括一種或多種但不限於減輕或改善一種或多種症狀、減輕病症(包括疾病)的程度、穩定( 即不惡化)狀態病症(包括疾病)、病症(包括疾病)的延遲或減緩、病症(包括疾病)的進展、改善或緩解、狀態和緩解(無論是部分還是全部)，無論是可檢測的還是u檢測不到。一方面，治療不包括預防。
在一些實施例中，如本文所用，術語“治療”、“治療”等意指改善疾病，以便減少、改善或消除其病因、其進展、其嚴重性或一種或多種疾病它的症狀，或以其他方式有益地改變個體的疾病。提及“治療”或“治療”患者旨在包括預防。治療本質上也可以是先發製人的，即它可以包括預防疾病暴露於疾病或處於疾病風險中的個體。預防疾病可能涉及完全預防疾病，例如在預防病原體感染的情況下，或者可能涉及預防疾病進展。可能並不意味著完全排除任何疾病與任何水準的疾病相關的影響，而是可能意味著將疾病症狀預防到臨床顯著或可檢測的水準。n疾病的晚期階段。
“免疫反應”泛指淋巴細胞對外來物質的抗原特異性反應。術語“免疫原”和“致免疫性”指具有引發免疫反應能力的分子。本文揭示的免疫反應可以是體液的(通過抗體活性)或細胞介導的(通過T細胞啟動)。該反應可在體內或體外發生。技術人員將理解各種大分子，包括蛋白質、核酸、脂肪酸、脂質、脂多醣和多醣具有技術人員將進一步理解編碼能夠引發免疫應答的分子的核酸必然編碼免疫原。技術人員將進一步理解免疫原不限於全長分子，還可以包括部分分子。
如本文所用，“病毒載量”，在一些實施方案中也稱為“病毒負荷”、“病毒效價”、“病毒水準”或“病毒表現”，是病毒感染嚴重程度的量度，並且可以計算通過估計受感染生物體、涉及的體液或生物樣本中的病毒量。
如本文所用，生物樣品或樣品從個體獲得，但不限於前鼻拭子、眼液(房水和玻璃體液)、外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、***、***液、考珀氏液或***前液、女性***液、汗液、淚液、囊腫體液、胸膜液和腹膜液、心包液、腹水、淋巴液、食糜、乳糜、膽汁、間質液、月經、膿液、皮脂、嘔吐物、***分泌物/潮紅、滑液、黏膜分泌物、糞便水、胰液、灌洗液來自竇腔、支氣管肺抽吸物、胚泡液腔或臍帶血。
在一些實施例中，樣品可以是上呼吸道標本，例如鼻咽(NP)標本、口咽(OP)標本、鼻中鼻甲拭子、前鼻孔(鼻拭子)標本或鼻咽洗液/抽吸物或鼻洗/吸出 (NW)標本。
在一些實施方案中，樣品包括來自個體的流體，包括但不限於血液或血液製品(例如，血清、血漿等)、臍帶血、羊水、腦脊液、脊髓液、灌洗液((例如，支氣管肺泡、胃、腹膜、導管、耳、關節鏡)、女性生殖道沖洗液、尿液、糞便、痰、唾液、鼻黏液、***液、灌洗液、***、淋巴液、膽汁、淚液、汗液、***牛奶 在一些實施方案中，液體生物樣品是血漿或血清樣品。本文使用的術語“血液”是指來自個體的血液樣品或製劑。血液製品或血液的任何部分，例如血清、血漿、血沉棕黃層，或常規定義的類似物。血清是指血液樣本凝固後殘留的水樣部分。通常根據醫院或診所通常遵循的標準方案收集液體樣本。對於血液，適量的外周血(例如，3-40毫升之間))經常被收集起來，並且可以在準備之前或之後根據標準程式進行儲存。
“佐劑”是指增強對抗原的免疫反應的物質或混合物。分枝桿菌的總脂質提取物的非極性部分或所述非極性部分的一部分(參見例如，US 8,241,610)。包含佐劑的奈米載體可以可以通過WO 2011150240和US 20110293700中描述的方法進行配製，將每一篇的全部內容通過引用併入本文。
術語“接觸”是指兩個或多個參考實體之間的直接或間接結合或相互作用。如本文所用，接觸包括在溶液中、在固相中、在體外、離體、在細胞中和在體內。
多核苷酸、載體、細胞或載體或含有它們的其他試劑和組成物的“施用”或“遞送”可以在整個治療過程中以一個劑量連續或間歇地進行。確定最有效的施用方式和劑量的方法是本領域技術人員已知的，並且將隨著用於治療的組成物、治療目的、被治療的靶細胞和被治療的個體而變化。模式由治療醫師選擇或在動物的情況下，由治療獸醫。在一些實施例中，施用或其語法變體還指具有特定間隔的超過一次劑量。2天、3天、4天、5天、6天、1週、10天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或更長時間。在某些情況下一個劑量被重複一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。合適的劑量製劑和施用藥劑的方法是已知的也可以確定給藥途徑，確定最有效給藥途徑的方法是本領域技術人員已知的，並且會隨著用於治療的組成物、治療目的、健康狀況或疾病階段而變化給藥途徑的非限制性實例包括吸入、肌肉內給藥、鼻內給藥、口服給藥、腹膜內給藥、輸注、注射和局部應用。吸入或肌肉內給藥。一段時間，例如約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時，約11小時、約12小時、約24小時或更長時間。
術語施用應包括但不限於通過口服、腸胃外(例如，肌內、腹膜內、靜脈內、腦室內(ICV)、鞘內、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、吸入噴霧、經鼻、***、直腸、舌下、尿道(例如，尿道栓劑)或局部給藥途徑(例如，凝膠、軟膏、乳膏、氣霧劑等)，並且可以單獨或一起配製在含有常規無毒醫藥上可接受的載體的合適的劑量製劑單位中、佐劑、賦形劑和適用於每種給藥途徑的載體。
在一些實施方案中，如本文揭示的 RNA、多核苷酸、載體、細胞或組成物以有效量、施用、應用或劑量施用。這種遞送取決於許多變量，包括單個劑量單位被施用的時間段治療劑的生物利用度、給藥途徑等。然而，應當理解，本文揭示的治療劑對任何特定個體的具體劑量水準取決於多種因素，包括特定藥物的活性使用的藥劑、藥劑的生物利用度、給藥途徑、動物的年齡及其體重、一般健康狀況、性別、動物的飲食、給藥時間、***率、藥物組合，以及特定疾病的嚴重程度正在治療的患者和給藥形式。一般來說，人們希望給藥的藥劑量能有效地達到與發現體內有效濃度相稱的血清水準。程式在本領域中是眾所周知的，並且在在標準教科書中。
如本文所用，術語“RL-007”和RL007是指通過混合最終濃度為6.25mM的SM-102、1.25mM的DSPC、4.815mM的膽固醇和0.1875mMDMG-PEG2000( 即50:10:38: 1.5摩爾比)。術語“RL-007疫苗”、“RL007疫苗”、“RL-007mRNA疫苗”或“RL007mRNA疫苗”是指包含RL-007載體，或基本上由其組成，或進一步由RL-007載體組成的疫苗。 進行本揭露的方式 RNA
本文的揭示內容提供了編碼嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的棘(S)蛋白或其片段(例如致免疫性片段)的核糖核酸(RNA)或DNA。片段包含，或基本上由或進一步由至少一種非天然存在的胺基酸突變組成。
在一些實施方案中，片段或致免疫性片段包含，或者基本上由，或進一步由S蛋白或其等效物的受體結合結構域(RBD)組成，例如與SEQ ID NO: 1的aa 319至aa 541相對應（如排列比對）的片段。在一些實施方案中，受體結合結構域(RBD)指來自病毒的短致免疫性片段，其結合特定內源性受體序列以進入靶細胞。在一些實施態樣中，RBD指“棘”糖蛋白的一部分，其需要與內源性受體相互作用以促進膜融合和遞送至細胞質。在一些實施態樣中，如本文中所使用的RBD包含下列者、或基本上由下列者組成、或進一步由下列者組成：SEQ ID NO: 1中所述的aa 319至aa 541之多肽或其等效物。在一些實施方案中，該片段或致免疫性片段至少約5個胺基酸長，或至少約8個胺基酸長，或至少約10個胺基酸長，或至少約15個胺基酸長，或至少約20個胺基酸長，或至少約25個胺基酸長，或至少約30個胺基酸長，或至少約40個胺基酸長，或至少約50個胺基酸長，或至少約60個胺基酸長，或至少約70個胺基酸長，或至少約80個胺基酸長，或至少約100個胺基酸長胺基酸長，或至少約125個胺基酸長，或至少約150個胺基酸長，或至少約160個胺基酸長，或至少約170個胺基酸長，或至少約180個胺基酸長，或至少約190個胺基酸長，或至少約200個胺基酸長，或至少約250個胺基酸長，或至少約300個胺基酸，或更長；且視需要，包含下列者、基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：S蛋白的RBD或其等效物。致免疫性片段可用於誘導對SARS-CoV-2的免疫反應，或減少或抑制SARS-CoV-2與其受體如ACE2的結合，或兩者兼而有之，非免疫原性的片段可作為本文提供的試驗中的對照。
在一些實施例中，至少一個非天然存在的胺基酸突變包含，或可選地基本上由，或進一步由弗林蛋白酶樣切割位點中的突變組成，或可選地由，或進一步由RRAR組成(SEQ ID NO: 48)。在另外的實施方案中，如本文揭示的S蛋白或其片段中的弗林蛋白酶樣切割位點對應於(例如，對齊)SEQ ID NO的胺基酸(aa)682至aa 685 : 1. 在一些實施方案中，至少一個非天然存在的胺基酸突變包含，或者基本上由以下組成，或還進一步由以下的一種或多種組成：絲胺酸(S)作為對應於SEQ的R682的胺基酸ID NO: 1 (R682S)、作為對應於SEQ ID NO: 1的R683的胺基酸的S (R683S)、作為對應於SEQ ID NO: 1的R685的胺基酸的甘胺酸(G) (R685G)，或a G為對應於SEQ的R682的胺基酸ID NO: 1(R682G)。在一些實施例中，至少一個非天然存在的胺基酸突變包含，或者基本上由，或進一步由R682S和R685G 組成。在一些實施例中，突變的弗林蛋白酶樣切割位點穩定本文揭示的S蛋白或其片段。
另外或備選地，至少一個非天然存在的胺基酸突變包含脯胺酸(P)作為對應於任何一個或多個(例如任何兩個，或SEQ ID NO: 1的F817 (F817P)、SEQ ID NO: 1的A892 (A892P)、SEQ ID NO: 1的A899 (A899P)、A942的任何三個、或任何四個、或任何五個或所有六個)SEQ ID NO: 1(A942P)、SEQ ID NO: 1的K986(K986P)或SEQ ID NO: 1的V987(V987P)。在一些實施方案中，至少一個非天然存在的胺基酸突變包括，或者基本上由K986P和V987P組成，還進一步由K986P和V987P組成。這兩個突變在本文中稱為F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P的S2P。這六個突變在本文中稱為“S-HexaPro”或“S6P”。在實施方案中，包含S2P或S6P突變的S蛋白或其片段(例如其致免疫性片段)與不具有S2P或S6P突變的那些相比具有以下一種或多種特性：增加的體內或體外表現水準或兩者；更高的穩定性，例如室溫、加熱或凍融後；或保持蛋白質構象。
在一些實施例中，至少一個非天然存在的胺基酸突變包含以下各項，或可選地主要由以下各項組成，或還進一步由以下一項或多項組成：作為對應於SEQ ID NO的R682的胺基酸的絲胺酸(S)：1(R682S)、甘胺酸(G)作為SEQ ID NO：1的R685對應的胺基酸(R685G)、脯胺酸(P)作為SEQ ID NO：1的F817對應的胺基酸(F817P)、a P為SEQ ID NO：1的A892對應的胺基酸(A892P)，P為SEQ ID NO：1的A899對應的胺基酸(A899P)，P為SEQ ID NO：A942對應的胺基酸：1(A942P)，P作為對應於SEQ ID NO：1的K986的胺基酸(K986P)，或P作為對應於SEQ ID NO：1的V987的胺基酸(V987P)。
不希望受理論的束縛，S蛋白或其片段包含突變的弗林蛋白酶樣切割位點並且S2P或S6P突變顯示出優勢(例如更高的體內和體外表現水準，或更好的穩定性，或兩者)超過那些沒有這些突變，或僅包含突變的弗林蛋白酶樣切割位點，或僅包含S2P或S6P的那些。
在一些實施方案中，S蛋白或其片段源自天然存在的SARS-CoV-2變異體，例如α變異體、β變異體、δ變異體或γ變異體。-如所揭示的天然存在的胺基酸突變本文中的變異體可以被工程化為S蛋白變異體或其片段，例如α變異體、β變異體、δ變異體或γ變異體，從而得到突變的S蛋白或其片段。
在進一步的實施方案中，S蛋白或其片段來源於嵌合SARS-CoV-2 S蛋白，其胺基酸或連續片段被相應的胺基酸或第二個天然存在的S變異體的連續片段取代。
在一些實施方案中，S蛋白或其片段還包含一個或多個突變，這些突變在天然存在的SARS-CoV-2變異體(例如delta變異體)中發現。基本上由以下各項組成，或還進一步由以下一項或兩項組成：作為對應於SEQ ID NO: 1的N440的胺基酸的離胺酸(K)(N440K)，或作為對應於SEQ ID NO: 1的E484的胺基酸的K(E484K)。另外或備選地，一個或更多突變包含，或者可選地，基本上由以下組成，或者進一步由以下組成：作為對應於SEQ ID NO: 1的T19的胺基酸的精胺酸(R)(T19R)，作為對應於SEQ ID NO：1的V70的胺基酸的***酸(F) SEQ ID NO：1(V70F)、異亮胺酸(I)作為SEQ ID NO：1的T95對應的胺基酸(T95I)、天冬胺酸(D)作為SEQ ID NO：1的G142對應的胺基酸(G142D)，對應於SEQ ID NO: 1(E156Δ)的E156的缺失，a對應於SEQ ID NO：1的F157的缺失(F157Δ)，一個G為對應於SEQ ID NO：1的R158的胺基酸(R158G)，一個纈胺酸(V)為對應於SEQ ID NO：的A222的胺基酸1(A222V)、亮胺酸(L)作為對應於SEQ ID NO：1的W258的胺基酸(W258L)、天冬醯胺(N)作為對應於SEQ ID NO：1的K417的胺基酸(K417N)、和R為SEQ ID NO：1的K417對應的胺基酸(L452R)，K為SEQ ID NO：1的T478對應的胺基酸(T478K)，G為SEQ ID NO：1的D614對應的胺基酸:1 (D614G)，R作為對應於SEQ ID NO：1的P681的胺基酸(P681R)，或N作為對應於SEQ ID NO：1的D950的胺基酸(D950N)。一個或多個突變包含，或基本上由，或進一步由T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N組成。本質上或進一步由T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G和D950N組成。在一些實施方案中，一個或多個突變包括，或替代性地包括，或進一步包括T19R，V70F，T95I，G142D，E156Δ，F157Δ，R158G，A222V，W258L，K417N，L452R，T478K，D614G，P681R和D950N。在一些實施方案中，一個或多個突變包括，或基本包括，或進一步包括T19R，V70F，T95I，G142D，E156Δ，F157Δ，R158G，A222V，W258L，K417N，N440K，L452R，T478K，E484K，D614G，P681R和D950N。
在一些實施方案中，S蛋白包含或可選地基本上由或進一步由SEQ ID NO: 5或其等效物的多肽組成。ID NO: 5， 即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P。此外，RNA或DNA包含編碼SEQ ID NO: 5或其等效項。
在一些實施方案中，S蛋白包含，或者基本上由，或還進一步由SEQ ID NO：6的多肽或其等效物組成。ID NO：6，即T19R，T95I，G142D，E156Δ，F157Δ，R158G、L452R、T478K、D614G、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P屬於或進一步由編碼SEQ ID NO:6或其等效物的多核苷酸組成。
在一些實施方案中，S蛋白包含或可選地基本上由或進一步由SEQ ID NO: 7或其等效物的多肽組成。在一些實施方案中，SEQ ID NO: 7的等同物保留了SEQ ID NO: 7的突變，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。RNA包含SEQ ID NO：9的多核苷酸，或者基本上由 SEQ ID NO：9的多核苷酸組成，或者進一步由SEQ ID NO：9的多核苷酸組成或其等價物。
在一些實施方案中，S蛋白包含或可選地基本上由或進一步由SEQ ID NO：10或其等效物的多肽組成。在一些實施方案中，SEQ ID NO：10等效物保留SEQ ID NO：10突變，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。在進一步的實施方案中，該RNA或DNA包括，或基本上包括，或進一步包括編碼SEQ ID NO: 10或其等同物的多核苷酸。
在一些實施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO：11的多肽或其等效物，或者基本上由其組成，或者還進一步由其組成。在一些實施方案中，SEQ ID NO: 11的等效物保留了SEQ ID NO：11等效物突變，即T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S及R685G。在進一步的實施方案中，RNA包含SEQ ID NO:13的多核苷酸或其等效物，或者基本上由其組成，或進一步由其組成。在一些實施方案中，SEQ ID NO:13的等效物仍然編碼SEQ ID NO: 11或其等價物。
在一些實施方案中，S蛋白包含或可選地基本上由或進一步由SEQ ID NO: 14或其等效物的多肽組成。ID NO: 14，即T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、E484K、N440K、F817P、A892P、A9462P、K9869P、V987P、R682S和R685G。可選地，RNA包含，或SEQ ID NO: 16或其等效物的多核苷酸，或進一步由其組成。在一些實施方案中，SEQ ID NO: 16的等效物仍然編碼 SEQ ID NO: 14或其等效物。在一方面，RNA包含，或基本上由，或還進一步由SEQ ID NO：55中揭示的序列或其等效物組成。
在一些實施方案中，SEQ ID NO：9、13或16中任一個的等效物由等效物全長的約35%至約70%的GC含量組成。
在一些實施例中，當量是至少約80%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約91%，或至少約92%，或至少約93%，或至少與全長參考序列至少約94%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%，或更多相同。
在一些實施例中，RNA進一步包含3'UTR。在進一步的實施例中，3'UTR包含或可選地基本上由或由SEQ ID NO: 18、22或24中的任一個組成。
在一些實施方案中，RNA進一步包含5' UTR。在進一步的實施方案中，5' UTR包含或可選地基本上由或由SEQ ID NO: 20或26組成。
在一些實施方案中，RNA還包含多腺苷酸尾巴。在進一步的實施方案中，多腺苷酸尾巴包含SEQ ID NO：27、28或30中的任一個。
在一些實施方案中，RNA進一步包含5'帽。在進一步的實施方案中，5'帽包含，或備選地由，或進一步由5'CleanCap.5 '帽結構組成。
在一些實施方案中，RNA包含，或者可選地基本上由以下組成，或由以下組成，可選地從5'到3'，5'UTR，編碼本文揭示的S蛋白或片段的編碼序列，3'UTR和多腺苷酸(polyA)。在進一步的實施方案中，RNA包含SEQ ID NO: 32或52，或者基本上由其組成，或由其組成。
在一些實施方案中，RNA是信使RNA (mRNA)。還提供了編碼這些RNA及其互補物的DNA分子。
在一些實施方案中，RNA被化學修飾。在進一步的實施方案中，修飾包括，或替代性地包括，或包括將尿苷(U)殘基修飾為N1-甲基假尿苷殘基。此外，或替代性地，該修飾包括，或替代性地包括，或包括將U殘基修飾為假尿苷殘基。
在一些實施例中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高百分比的RNA殘基被化學修飾。
在一些實施例中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高百分比的RNA尿苷殘基被化學修飾，任選為N1-甲基假尿苷或假尿苷。在進一步的實施中，RNA中至少約50%，或至少約70%，或約100%的尿苷殘基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。
在 體外轉錄期間被假尿苷取代。這種修飾使mRNA穩定以抵抗細胞中的酶促降解，導致mRNA的轉譯效率提高。例如N6m-乙基腺苷(m6A)、肌苷、假尿苷、5-甲基胞苷(m5C)、5-羥甲基胞苷(hm5C)和N1-甲基腺苷(m1A)。在整個mRNA中製備。技術人員會認識到其他修飾RNA殘基可用於穩定蛋白質的3維結構並增加蛋白質轉譯。
不希望受理論束縛，編碼天然存在的S蛋白的RNA啟動內體RNA傳感通路，如TLR3、TLR7和TLR8 (Toll樣受體)，從而誘導先天免疫，進而抑制棘蛋白轉譯。此外，分泌的IFN-β通過啟動下游細胞凋亡途徑在細胞表面表現的同源受體結合後引起腫瘤細胞死亡。然而，本文揭示的突變S蛋白的優化RNA表現避免了這一缺點，因此呈現提高效率(先天免疫)，進而抑制棘蛋白轉譯。在一些實施方案中，優化的RNA可以施用於有需要的個體，在體內表現突變的S蛋白。在個體中誘導免疫反應，這在turns預防或治療SARS-CoV-2感染，如本文所揭示。優化的RNA在體外表現突變的S蛋白，並且任選地，這種表現的S蛋白可以在體外啟動免疫細胞。啟動的免疫細胞然後可以用於治療有需要的個體。
在另一方面，提供了一種產生嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的棘(S)蛋白或其致免疫性片段的方法。該方法包括，或者基本上由，或進一步由在適合於表現S蛋白或其致免疫性片段的條件下培養本文揭示的細胞的步驟。在一些實施方案中，細胞是本文揭示的宿主細胞。
此外，提供了一種用於篩選減少或抑制SARS-CoV-2及其受體(例如ACE2)結合的候選藥物的方法，任選地在個體中或在個體的細胞上或兩者上。還包括從本文揭示的RNA表現棘(S)蛋白或其致免疫性片段，並測量表現的S蛋白或其致免疫性片段與SARS-CoV-2受體(例如ACE2)之間的結合，或者不存在候選藥物或具有不同濃度的候選藥物。與沒有候選藥物的情況相比，候選藥物表明候選藥物減少或抑制了SARS-CoV-2與其受體的結合。在增加候選藥物濃度的同時壓制S蛋白或其致免疫性片段和SARS-CoV-2受體表明候選藥物減少或抑制SARS-CoV-2與其受體的結合。其致免疫性片段在宿主中表現在測量步驟中的宿主細胞中。另外或可選地，受體，例如ACE2，在測量步驟中在宿主細胞中表現。在測量步驟中的宿主細胞中，在其他實施方案中，S蛋白或其致免疫性片段分離自測量步驟中的宿主細胞。標記物，例如螢光蛋白。在進一步的實施方案中，S蛋白或其致免疫性片段與受體之間的結合是使用基於螢光的測定法進行的。y，例如螢光顯微鏡或螢光啟動細胞分選(FACS)
在另一方面，提供了一種用於選擇編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的棘(S)蛋白或其致免疫性片段的RNA的方法，或者還進一步包括轉導RNA進入細胞，在適合表現RNA的條件下培養細胞，並測量細胞分泌的IFN-α或IFN-β或兩者。如果不分泌IFN-α或IFN-β或兩者或更少，則RNA與編碼野生型S蛋白或其致免疫性片段的RNA相比，IFN-α或IFN-β或兩者的分泌。-α或IFN-β或兩者使用酶聯免疫吸附測定來測量。 多核苷酸、載體、細胞和相關方法
一方面，提供了編碼本文揭示的RNA的多核苷酸，或與其互補的多核苷酸，或它們各自的類似物。
在一些實施例中，本揭示提供了編碼嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的棘(S)蛋白或其致免疫性片段的多核苷酸，該S蛋白或其致免疫性片段包含至少一種非天然的此類多核苷酸的非限制性實例包含SEQ ID NO: 55的序列，或者基本上由SEQ ID NO: 55的序列組成，或由其組成。在一些實施方案中，本揭示提供了編碼棘(S)蛋白或其致免疫性片段的多核苷酸一種嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，包含至少一個非天然存在的胺基酸突變，包含包含序列SEQ ID NO:52的多核苷酸，或者基本上由序列組成，或由序列組成。
在進一步的方面，提供了一種載體，其包含或可選地基本上由或由本文揭示的多核苷酸組成，ID NO：53。
在一些實施方案中，載體還包含可操作地連接至多核苷酸以指導其轉錄的調控序列。或者，基本上由啟動子組成，或由啟動子組成。在又一些實施方案中，啟動子是RNA聚合酶啟動子，任選地是噬菌體RNA聚合酶啟動子、啟動子、或SP6啟動子、或T3啟動子。在一些實施方案中，T7啟動子，或基本上由，或進一步由TAATACGACTCACTATAA(SEQ ID NO:51)組成。在細胞中用於表現RNA如本文所披露。全部或進一步由啟動子或增強子或兩者組成。
在一些實施方案中，載體進一步包含可操作地連接至多核苷酸以指導其複制的調控序列、複製起點或引子退火位點、啟動子或增強子。
在一些實施方案中，RNA或多核苷酸或載體還包含選自可檢測標記、純化標記或選擇標記的標記。
在一些實施例中，載體是非病毒載體，任選地是質體，或脂質體，或膠束。在一些實施例中，載體是病毒載體，任選地是腺病毒載體，或腺相關病毒載體，或反轉錄病毒載體，或慢病毒載體，或植物病毒載體。
在一些實施方案中，本文揭示的多核苷酸或載體適用於產生(例如轉錄或表現或複制)本文揭示的RNA。用於體外產生或複制RNA。然後將此類RNA施用於個體或者，多核苷酸或載體可用作基因療法並直接施用於有需要的個體。
在另一個方面，細胞包含以下的一種或多種：如本文揭示的RNA、如本文揭示的多核苷酸或如 本文揭示的載體。在一些實施方案中，細胞是真核細胞，任選地哺乳動物細胞、昆蟲細胞、或酵母細胞。
在一些實施方案中，如本文所揭示的細胞適合於產生(例如轉錄或表現)如本文所揭示的RNA。然後將此類RNA任選地與合適的醫藥上可接受的載體一起施用於有需要的個體。在一些實施方案中，細胞療法可以另外向個體遞送其他預防劑或治療劑。
在又一個方面，提供了一種組成物，其包含載體，可選地，醫藥上可接受的載體，以及以下的一種或多種，或可選地基本上由其組成，或還進一步由其組成：如本文揭示的RNA，如本文揭示的多核苷酸，如本文揭示的載體，或如本文揭示的細胞。
在一些實施方案中，該組成物還包含另外的預防劑或治療劑。
在一些實施方案中，額外的預防或治療劑適用於預防或治療本文揭示的SARS-CoV-2相關疾病的抗病毒劑，任選地瑞德西韋、洛匹那韋、利托那韋、伊維菌素、達菲或法匹拉韋；和抗炎劑，可選***、托珠單抗、kevzara、colcrys、羥氯喹、氯喹或激酶抑制劑；來自從SARS-CoV-2感染中恢復的個體的共價血漿；與SARS-CoV-2結合的抗體，bamlanivimab、etesevimab、casirivimab或imdevimab；或抗生素藥物，可選阿奇黴素。
在一些實施方案中，額外的預防劑適合用於預防與SARS-CoV-2無關的疾病。例如，額外的預防劑包括，或基本上包括，或進一步包括另一種冠狀病毒的疫苗，如SARS-CoV或MERS-CoV。此外，或者說，額外的預防劑包括，或者基本上包括，或者進一步包括另一種病毒的疫苗，如流感疫苗、乳頭瘤病毒疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、脊髓灰質炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、輪狀病毒疫苗。在一些實施方案中，額外的預防劑包括，或基本上包括，或進一步包括細菌或其他病原體的疫苗，如白喉疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、百日咳疫苗、肺炎球菌疫苗、破傷風疫苗或腦膜炎球菌疫苗。在一些實施方案中，額外的預防劑包括，或基本上包括，或進一步包括非感染性疾病的疫苗，如癌症。
在一些實施例中，該組成物還包含佐劑。
在一個方面，提供了一種產生本文揭示的RNA的方法。RNA。在進一步的實施方案中，RNA由質體DNA(pDNA)載體遞送系統產生。在又進一步的實施方案中，質體載體可以適用於mRNA疫苗生產。常用的質體包括pSFV1、pcDNA3和pTK126，它們都是市售的。一種獨特的mRNA表現系統是pEVL (參見，Grier et al. Mol Ther Nucleic Acids. 19;5:e306 (2016))。
在一些實施方案中，該方法包括，或可替代地基本上由，或還進一步由將本文揭示的多核苷酸或本文揭示的載體與RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鳥苷接觸-5'-三磷酸(GTP)和尿苷三磷酸(UTP)或在適合表現RNA的條件下化學修飾的UTP。在一些實施方案中，RNA在線性 體外轉錄(IVT)系統中由線性DNA範本產生包括噬菌體啟動子、UTR和編碼序列，通過使用RNA聚合酶(T7、T3或SP6)和不同核苷的混合物。包括儲存RNA。 配方及相關方法
一方面，提供了一種組成物，其包含本文揭示的RNA和醫藥上可接受的載體，或者基本上由或進一步由本文揭示的RNA和醫藥上可接受的載體組成。
在一些實施方案中，醫藥上可接受的載體包含，或可選地基本上由，或還進一步由聚合物奈米顆粒-聚合物(HKP)組成。在一些實施方案中，HKP包含選自SEQ ID NOs:34-47的側鏈，不希望受理論束縛，與不含奈米顆粒的RNA相比，組成物中的RNA具有更高的穩定性。
，任選地可電離的三甲基胺丙烷(DOTAP )或兩者。在一些實施方案中，脂質進一步包含以下的一種或多種：輔助脂質、膽固醇或聚乙二醇化脂質。
在一些實施方案中，醫藥上可接受的載體包含脂質奈米顆粒(LNP)，或者可選地基本上由其組成，或者還進一步由脂質奈米顆粒(LNP)組成。)己基]胺基}辛酸酯(SM-102), 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA), dilinoleyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA), di((Z)-非-2-en-1-基)9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或其各自的等價物。在又進一步的實施方案中，LNP進一步包含以下的一種或多種：輔助脂質、膽固醇或聚乙二醇化脂質。
在一些實施方案中，輔助脂質包含或可選地基本上由以下組成或還進一步由以下各項中的一種或多種組成：二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、( 2R)-3-(十六烷醯氧基)-2-{[(9 Z)-octadec-9-enoyl]oxy}propyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate (POPC)，或二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)。
如本文所用，術語“RL-007”和RL007是指通過混合最終濃度為6.25mM的SM-102、1.25mM的DSPC、4.815mM的膽固醇和0.1875mM的可電離脂質等效物DMG-PEG2000( 即50:10:38:1.5摩爾比)。術語“RL-007疫苗”、“RL007疫苗”、“RL-007mRNA疫苗”或“RL007mRNA疫苗”是指疫苗其包含，或者可選地主要由，或還進一步由RL-007載體組成。
在一些實施方案中，包含膽固醇，或者基本上由膽固醇或動物膽固醇或兩者組成，或還進一步由膽固醇或動物膽固醇組成。
在一些實施方案中，聚乙二醇化脂質包含，或者可選地主要由以下組成，或者還進一步由以下的一種或多種組成：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺基甲醯基)]-1,2-二肉荳蔻氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂醯-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉荳蔻醯-sn-甘油)任選地PEG2000-DMG ((1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]、或PEG-DPG(1,2-二軟脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。
在另一方面，所提供的是組成物，其包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：如本文中所揭示之RNA及HKP。該方法包含下列者、或替代地基本上由下列者組成、或又進一步由下列者組成：將RNA與HKP接觸，從而使該RNA及該HKP係經自組裝成奈米顆粒。
在一些實施例中，接觸步驟中HKP與RNA的質量比為約10:1至約1:10，包括其間的任何範圍或比例，例如約5:1至1:5，約5:1:1比1:1、約10:1、約9.5:1、約9:1、約8.5:1、約8:1、約7.5:1、約7:1、約6.5:1、約6:1、約5.5:1、約5:1、約4.5:1、約4:1、約3.5:1、約3:1、約2:5:1、約2:1、約1.5:1、約1:1、約1:1.5、約1:2、約1:2.5、約1:3、約1:3.5、約1:4、約1:4.5、約1:5、約1:5.5、約1:6、約1:6.5、約1:7、約1:7.5、約1:8、約1:8.5、約1:9、約1:9.5或約1:10。HKP與RNA的比例在接觸步驟中約為2.5:1。
在一些實施方案中，該方法還包括使HKP和RNA與陽離子脂質(3-(三甲基胺)丙烷)或兩者接觸。在又一些實施方案中，接觸步驟中陽離子脂質和RNA的質量比為約10:1至約1:10，包括其間的任何範圍或比率，例如，約5:1至1:5、約5:1至1:1、約10:1、約9.5:1、約9:1、約8.5:1、約8:1、約7.5:1、約7:1、約6.5:1、約6:1、約5.5:1、約5:1、約4.5:1、約4：1、約3.5:1、約3:1、約2:5:1、約2:1、約1.5:1、約1:1、約1:1.5、約1:2、約1:2.5、約1:3，約1:3.5，約1:4，約1:4.5，約1:5，約1:5.5，約1:6，約1:6.5，約1:7，約1:7.5，約1:8、約1:8.5、約1:9、約1:9.5或約1:10。接觸步驟中的RNA與陽離子脂質的比例約為1:1。因此，可以根據HKP與RNA的比例計算出HKP、RNA與陽離子脂質在接觸步驟中的質量比。例如，如果HKP與RNA的比例約為4:1，RNA與陽離子脂質的比例約為1:1，則HKP與RNA與陽離子脂質的比例約為4:1：1。
在一個實施例中，在無核酸酶的水中製備HKP(+H)儲備溶液(10 mg/mL)。濃縮的儲備溶液在水中稀釋至2.5 mg/mL。1 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)。mRNA/ HKP(+H)複合物是通過使用微流體混合等體積的2.5 mg/mL HKP(+H)和1 mg/mL mRNA形成的。H)與mRNA的比例為2.5:1。mRNA/HKP(+H)聚合物複合體(polyplex)在使用前在室溫下孵化30分鐘。對於所有基於多肽的聚合物複合體的製備，在轉染或注射前用Zetasizer(Malvern Panalytical)測定其大小。
在一些實施方案中，該藥物包含、或基本上由或進一步由聚合物奈米顆粒或脂質奈米顆粒組成，它們均包含陽離子脂質(例如本文揭示的那些中的一種或多種)、輔助脂質(例如一種或多種如本文揭示的那些)、膽固醇(如一種或多種如本文揭示的那些)和聚乙二醇化脂質(如一種或多種如本文揭示的那些)。HKP。在一些實施方案中，質量比陽離子脂質、輔助脂質、膽固醇和PEG化脂質的比例約為1:1:1:1:1。
在一些實施例中，陽離子脂質與輔助脂質的質量比為約10:1至約1:10，包括其間的任何範圍或比率，例如約5:1至1:5、約5:1至1:1、約10:1、約9.5:1、約9:1、約8.5:1、約8:1、約7.5:1、約7:1、約6.5:1、約6:1，約5.5:1、約5:1、約4.5:1、約4:1、約3.5:1、約3:1、約2:5:1、約2:1、約1.5:1、約1：1、約1:1.5、約1:2、約1:2.5、約1:3、約1:3.5、約1:4、約1:4.5、約1:5、約1:5.5、約1：6、約1:6.5、約1:7、約1:7.5、約1:8、約1:8.5、約1:9、約1:9.5或約1:10的陽離子脂質和輔助物脂質約為1：1。
在一些實施例中，陽離子脂質與膽固醇的質量比為約10:1至約1:10，包括其間的任何範圍或比率，例如約5:1至1:5、約5:1至1:1，約10:1，約9.5:1，約9:1，約8.5:1，約8:1，約7.5:1，約7:1，約6.5:1，約6:1，約5.5:1，約5:1，約4.5:1，約4:1，約3.5:1，約3:1，約2:5:1，約2:1，約1.5:1，約1:1，約1:1.5，約1:2，約1:2.5，約1:3，約1:3.5，約1:4，約1:4.5，約1:5，約1:5.5，約1:6，約1:6.5、約1:7、約1:7.5、約1:8、約1:8.5、約1:9、約1:9.5或約1:10。陽離子脂質和膽固醇約1:1。
在一些實施例中，陽離子脂質與聚乙二醇化脂質的質量比為約10:1至約1:10，包括其間的任何範圍或比率，例如約5:1至1:5、約5:1至約1:10。1:1，約10:1，約9.5:1，約9:1，約8.5:1，約8:1，約7.5:1，約7:1，約6.5:1，約6:1，約5.5:1，約5:1，約4.5:1，約4:1，約3.5:1，約3:1，約2:5:1，約2:1，約1.5:1，約1:1，約1:1.5，約1:2，約1:2.5，約1:3，約1:3.5，約1:4，約1:4.5，約1:5，約1:5.5，約1:6，約1:6.5，約1:7，約1:7.5，約1:8，約1:8.5，約1:9，約1:9.5，或約1:10。陽離子脂質和聚乙二醇化脂質約為1:1。
陽離子脂質、輔助脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質的質量比可以由本領域技術人員基於陽離子脂質和輔助脂質、陽離子脂質和膽固醇以及陽離子脂質和陽離子脂質的比例來計算。如本文所揭示的聚乙二醇化脂質。
在一些實施例中，LNP包含或基本上由以下組成，或還進一步由以下組成：SM-102、DSPC、膽固醇和PEG2000-DMG。為約1:1:1:1及/或SM-102的摩爾比、DSPC、膽固醇和PEG2000-DMG約為50:10:38.5:1.5。
在一些實施例中，此處提供的質量比可以用另一參數代替，例如摩爾比、重量百分比相對於總重量、組分的重量相對於總體積、或摩爾百分比相對於總摩爾量。組分及其分子量，本領域技術人員將不難將質量比轉換為摩爾比或其他等效參數。
在進一步的方面，提供了一種生產組成物的方法，該組成物包含本文揭示的RNA和LNP，或者基本上由或進一步由本文揭示的RNA和LNP組成。-組裝成奈米粒子。
在一些實施例中，接觸步驟在微流體混合器中進行，微流體混合器任選地選自狹縫叉指式微混合器或交錯人字形微混合器(SHM)。
在一些實施方案中，組成物還包含另外的預防劑或治療劑，例如 本文揭示的那些 (mRNA)、化合物、多肽、抗體、其抗原結合部分、組成物、載體、抗原、宿主細胞及/或包含抗原、宿主細胞及/或其他治療劑( 例如製劑)的任何醫藥上可接受的組成物。在一些實施方案中，其他預防劑或治療劑適用於預防或治療本文揭示的SARS-CoV-相關疾病。用於接種、預防和治療SARS-CoV-2的抗病毒劑、疫苗或有效劑量的核酸。額外的預防或治療劑適用於預防或治療 SARS-CoV-2天然存在的變異體，例如Alpha、Beta、Gamma、Delta及/或Omicron變異體。適用於預防或治療SARS-CoV-2種自然發生的變異體及其後代譜系。其中會導致COVID-19。SARS-CoV-2自然發生的變異體的後代譜系包括但不限於Alpha B.1.1.7和Q譜系；Beta B.1.351；Gamma P.1；Delta B.1.617.2和AY譜系；B.1.617.1；Mu B.1.621，B.1.621.1；Zeta P。2；及/或Omicron B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5譜系。
在進一步的實施方案中，另外的預防劑或治療劑包含，或者可選地主要由以下組成，或者還進一步由以下組成：抗病毒劑瑞德西韋、洛匹那韋、利托那韋、伊維菌素、達菲或法匹拉韋；抗炎劑，任選***、tocilizumab、kevzara、colcrys、羥氯喹、氯喹或激酶抑制劑；來自從SARS-CoV-2感染中恢復的個體的共價血漿；結合SARS-CoV-2的抗體，可選地bamlanivimab、etesevimab、casirivimab或imdevimab；或抗生素，可選阿奇黴素。
在一些實施方案中，額外的預防或治療劑適用於預防與SARS-CoV-2無關的疾病。另一種冠狀病毒(例如SARS-CoV或MERS-CoV)的疫苗。另外或可選地，額外的預防或治療劑治療劑包含另一種病毒的疫苗，或基本上由另一種病毒的疫苗組成，或還進一步由另一種病毒的疫苗組成，例如流感(流感)疫苗、乳頭瘤病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、脊髓灰質炎疫苗、水痘水痘疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、輪狀病毒疫苗。在一些實施態樣中，另外的預防劑或治療劑包含，或者基本上由以下組成，或者進一步由以下組成：細菌疫苗或其他病原體，如作為白喉疫苗、b型 流感嗜血桿菌疫苗、百日咳疫苗、肺炎球菌疫苗、破傷風疫苗或腦膜炎球菌疫苗。由針對非傳染性疾病(例如癌症)的疫苗組成。 治療方法
一方面，提供了一種用於預防或治療本文揭示的疾病的方法。另外或可選地，提供了一種或多種以下方法：(a) 預防個體患有有症狀的SARS-CoV-2感染；(b) 防止個體在感染SARS-CoV-2後住院；(c) 防止個體需要重症監護(例如在重症監護病房(ICU)中)或呼吸機或兩者；(d) 在有需要的個體中誘導對SARS-CoV-2的免疫反應；(e) 減少SARS-CoV-2或其S蛋白與其受體的結合，例如血管緊張素轉換酶2(ACE2))，在有需要的個體中；(f) 治療感染SARS-CoV-2的個體；或(g) 減少有需要的個體中的SARS-CoV-2病毒載量。
宿主中和抗體阻斷SARS-CoV-2或其S蛋白與其受體(如ACE2)的結合，從而中和病毒並降低SARS-CoV-2病毒載量。病毒感染，可以通過估計直接計算受感染的生物體、涉及的體液或生物樣本中的病毒量。病毒載量的量化通常可以通過使用斑塊減少中和試驗(PRNT)來進行。一種血清學測試，它利用特定抗體的能力來中和病毒，進而防止病毒在細胞單層中形成斑塊。然後將混合物接種到適合個體病毒的細胞系的細胞上。添加染料以觀察噬菌斑，將單個平板中的噬菌斑數除以原始病毒數以計算中和百分比。根據病毒的不同，噬菌斑形成單位(pfu)通過顯微鏡測量觀察結果、螢光抗體或與受感染細胞反應的特定染料。中和效價可以計算為導致(斑塊形成)減少50%以上(PRNT50)或90%(PRNT90)的最低稀釋度的倒數單位)相對於陰性對照血清。從兩個完全接種疫苗的個體收集的血清和從未接種疫苗的個體收集的血清可分別用作陽性和陰性對照。
因此，個體中誘導的免疫反應包括誘導增加的中和抗體效價、增加的脾細胞Th1-細胞因數水準(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-細胞因數水準(IL-4、IL-5、IL-13)，及/或誘導減少的病毒載量。本揭示提供了一種在個體中誘導針對SARS-CoV-2或本文揭示的多核苷酸、或載體、或細胞或組成物的免疫反應的方法，從而誘導免疫反應個體中的反應對SARS-CoV-2抗原特異的免疫反應，相對於未接種疫苗的個體中的中和抗體效價，接種疫苗後個體中的中和抗體效價增加。在一些實施方案中，個體中的中和抗體效價增加相對於未接種疫苗的個體中的中和抗體效價，1 log至10 log疫苗接種後。相對於未接種疫苗的個體中的中和抗體效價，接種疫苗後個體中的Zing抗體效價增加1 log、2 log、3 log、4 log、5 log或10 log。
Th1-細胞因數水準(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和 Th2-細胞因數水準(IL-4、IL-5、IL-13)來評估免疫反應在一些實施方案中，該方法包括向個體施用有效劑量的如本文揭示的RNA、或多核苷酸、或載體、或細胞或組成物，從而在個體中誘導特異性針對SARS-CoV-2抗原的免疫反應。治療個體的脾細胞Th1-細胞因數水準(IFN-γ、IL-2、TNF-α)及/或Th2-細胞因數水準(IL-4、IL-5、IL-13)在疫苗接種後增加至相對中和未接種疫苗的個體的抗體效價。
該方法包括，或者可替代地基本上由以下組成，或者進一步由以下組成：向個體施用任選有效量的一種或多種：如本文揭示的RNA、如本文揭示的多核苷酸、如本文揭示的載體、如本文所揭示的細胞，或如本文所揭示的組成物。
在一些實施方案中，該方法還包括治療有此需要的個體，例如向個體施用另外的預防劑或治療劑。
或治療本文揭示的 SARS-CoV-2相關疾病的抗病毒劑，任選地瑞德西韋、洛匹那韋、利托那韋、伊維菌素、達菲或法匹拉韋；和抗炎劑，可選***、托珠單抗、kevzara、colcrys、羥氯喹、氯喹或激酶抑制劑；來自從SARS-CoV-2感染中恢復的個體的共價血漿；與SARS-CoV-2結合的抗體，bamlanivimab、etesevimab、casirivimab或imdevimab；或抗生素藥物，可選阿奇黴素。
在一些實施方案中，額外的預防劑適用於預防與SARS-CoV-2無關的疾病。另外或可選地，額外的預防劑包含，或者基本上由，或還進一步由用於另一種疫苗的疫苗組成。病毒，例如流感(流感)疫苗、乳頭瘤病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、脊髓灰質炎疫苗、水痘水痘疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗，輪狀病毒疫苗。或者基本上由，或進一步由細菌或其他病原體疫苗組成，例如白喉疫苗，b型 流感嗜血桿菌電影、百日咳疫苗、肺炎球菌疫苗、破傷風疫苗或腦膜炎球菌疫苗。作為癌症。
在一些實施方案中，當給予RNA或組成物時，個體沒有感染SARS-CoV-2。測試(NAATs)、抗原測試或抗體測試。針對SARS-CoV-2的NAATs特異性識別RNA包含病毒遺傳物質的(核糖核酸)序列，包括但不限於反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)或等溫擴增(如切口核酸內切酶擴增反應(NEAR)、轉錄介導擴增(TMA))、環介導等溫擴增(LAMP)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、成簇規則間隔短回文重複序列(CRISPR)或鏈置換擴增(SDA))。抗原測試是檢測特定病毒抗原存在的免疫測定，這意味著當前的病毒感染。le at www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/ resources/antigen-tests-guidelines.html於2021年8月1日評估。抗體或血清學測試尋找血液中對抗SARS-CoV-2的抗體，並且通常用於指示過去感染或成功接種疫苗。然而，IgM抗體可以在感染後持續數周至數月，儘管其持續時間似乎比IgG短；可在www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/ lab/resources/antibody-tests-guidelines.html於2021年8月1日評估。
在一些實施方案中，個體有患上本文揭示的疾病的風險，例如SARS-CoV-2感染，有暴露於SARS-CoV-2的風險。
在一些實施例中，個體在被SARS-CoV-2感染後，比其他人更有可能患上嚴重的疾病。例如，他們在感染後可能需要住院、重症監護或呼吸機，或者死亡。在一些實施例中，個體超過65歲。在一些實施例中，個體患有以下一種或多種疾病：癌症、慢性腎病、慢性肺病(如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘(中度至重度)、間質性肺病、囊性纖維化或肺動脈高壓)、癡呆或其他神經系統疾病、糖尿病(1型或2型)、唐氏綜合症、心髒病(如心力衰竭、冠狀動脈疾病、心肌病或高血壓)、HIV感染、免疫功能低下狀態(免疫功能低下)系統)、肝病、超重、肥胖、懷孕、鐮狀細胞病、地中海貧血、吸菸(現在或以前)、實體器官或造血幹細胞移植、中風或腦血管疾病(例如影響血液流向大腦的疾病)或物質使用障礙。
在一些實施方案中，給藥是通過吸入。在進一步的實施方案中，RNA或組成物在給藥之前或期間通過噴霧器吸入系統霧化。
在一些實施方案中，給藥是通過皮下注射。在一些實施方案中，給藥是通過肌內注射。
在一些實施方案中，本文揭示的組成物可以是氣霧劑、分散體、溶液或懸浮液的形式，並且可以配製用於吸入、肌內、口服、舌下、口腔、腸胃外、鼻腔、皮下、皮內或局部給藥本文所用術語腸胃外包括經皮、皮下、血管內(例如靜脈內)、肌肉內或鞘內注射或輸注技術等。
如本文所用，本文所揭示的RNA、或多核苷酸、或載體、或細胞或組成物的有效劑量是在待施用的個體中產生保護性免疫反應所需的劑量。受到SARS-CoV-2或其假病毒的挑激。可施用本文揭示的RNA、或多核苷酸、或載體、或細胞或組成物一次或多次。對疫苗的免疫反應可通過測量抗體的產生來進行接受RNA、或多核苷酸、或載體、或細胞或組成物的個體。以這種方式測量抗體產生的方法也是本領域眾所周知的，是預防、抑制發生或治療(減輕某種程度上的症狀，最好是疾病狀態的所有症狀)。病症、所用的組成物、給藥途徑、所治療的哺乳動物類型、所考慮的特定哺乳動物的身體特徵、同時用藥以及醫學領域的技術人員會認識到的其他因素。通常，量在0.1 mg/kg和100 mg/kg體重/天的活性成分根據配製的組成物的效力施用。在一些實施方案中，有效劑量的 RNA、或多核苷酸、或載體、或細胞或本文揭示的組成物是以至少21天、至少28天、至少35天、至少42天、至少49天、至少56天或至少64天的間隔施用兩次。
在進一步的方面，提供了一種吸入系統，其包含或可選地基本上由或進一步由本文揭示的RNA、本文揭示的多核苷酸、本文揭示的載體或本文揭示的組成物和噴霧器組成在進一步的實施方案中，噴霧器是用於整個呼吸道藥物遞送的便攜式噴霧器。
以足以遞送0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg的劑量水準給予RNA組成物至0.005mg/kg，0.05mg/kg至0.5mg/kg，0.01mg/kg至50mg/kg，0.1mg/kg至40mg/kg，0.5mg/kg至30mg/kg，0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、或1mg/kg至25mg/kg個體體重，每天一次或多次、每週、每月等獲得所需的治療或預防效果。所需的劑量可以每天三次、每天兩次、每天一次、隔日一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四個星期一次、每2個月、每3個月、每6個月等。在某些實施方案中，可以使用多次給藥(例如，兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次)來遞送所需劑量、十二、十三、十四或更多主管部門)。0.0075mg/kg，例如約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kg或約0.005mg/ kg。可以以足以遞送0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/ kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750的劑量水準給藥一次或兩次(或多次)mg/kg，或0.025mg/kg至1.0mg/kg。
RNA組成物可以有效劑量水準施用。在一些實施方案中，單劑量的疫苗組成物(例如，施用一次、兩次、三次或更多次)包含約10μg RNA。在一些實施方案中，單劑量的疫苗組成物(例如施用一次、兩次、三次或更多次)包含約20 μg RNA。單劑量的疫苗組成物(例如施用一次、兩次、三次或更多次)包含約40 μg RNA。)包含約50 μg RNA。在某些情況下(例如施用一次、兩次、三次或更多次)包含約100 μg RNA。在一些實施方案中，單劑量的疫苗組成物(例如施用一次、兩次、三次或更多次)包含至少25 pg RNA。在一些實施方案中，單劑量的疫苗組成物(例如施用一次、兩次、三次或更多次)包含少於100 μg RNA。一次、兩次、三次或更多次)包含100 μg或更少核糖核酸。
在一些實施方案中，給予個體的RNA總量為約10 μg、約20 μg、約30 μg、約40 μg、約50 μg、約100 μg、約200 μg、約250 μg或約500 μg在一些實施方案中，給予個體的RNA總量為約50 μg。在一些實施方案中，給予個體的RNA總量為約100 μg。個體為約250 μg。在一些實施方案中，總量施用於個體的RNA為約500μg。
在一些實施方案中，RNA組成物可以施用兩次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天，第0天和第150天，第0天和第180天，第0天和3個月後，第0天和6個月後，第0天和9個月後，第0天和12個月後，第0天和第18天個月後，第0天和2年後，第0天和5年後，或第0天和10年後)總劑量或劑量水準足以遞送總劑量0.0100mg、0.025mg、0.050mg，0.075毫克，0.100毫克，0.125毫克，0.150毫克，0.175毫克，0.200毫克，0.225毫克，0.250毫克，0.275毫克，0.300毫克，0.325毫克，0.350毫克，0.375毫克，0.400毫克，0.425毫克，0.447毫克、0.525毫克、0.550毫克、0.575毫克、0.600毫克、0.625毫克、0.650毫克、0.675毫克、0.700毫克、0.725毫克、0.750毫克、0.775毫克、0.800毫克、0.825毫克、0.850毫克、0.875毫克、0.900毫克、0.925毫克、0.950毫克、0.975毫克或1.0毫克。在本揭示的範圍內，例如，RNA組成物可以施用三或四次。 套組
一方面，提供了用於本文揭示的方法的套組。
在一些實施方案中，該套組包含，或可選地主要由以下組成，或還進一步由以下組成：使用說明書和一種或多種：如本文揭示的RNA、如本文揭示的多核苷酸、如本文揭示的載體、如本文揭示的組成物在進一步的實施方案中，套組適用於本文揭示的治療方法。
在一些實施方案中，該套組包含，或可選地主要由以下組成，或還進一步由以下組成：使用說明書和一種或多種：如本文揭示的RNA、如本文揭示的多核苷酸、如本文揭示的載體、如本文揭示的細胞在本文中，如本文所揭示的組成物、HKP或脂質任選地為陽離子脂質。
在一些實施方案中，該套組包含，或可選地基本上由，或還進一步由使用說明、如本文揭示的多核苷酸或載體、RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP和UTP或化學修飾的UTP組成。 在進一步的實施方案中，該套組適用於產生本文揭示的RNA或組成物的體外方法。
在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，包括以下實施例以證明本揭示的一些實施例、類似的結果。 實施例 實施例 1 ： RNA 合成：
合成本文揭示的測試RNA，例如使用本文揭示的載體和本領域技術人員可用的IVT套組(例如來自ThermoFisher Scientific的MAXIscript ™ T7轉錄套組)通過體外轉錄(IVT)，和然後通過在含有10mM HEPES (pH 7.2)、0.1mM EDTA、125mM NaCl、16%乙醇和纖維素纖維的含乙醇色譜緩衝液中將dsRNA選擇性結合到纖維素並離心純化。此後幾乎可以去除90%的dsRNA See, example, Baiersdorfer et.al , 2019, Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15;15:26-35. Contaminants could be eliminated using FPLC and HPLC, see, example, Kariko et.al , 2011 2011 Nov ;39(21):e142。 實施例 2 ：多肽 (HK 聚合物 ) 製備
HK肽聚合物由馬裡蘭大學的生物聚合物核心設施在Rainin Voyager合成儀(亞利桑那州圖森市)上合成。 實施例 3 ：體外製劑製備
PNI-Genvoy脂質奈米顆粒(LNP)製劑：使用GenVoy平臺和PNI NanoAssemblr (Precision NanoSystems，溫哥華，不列顛哥倫比亞省，加拿大)配製脂質奈米顆粒作為體外和體內測定中的陽性對照。
HKP(+H)配方版本1：HKP(+H) 儲備溶液 (10 mg/mL)在無核酸酶水中製備。濃縮儲備溶液在水中稀釋至2.5 mg/mL。mL)在1 mM中製備檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)。通過使用微流體混合等體積的2.5 mg/mL HKP(+H) 和1 mg/mL mRNA形成mRNA/HKP(+H)複合物。HKP(+H) 與mRNA的比率是2.5:1。mRNA/HKP(+H)複合物在使用前在室溫下孵育30分鐘。為了製備所有基於肽的複合物，在其轉染或注射之前用Zetasizer (Malvern Panalytical)確定大小。
HKP(+H)配方版本2：HKP(+H)儲備溶液(10 mg/mL)在無核酸酶水中製備。濃縮儲備溶液在水中稀釋至4 mg/mL。mL)在1 mM中製備檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)。通過混合等體積的4 mg/mL HKP(+H)和1 mg/mL mRNA形成mRNA/HKP(+H)複合物。HKP(+H)與mRNA的比例為4:1 . The mRNA/HKP(+H) polyplex was incubated for 30 minute at room temperature before use.在轉染或注射之前，用Zetasizer (Malvern Panalytical)測定每個基於肽的多聚物的大小。
HKP(+H)/DOTAP配方(後混合DOTAP)：在無核酸酶的水中製備HKP(+H)儲備溶液(10 mg/mL)。濃縮儲備溶液在水中稀釋至4 mg/mL。(Sigma-Aldrich)在水性緩衝溶液中濃度為1 mg/mL。在1 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中製備mRNA工作溶液(1 mg/mL)。首先通過混合等量物形成mRNA/HKP(+H)複合物體積為4 mg/mL HKP(+H)和1 mg/mL mRNA。mRNA/HKP(+H)複合物在室溫下孵育30分鐘。接下來，將相同體積的DOTAP加入HKP(+H)溶液添加到mRNA/HKP(+H)複合物中。HKP(+H)/DOTAP與mRNA的質量比為4:1:1。將mRNA/HKP(+H)/DOTAP奈米顆粒孵育30分鐘使用前室溫。
HKP(+H)/MC3或HKP(+H)/DOTAP 製劑(預混合MC3或DOTAP)：HKP(+H)儲備溶液(10 mg/mL)在無核酸酶水中製備。稀釋至4 mg/mL水溶液。DOTAP或MC3在水性緩衝溶液中濃度為1 mg/mL。mRNA工作溶液(1 mg/mL)在1 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中製備。等體積的HKP(+H)和MC3以4:1的質量比進行預混合，將相同體積的mRN與HKP(+H)溶液添加到預混合的HKP(+H)/MC3中。) /MC3奈米顆粒通過混合預混合形成4 mg/mL HKP(+H)/ 1mg/mL MC3和1 mg/mL mRNA。HKP(+H)/MC3與mRNA的質量比為4:1:1。mRNA/HKP(+H)/MC3奈米顆粒在使用前在室溫下孵育30分鐘。
HKP(+H)/PLA NP配方：HKP(+H)儲備溶液(10 mg/mL)在無核酸酶的水中製備。濃縮儲備溶液在水中稀釋至4 mg/mL。聚左旋乳酸在水中製備酸(PLA)奈米顆粒(5mg/mL)。在1 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中製備mRNA工作溶液(1 mg/mL)。等體積的HKP(+H)和mRNA在4:1質量比，將mRNA/HKP(+H)複合物在室溫下孵育30分鐘，然後將等體積的PLA奈米顆粒加入HKP(+H)溶液中，將mRNA/ HKP(+H)使mRNA/HKP(+H)複合物吸附在PLA奈米顆粒表面。HKP(+H)/PLA與mRNA的質量比為4:5:1。/PLA奈米顆粒孵育30分鐘使用前在室溫下。
簡而言之，工作區域用70%乙醇徹底清潔。每種脂質的4x儲備溶液在100%乙醇中製備並儲存在-20℃直至使用。脂質工作溶液通過將以下每種組分組合在比例為1:1:1:1(終濃度12.5mM)：可電離陽離子脂質((十七聚醣-9-基8-((2-羥乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)胺基)辛酸酯})SM-102等價物、輔助脂質(例如1,2-Distaroyl- sn-glycero-3磷酸膽鹼(DSPC))、膽固醇和 PEG2000-DMG(即1-甲氧基聚乙二醇-2,3-二肉荳蔻基甘油與聚乙烯平均分子量為2000的乙二醇。RNA工作溶液在配方緩衝液(50mM 檸檬酸鈉 pH4.0)中製備。RNA濃度取決於脂質濃度、流速比和N/P比。
製備RNA和脂質奈米顆粒：打開NanoAssemblr Ignite，從主菜單中選擇“快速運行”。通過選擇欄位、從下拉菜單中選擇值來設置參數， 如圖 1 所示或使用螢幕鍵盤輸入數字，然後點擊複選標記。打開Ignite的蓋子，確保墨水匣適配器安裝在墨水匣插槽的“L”入口上方，箭頭朝上，然後NxGen ™ cartridge從包裝中取出，***cartridge slot中，將旋轉塊升起，直到可以看到cartridge luer時，將至少1.5 mL製備好的RNA working solution吸入3mL注射器中，必要時使用鈍針取下針頭，清除注射器中的氣泡，並使用柱塞將液體推進到尖端。順時針方向接合Luer Lock。如果需要，使用鈍針將至少0.5 mL製備的脂質工作溶液吸入1 mL注射器。取出針頭，清除注射器中的氣泡，並使用柱塞推進液體到尖端。避免從注射器尖端滴水。將注射器***Ignite Cartridge的“R”入口。旋轉塊返回到向下位置。15 mL錐形收集管標有“RNA-LNP”，推入標有“Sample”的夾子。另一管標有“waste”，推入標有“Waste”的夾子。點擊螢幕上的“Next”，確認對話框中的參數和資訊。按下“開始”按鈕。然後Ignite™的推動器將流體注入微流體盒。標有標籤的管子“RNA-LNP”。在馬達將自身定位回原位後，螢幕指示何時可以安全打開蓋子。取出並立即放置一旁進行表徵和進一步處理。升起旋轉塊，注射器被取出從Ignite™上取下並丟棄。旋轉塊返回到向下位置，取出NxGen套組並丟棄。點擊後退“＜”按鈕返回快速運行螢幕，重複本段中描述的步驟，除了初始快速運行設置步驟。
為了表徵配製的脂質奈米顆粒(LNP)，進行以下製備，將25-50 μL的樣品部分與650 μL的超純水(Invitrogen)混合，並測量強度平均粒徑(Z平均值) ZetaSizer(馬爾文儀器公司)。
將樣品部分立即轉移到Slide-a-lyzer G2透析盒(10000 MWCO，Thermo Fischer Scientific Inc.)，並在4℃下對PBS(pH7.4)透析過夜。
LNP製劑使用Amicon超離心過濾器(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)濃縮，通過0.22-μm過濾器( Acrodisc )並儲存在4℃(PBS)。
還收集樣品級分並測量粒徑(透析後粒徑)。
Ribogreen Assay Kit(Thermo Fischer Scientific)測量最終mRNA濃度和包封效率(EE)。 實施例 4 ： mRNA 的體外轉染
為了驗證RNA的正確蛋白質表現，將本文揭示的EGFPmRNA或測試的RNA瞬時轉染到人胚腎293T細胞(293T細胞)中。簡而言之，將4.8X10 5個細胞接種到含有2ml的6孔板中DMEM(10%胎牛血清和1%青黴素-鏈黴素(ThermoFisherScientific))。24小時後，當細胞70-90%融合時，使用Lipofect MessengerMAX Transfection Reagentamine (ThermoFisher Scientific)按照說明書操作。將轉染的293T細胞培養兩天，然後測量體外蛋白表現。
還檢查了本文揭示的各種製劑/載體將EGFPmRNA或測試的RNA攜帶到靶宿主細胞(例如人胚腎293細胞(HEK293細胞))中的能力。簡而言之，將4.8X10 5個細胞鋪板放入含有2mlDMEM(10%胎牛血清和青黴素-鏈黴素(ThermoFisher Scientific))的6孔板中。24小時後，當細胞達到70-90%匯合時，加入含有EGFP mRNA或測試 RNA的製劑/載體如本文所揭示的，將293T細胞培養兩天，然後測量體外蛋白表現。 實施例 5 ：體外蛋白表現測量
免疫螢光分析：轉染後兩天，使用Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(Biotek，Winooski，VT)通過免疫螢光成像測量蛋白質表現。
細胞裂解物製備：轉染後兩天，吸出培養基並用冰冷的PBS在冰上洗滌細胞。加入含有蛋白酶抑制劑(ThermoFisher Scientific)的冰冷裂解緩衝液(RIPA，ThermoFisher Scientific)並孵育細胞4℃30分鐘。然後使用細胞刮刀收集細胞並通過超聲裂解。在4℃下以10,000g離心20分鐘沉澱細胞碎片，並將上清液轉移到新的微量離心管中。通過用於蛋白質印蹟的Bradford或BCA蛋白質測定來確定。
蛋白質印跡：簡而言之，在凝膠的每個孔中，將20-50µg蛋白質與4X SDS樣品緩衝液(ThermoFisher Scientific)、10X還原緩衝液(ThermoFisher Scientific)和額外的ddH 2O(ThermoFisher Scientific)混合，總計上樣量為25µl/孔。混合物在95℃下加熱5分鐘變性，然後冷卻至室溫並離心，然後上樣到NUPAGE™4至12%，Bis-Tris凝膠(ThermoFisher Scientific)。電泳分離後，將凝膠從盒中取出並使用IBLOT™2乾式印跡系統(ThermoFisher Scientific)進行轉移。轉移的膜在TBST中用5%脫脂奶粉在室溫(RT)中封閉1小時，與初級孵育抗體在4℃過夜，用TBST(TBS中的0.05% Tween20)緩衝液洗滌3次，並與二抗孵育1小時，二抗是HRP偶聯的小鼠IgG (H+L)二抗(ThermoFisher Scientific，A24512)RT.轉移膜i然後由Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher Scientific)開發，並使用化學發光成像系統成像。
在一些實施方案中，一抗特異性識別並結合SARS-CoV-2的S蛋白或其片段，例如S2蛋白或S蛋白的RBD或兩者。因此，測試的RNA表現到其在進一步的實施方案中，進行了蛋白質印蹟的上樣對照。例如，使用如上所述的蛋白質印跡測試相同的樣品，除了一抗特異性識別並結合β-肌動蛋白。組間的蛋白質水準在加載控制。
具有不同多腺苷酸尾巴的RNA，例如40mer多腺苷酸(本文稱為“多腺苷酸40”)或60-60多腺苷酸(參見“多腺苷酸60”)被合成、純化、轉染至細胞並測試蛋白質表現。簡而言之，包含β-球蛋白5'的DNA構建體和3' UTR、藍色螢光蛋白2(BFP2)編碼序列和不同的合成多腺苷酸尾由Twist Bioscience合成。卡那黴素選擇標記、pUC57主鏈和T7啟動子使質體具有體外轉錄(IVT)能力IVT如前所述進行。將RNA轉染到HEK293T細胞中，並使用來自BioTek的Citation 5顯微鏡觀察藍色螢光蛋白(BFP)螢光強度。結果顯示在圖2中 。圖 2A-2C提供了顯示BFP螢光的代表性圖像，而 圖 2A-2C提供相應的亮場圖像。
此外，合成、純化、轉染至細胞並測試蛋白質表現的具有各種UTR(例如本文揭示的β-球蛋白UTR或SYS UTR)的RNA。簡而言之，合成了包含不同5'UTR和BFP2的DNA構建體由Twist Bioscience提供。構建體進一步包含質體主鏈，質體主鏈包含卡那黴素選擇標記、pUC57主鏈和T7啟動子，或主要由卡那黴素選擇標記組成，或進一步由其組成，以使質體具有體外轉錄(IVT)能力。並純化後，如前所述進行IVT。使用MessengerMax轉染試劑(Thermofisher)將RNA轉染到HEK293T細胞中，並使用BioTek的Citation 5顯微鏡測量BFP螢光強度。在不同時間點比較不同的5'UTR。參見， 圖 3.誤差條表示3次重複的標準偏差。 實施例 6 ：與人類 ACE2 結合
進一步研究了由本文揭示的測試RNA表現的S蛋白、其變異體及/或突變體與其在人類細胞(例如人類ACE2)上的受體之間的結合。例如，細胞(例如HEK293T (Cat# CRL-3216, ATCC)或a549(Cat# CCL-185, ATCC))轉染被測RNA並表現S蛋白、其變異體及/或突變體與直接或間接標記有螢光蛋白的人ACE2孵育，例如可選地洗滌孵育的細胞以去除未結合的ACE2。進行流式細胞術並定性測量每個細胞的平均螢光強度(MFI)。MFI越高，ACE2與細胞結合越多，表明結合越強(ACE2和細胞表現的S蛋白、其變異體及/或突變體之間的結合親和力，例如顯示出更高的結合親和力。 實施例 7 ：體內動物模型和注射
進行了體內研究，簡而言之，將6-8週齡雌性BALB/C隨機分為每組，每組4隻小鼠，並在右側肌肉注射30µg不同配方的EGFP mRNA。還準備了測試的RNA用於體內分析和抗體效價測量和結合。
在第28天，進行第二次加強免疫注射，並在第35天收集血清並通過免疫測定(ELISA)分析以測量抗體效價。 實施例 8 ：體內動物模型。
其他合適的動物模型可用於研究本文揭示的製劑/載體中的測試RNA，並評估其用於本文揭示的方法和單獨治療或與其他可能的治療(例如抗炎治療)聯合治療的效率。
在一個例子中，本文使用的是一種基因修飾的動物模型，其表現人ACE2可選地在組織特異性啟動子(例如，上皮細胞的Krt18啟動子；K18-hACE2小鼠)或通用啟動子(钜細胞病毒增強子，然後是雞)下β-肌動蛋白啟動子)或小鼠內源性Ace2啟動子。所有這些小鼠都易受SARS-CoV-2感染，但它們表現人類ACE2的差異導致輕度至致命疾病的致病範圍。該動物是小鼠，替代動物模型包括敘利亞倉鼠，其ACE2與人類非常相似，被認為易感染SARS-CoV-2；雪貂；和非人類靈長類動物。
假病毒挑激之前或同時，向動物施用RNA組成物，例如本文揭示的製劑/載體中的測試RNA。至少一次或兩次。RNA組成大約相隔兩到三週。未受到SARS-CoV-2或假病毒挑激的動物用作陰性對照，而那些受到SARS-CoV-2或假病毒挑激的動物使用了其他對照，例如經過處理的動物使用本領域已知的SARS-CoV-2疫苗，例如可從Pfizer-BioNTech獲得的BNT162b2、可從Moderna獲得的mRNA-1273或來自強生公司的Janssen的JNJ-78436735，並用SARS-CoV-2或假病毒。
病毒載量、肺部病理學、肺部免疫細胞浸潤、細胞因數釋放、體重、皮毛、姿勢、呼吸窘迫(如呼吸困難)、是否嗜睡、流鼻涕、喘息、口咽黏液積聚、打噴嚏、在施用RNA組成物後監測稀便等以評估效果。 實施例 9 ：確認轉染了修飾或未修飾的 SARS-CoV-2 棘 mRNA 候選疫苗的 A549 細胞分泌 I 型干擾素 (IFN-α 和 IFN-β ) 。
進行實驗以測試病毒RNA傳感通路是否啟動轉染SARS-CoV-2棘mRNA(SBI)的A549細胞的先天免疫，導致IFN-β的產生並隨後抑制SARS-CoV-2S蛋白轉譯將相同的實驗設置應用於表現SARS-CoV-2S蛋白(野生型或包含S2P或S6P突變)的RNA，例如編碼野生型SARS-CoV-2S蛋白的RNA(標記為“SARS-CoV-2 Spike WT (SBI)”)，一種編碼野生型SARS-CoV-2 S蛋白的RNA，該RNA的所有尿苷殘基都經過化學修飾，可選地修飾為假尿苷，進一步可選地修飾為N1-甲基假尿苷(標記為作為“SARS-CoV-2 Spike WT(100%修飾)”)，一種編碼SARS-CoV-2 S蛋白的RNA，它是一種野生型，在K986P和V987P處發生突變，至少有一個RNA的尿苷殘基經過化學修飾，任選地假尿苷，進一步任選地N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike S2P WT”)，R編碼SARS-CoV-2 S蛋白的NA，它是一種野生型，在D614G、K986P和V987P處發生突變，RNA的至少一個尿苷殘基被化學修飾，任選為假尿苷，進一步任選為N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike S2P D614G”)，一種編碼SARS-CoV-2 S蛋白的RNA，它是一種在D614G突變的野生型，RNA的至少一個尿苷殘基被化學修飾，任選為假尿苷，進一步任選為N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike D614G WT”)，一種序列優化的RNA，編碼SARS-CoV-2 S蛋白，是一種在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P處發生突變的野生型RNA的至少一個尿苷殘基經過化學修飾，可選地修飾為假尿苷，進一步可選地修飾為N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike S6P(RNAimmune)”)，一種編碼SARS-CoV- β變異體的RNA 2 S蛋白首先在南非發現，並在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P至少有一個RNA的尿苷殘基經過化學修飾，可選為假尿苷，進一步可選為N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike S6P_SA”)，一種序列優化的RNA，編碼β SARS-CoV-2 S蛋白的變異體首先在南非發現，並在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P處進一步突變，RNA的至少一個尿苷殘基經過化學修飾，可選為假尿苷，進一步可選為N1-甲基假尿苷(標記為“SARS-CoV-2 Spike S6P_SA_GS”)，或編碼SARS-CoV-2 S蛋白的RBD的RNA，該RNA的至少一個尿苷殘基被化學修飾，任選為假尿苷，進一步任選到N1-甲基假尿苷(標記為“RBD”)。參見下表中的更多詳細資訊。在進一步的實施方案中，野生型SARS-CoV-2 S蛋白包含，或基本上由，或進一步由如下多肽組成在SEQ ID NO: 1中列出。
此外，將相同的實驗設置應用於本文揭示的製劑/載體中的測試RNA。 材料和方法
用編碼以下之一的RNA瞬時轉染293T細胞，並以約1:3的RNA與脂質比例配製：SARS-CoV-2 Spike WT(SBI)、SARS-CoV-2 Spike WT(100%修飾)、SARS-CoV-2尖峰S2P WT、SARS-CoV-2尖峰S2P D614G、SARS-CoV-2尖峰D614G WT、SARS-CoV-2尖峰S6P(RNA免疫)、SARS-CoV-2尖峰S6P_SA、SARS-CoV-2尖峰S6P_SA_GS，或RBD。
2 ml A549細胞以2.5x10 5個細胞的密度接種到12孔板中。細胞在5%CO 2培養箱中於37℃孵育24小時。I. 7.5µl Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen, Cat # LMRNA008)也被稀釋並在室溫下孵育10分鐘。將稀釋的mRNA混合物添加到稀釋的脂質中。在室溫下孵育5分鐘。將mRNA-脂質複合物加入到細胞中，在37℃的5%二氧化碳培養箱中培養24小時。
ELISA 檢測 IFN-α 是使用VeriKine Human IFN-α ELISA Kit (Cat 41100, pbl assay science) 進行的。一個新的試管，並在-80℃下保存直到使用。
生成標準曲線：構建了12.5-500 pg/ml的高靈敏度標準曲線或156-5000 pg/ml的擴展範圍標準曲線。六個聚丙烯管(S1-S6)被標記並填充有250µl稀釋緩衝液。聚丙烯吸頭用於將人IFN-α標準品添加到S6中並輕輕混勻。在每次稀釋之間更換吸頭。從S6中取出250µl並添加到S5中。( 圖 4) 。
使用VeriKine Human IFN-β ELISA Kit (Cat41410, pbl assay) 進行ELISA檢測IFN-β。新管並儲存在-80℃直至使用。
生成了標準曲線：標記了七個聚丙烯管(S1-S7)。使用聚丙烯吸頭，將250 µl標準稀釋液添加到每個管中，除了S7，其中添加了492.5 µl標準稀釋液。10 µl人IFN-β標準品是加入90 μl Standard Diluent，7.5 μl預稀釋標準品加入S7，充分混勻。250 μl S7轉移到S6，充分混勻。reset S5-S1同系列稀釋，備用。
確定測試所需數量的樣品所需的微孔板條的數量加上運行空白和標準品所需的適當孔數。將100μl干擾素標準品、空白或樣品添加到每個孔中，用板密封劑覆蓋並孵育1小時。1小時後，倒空板中的內容物，僅洗滌孔一次_用稀釋的Wash Buffer每孔加入100 μl稀釋的Antibody Solution，蓋上封板，孵育1小時。1小時後，倒空板中的內容物，用稀釋的Wash Buffer清洗各孔3次。緩衝液。每孔加入100 μl稀釋的HRP溶液，蓋上封板器並孵育1小時。在此孵育期間，將TMB底物溶液升溫至室溫(22-25℃)。內容物清空平板並洗滌孔四次_用稀釋的洗滌緩衝液。將100 μl TMB底物溶液添加到每個孔中，並在室溫(22-25℃)下避光孵育15分鐘。孵育期間不使用封板劑。15分鐘TMB孵育後，每孔加入100 μl Stop Solution，加入Stop Solution後5分鐘內用酶標儀測定450 nm處的吸光度。
在一些實施方案中，293T細胞用本文揭示的製劑/載體中的測試RNA瞬時轉染，例如使用如上所述的轉染方法。測量轉染細胞的IFN-α和IFN-β釋放，例如，使用如上所述的方法。 結果
為評估A549細胞的IFN-α和IFN-β分泌，如本文所述進行ELISA。對代表性的ELISA板進行拍照並 顯示在 圖 1 中。數據表明干擾素-α(IFN-α或IFN-α)僅由轉染未修飾的SARS-CoV-2棘mRNA(SBI)的A549細胞分泌，轉染未修飾的SARS-CoV-2棘mRNA(SBI)的A549細胞分泌的干擾素-β(IFN-β或IFN-β)、S2P WT、D614G WT和S6P_SA。 結論
干擾素-α僅從轉染未修飾的SARS-CoV-2棘mRNA(SBI)的A549細胞中分泌。干擾素-β從轉染了編碼SARS-CoV-2棘WT(SBI)或SARS的未修飾RNA的A549細胞中分泌-CoV-2 Spike S2P WT，或SARS-CoV-2 Spike D614G WT，或SARS-CoV-2 Spike S6P_SA。因此，在不希望受理論束縛的情況下，在轉染有編碼SARS-CoV-2 Spike WT(SBI)的未修飾RNA(數據未顯示)可能是由抑制棘蛋白轉譯的強cGAS-STING通路(先天免疫)的啟動引起的。 實施例 10 ：在 K18-hACE2 小鼠中評估 SARS-CoV-2 棘 mRNA 疫苗針對 SARS-CoV-2 的致免疫性和功效。
從傑克遜實驗室購買了總共四十(40)只六至八周大(6-8)的雌性K18-hACE2小鼠。所有動物實驗均在Noble Life Science與喬治梅森大學(GMU)合作進行該研究在沒有質量保證部門直接參與的情況下進行，但遵守適用的NLS SOP，並遵循GMU生物醫學研究實驗室動物護理和使用機構委員會(IACUC)的指南和批准。小鼠被分配到四(4)組。由十(10)隻小鼠組成，每隻小鼠經過一個適應期。 表 3顯示了SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020挑激的劑量組。 表 4顯示了ARS-CoV-2 B.1.1617.2的劑量組δ變異體。在第0天和第14天，第一組(1)和第二組(2)、三(3)和四(4)組的小鼠肌肉內接種載體，肌肉內接種遞增劑量的代表性的RL-007 mRNA疫苗製劑，根據實施例3，包含SEQ ID NO: 52。該疫苗製劑命名為“RV-1730”並使用RL-007載體。在第-1、13和27天從小鼠身上採集血液，並將血清樣本用於噬菌斑-還原中和試驗(PRNT)。在第28天，用5.5x104PFU/小鼠SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020野生型變異體(NLS-GMU-WB2-042121)對動物進行鼻內挑激(圖8A和圖8B)或1.5x104PFU/小鼠SARS-CoV-2 B.1.1617.2 Delta變異體( 圖 8C和 圖 8D)。十三(13)天的溫度和痛苦臨床症狀評分挑激後。臨床嚴重程度評分＞10或體重減輕＞挑激前體重的20%的小鼠被人道處死並記錄為非倖存者。存活的小鼠在挑激後十三(13)天被安樂死。一部分肺組織是從安樂死的小鼠身上採集的，放入10%的福爾馬林中並運送到Histoserv用於他的通過H&E染色進行的病理學分析。
小鼠在死亡率、痛苦的臨床症狀、體重和體溫的挑激後長達十四(14)天內每天被監測。根據GMU-IACUC批准的動物研究，每天記錄每隻小鼠的臨床痛苦的嚴重程度評分臨床監測圖表( 表 5)。簡而言之，四(4)個可觀察表型類別1)外觀、2)活動能力、3)態度、4)呼吸窘迫和身體的評分從0(正常)到3(重病)每天記錄每隻小鼠的體重。累計得分為10分或更高的小鼠將被人道處死。
使用空斑減少中和滴定(PRNT)評估在研究第-1天、第13天和第27天收集的血清樣本的中和效價。所有血清在測試前通過在56℃下孵育30分鐘進行熱滅活。二-在EMEM中製備每種血清的倍數稀釋液。稀釋範圍從1:4到1:3200，並根據不同時間點和治療組增加的中和活性進行調整。25微升(25將每個稀釋液的μL)與25μL的SARS-CoV-2 B.1.1617.2 Delta變異體BEI：NR-55672病毒原液混合，並在37℃下孵育一(1)小時。從Vero中取出上清液-E6細胞在前一天晚上接種在12孔板中，並在每個孔中替換為300 μL Eagle最低必需培養基(EMEM)。將孵育病毒+稀釋的血清混合物添加到Vero E6單層頂部，板在37℃/5% CO 21小時。孵育期間每10-15分鐘搖動一次。孵育1小時後，將含有2X EMEM和0.6%瓊脂糖的1.5 ml覆蓋層以1:1的比例添加到平板中。孵育瓊脂糖在室溫下固化後，在37℃/5% CO 2條件下72小時 。孵育後，通過將0.5ml 10%甲醛添加到瓊脂糖頂部的每個孔中並在室溫下孵育過夜來固定細胞。輕輕去除瓊脂糖，細胞單層染色10至添加0.5 ml 1%結晶紫15分鐘。染色後，用水清洗板以去除多餘的染色液，並手動計算每個病毒稀釋度的噬菌斑。中和效價計算為最低稀釋度的倒數導致pfu減少50%以上(PRNT 50)或減少90% (PRNT 90)。(斑塊形成單位)相對於陰性對照血清。使用從兩隻完全接種疫苗的雄性收集的人血清和從幼稚小鼠收集的血清分別作為陽性和陰性對照。
結果：所有用RL-007免疫的小鼠(第2、3和4組小鼠)均未表現出臨床症狀嚴重程度的增加相比之下，第1組小鼠在SARS-CoV-2挑激後表現出臨床症狀嚴重程度急劇增加( 圖 7)。SARS-CoV-2棘mRNA疫苗顯示對第2、3或4組沒有影響小鼠體重( 圖 8A)。在SARS-CoV-2挑激後，給予所有用SARS-CoV-2棘mRNA疫苗免疫的小鼠(第2、3和4組小鼠)的小鼠與對照組相比沒有表現出體重變化(第1組)小鼠，在SARS-CoV-2挑激後至少四天表現出體重下降( 圖 8B)。在用SARS-CoV-2 B .1.1617.2 Delta變異體進行病毒挑激後觀察到類似的趨勢 圖 8C和 圖 8D) 。小鼠體溫遵循相似的趨勢，其中SARS-CoV-2棘mRNA疫苗免疫的小鼠在SARS-CoV-2挑激後的幾天內表現出穩定的體溫，而對照小鼠的體溫下降病毒挑激後至少五天( 圖 9)。所有SARS-CoV-2spikemRNA疫苗接種的小鼠在SARS-CoV-2挑激後至少存活了13天( 圖 10)。10%的對照小鼠在挑激後至少存活了8天( 圖 10)。高中和抗體在免疫後至少13( 圖 11A和 圖 11B)和27( 圖 11C和 圖 11D) 天觀察效價。
結論：這些數據表明，本文提供的SARS-CoV-2棘mRNA疫苗能夠預防個體出現SARS症狀( 例如，臨床體徵嚴重程度、體溫變化及/或體重變化)或有症狀的SARS-CoV-2感染。如本文所示，用SARS-CoV-2棘mRNA疫苗進行免疫能夠在個體中誘導對SARS-CoV-2的免疫反應， 例如，在免疫至少13天後增加針對SARS-CoV-2的中和抗體效價或至少27天。因此，所提供的SARS-CoV-2棘mRNA疫苗可以治療感染SARS-CoV2的個體，並降低個體的SARS-CoV-2病毒載量。 實施例 11 ：鼻道和肺組織中的病毒效價。
收集每隻被安樂死的小鼠的一部分右肺組織並放入10%福爾馬林中。從ABSL3中取出用福爾馬林固定的肺組織樣本並運送到Histoserv(19526 Amaranth Dr, Germantown, MD 20874)進行組織病理學檢測。將在挑激後第3天指定安樂死的每隻小鼠放入細胞培養基中，以分析肺組織中的病毒效價。在來自每組三(3)的五隻小鼠(5)中測定鼻道和肺組織中的病毒效價病毒挑激後天數。通過吸入異氟醚麻醉小鼠，並從每隻小鼠收集總體積為100mL的無菌鼻洗緩衝液中的鼻洗液，用於測定上呼吸道中的病毒複製和脫落(pfu/mL)。在重度麻醉下人道地處死小鼠並收集肺組織。將來自右肺葉的組織置於組織培養基中，均質化。d並用於確定下呼吸道中的病毒效價。在EMEM中製備每種鼻洗液或肺勻漿的系列十倍稀釋液。從前一天晚上接種在12孔板中的Vero-E6細胞中取出上清液，並用每孔加入300μL稀釋的鼻洗液或肺勻漿。將板在37℃/5%CO 2下孵育1小時。孵育期間每10-15分鐘搖動一次板。孵育一小時後，1.5 mL覆蓋層包含2X EMEM和0.6%瓊脂糖按1:1的比例加入到平板中。瓊脂糖在室溫下凝固後，平板在37℃/5% CO 2下孵育72小時。孵育後的細胞通過加入0.5 mL固定將10%甲醛加入瓊脂糖頂部的每個孔中，並在室溫下孵育過夜。輕輕移除瓊脂糖調色板，加入0.5 ml 1%結晶紫對細胞單層染色10至15分鐘。染色後，t用水清洗板以去除多餘的染色溶液，並手動計算每個病毒稀釋度的噬菌斑。病毒效價計算為pfu/ mL。
結果和結論：圖 13顯示了在SARS-CoV-2挑激後13天採集的代表性肺組織的組織病理學圖像。組織病理學評分是根據肺總評分、間質性肺炎和血管周圍袖帶確定的( 圖 12)與野生型小鼠相比，用SARS-CoV-2棘mRNA疫苗免疫的小鼠在這三種測量中的每一種的平均組織病理學評分都較低，這表明SARS-CoV-2棘mRNA疫苗提供了針對組織水準症狀和損傷發作的保護作用SARS-CoV-2感染。 實施例 12 ：用 RL007 免疫的血清的致免疫性 。
為了評估SARS-CoV-2δ變異體RV-1730在小鼠中的致免疫性，將6至8周大的幼稚雌性BALB/c小鼠隨機分成5至8只一組，並通過皮內注射RL007進行疫苗接種(每隻小鼠1、5、10和20µg)。所有小鼠以21天為間隔免疫兩次。在第一次免疫後14天和35天通過尾部採血或心臟穿刺在每次免疫前採血。4℃，然後在4℃下以10,000xg離心10分鐘收集血清。樣品在4℃下儲存直至進一步分析。為了確定S1和RBD特異性血清IgG效價，MaxiSorp板(BioLegend)在4℃下用碳酸鈉緩衝液中的100µl重組S1或RBD(1µg/ml)包被過夜。用PBS-T洗滌孔3次，並在室溫下將板與200µl封閉緩衝液一起孵育2小時，用PBS-T洗滌3次後，將板與100μl血清孵育2小時。PBS-T洗板5次，HRP標記二抗室溫孵育1小時。最後，PBS-T洗板5次，加入100 μl 1x TMB底物孵育10分鐘。加入100 µl 1N-HCl終止反應，並使用Cytation7在450 nm處讀數。對於倒數終點IgG效價，將2倍連續稀釋的血清添加到用不同棘蛋白固定的孔中。是相同的如上所述。
結果和結論：在第一次和第二次免疫劑量後觀察到RL007免疫血清針對不同變異體棘蛋白的終點IgG效價增加( 圖 17)。因此，SARS-CoV-2棘mRNA疫苗能夠在個體中誘導針對不同SARS-CoV-2變異體棘蛋白的免疫反應， 例如，在第一次和第二次免疫接種後增加針對SARS-CoV-2的IgG效價至少14天或至少35天的期限。 實施例 13 ： RL007 免疫血清中和抗體效價的測定 。
為了確定中和抗體的效價(titer)，我們首先產生了SARS-CoV-2-Psudovirus粒子。簡而言之，在HEK293T(Cat# CRL-3216, ATCC)細胞中，按照以前對SARS-CoV1,2描述的流程，經過一些修改，產生了帶有SARS-CoV-2棘蛋白構建的鼠白血病病毒(MLV)顆粒假型。所有的質粒DNA都是用ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit(Cat# D4201, Zymo Research)純化的。簡而言之，將800萬HEK293T細胞放入一個10厘米的組織培養皿(Cat# sc-251460，Santa Cruz)中，在16毫升DMEM(Cat# 25-500，Genesee Scientific)+10% FBS(Cat# 35-010-CV，Corning Life Sciences)中，沒有任何抗生素。第二天，使用Lipofectamine 3000試劑(Cat# L3000015, ThermoFisher)將8µg pTG-Luc、6µg pCMV-MLVg-pol和6µg pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike-C19的不同變體轉染細胞。細胞又被培養了48小時。將上清液收集到一個50毫升的獵鷹管中，以290×g的速度旋轉7分鐘。然後用適當的注射器將上清液(假型病毒溶液)通過0.45 μm過濾器(Cat# sc-358814, Santa Cruz)。然後將假型病毒溶液等分到低溫瓶中，儲存在-80℃。每個10厘米的細胞培養皿產生大約16毫升SARS-CoV-2-PP。SARS-CoV-2-PP是用HEK293-ACE2細胞系(在Codex BioSolutions創建)進行質量控制測試的。為了對假病毒進行中和試驗，將血清在56℃下孵育30分鐘，使其熱滅活。感染前一天，將7.5 x 103個HEK293-ACE2細胞放入384孔白色透明板(Cat# 353963，康寧生命科學公司)，在15微升培養基(DMEM+10% FetalClone II血清，Cat# SH3006603，Fisher Scientific)中預塗有Poly D Lysine(Cat# 3439-100-1，Trevigen, Inc)。細胞板被放置在二氧化碳培養箱中(37°C)。第2天，將待測血清稀釋在96孔複合板的培養液中。將65微升SARS-CoV-2 MLV假病毒顆粒(pp)與26微升上述製備的測試樣品混合，在37℃下孵育1小時。384孔細胞板每孔的培養基去除後，在每孔中加入17.5微升的每種血清-pp混合物。IC 50值是根據GraphPad Prism中的曲線擬合計算的(數據被歸一化為傳染性百分比)。
結果和結論：在第一次和第二次免疫劑量後測量針對SARS-CoV-2假病毒顆粒的中和抗體效價。根據曲線擬合計算IC 50值。觀察菌株特異性中和。曲線和IC 50值如圖所示在 圖 18A、 圖 18B、 圖 19A中，和 圖 19B。IC 50值列於 圖 20中，對於所提供的每個中和測定條件。-2變異體棘蛋白在感染SARS-CoV-2的個體中通過 例如增加針對SARS的中和抗體效價-在第一次和第二次免疫接種後至少14或35天後出現CoV-2。這些數據表明，本文提供的SARS-CoV-2棘mRNA疫苗能夠在感染SARS-CoV-2的個體中誘發針對不同SARS-CoV-2變異棘蛋白的免疫反應，例如，在第一和第二免疫劑量後至少14天或35天增加針對SARS-CoV-2的中和抗體效價。 實施例 14 ：細胞內細胞因數染色。
收集小鼠脾臟並在補充有10%熱滅活胎牛血清和青黴素/鏈黴素(R10培養基)的RPMI1640培養基中加工成單細胞懸浮液。使用RBC裂解緩衝液(KD Medical)裂解紅細胞並重懸於R10培養基以停止裂解。對脾細胞進行計數並將每孔200,000個細胞添加到96孔板中。然後在37℃下用2 µg PepMix ™ SARS-CoV-2 (Spike B.1.617. 2/Delta) (JPT Peptide Technologies GmbH)或單獨的培養基作為陰性對照。將板離心，收集液體並冷凍在-80℃下用於細胞因數檢測。使用Luminex100/200多重珠基技術(Luminex)測定法對小鼠11重套組分泌的細胞因數進行測量和分析 標本稀釋2倍後的儀器(Luminex)。
結果與結論：72小時後，通過離心收集培養物上清液，分泌的Th1細胞因數(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2細胞因數(IL-4、IL-5、IL-13))被測量。用SARS-CoV-2S蛋白刺激會增加Th1細胞因數(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2細胞因數(IL-4、IL-5、IL-13)的分泌所有SARS-CoV-2棘mRNA疫苗處理的小鼠( 圖 14)。這些數據表明，本揭示的SARS-CoV-2棘mRNA疫苗在通過 例如誘導針對SARS-CoV-2感染的細胞因數釋放而感染SARS-CoV-2的個體。 實施例 15 ： 脾細胞的 IFN-γ ELISPOT 分析 。
收集小鼠脾臟並在補充有10%熱滅活胎牛血清和青黴素/鏈黴素(R10培養基)的RPMI1640培養基中加工成單細胞懸浮液。使用RBC裂解緩衝液(KD Medical)裂解紅細胞並重懸於R10培養基停止裂解。對脾細胞進行計數，在6孔板中每孔200,000個細胞，並將其添加到小鼠IFN-g的板中ELISpotPLUS(HRP)套組(Mabtech)。然後在37℃下用2µg PepMix ™ SARS-CoV-2 (Spike B.1.617.2/ Delta) (JPT Peptide Technologies GmbH)或單獨的培養基刺激細胞16小時根據製造商的說明開發斑點。斑點通過Cytation7量化並顯示在 圖 15A中。
結果和結論：與未接種疫苗的對照小鼠相比，SARS-CoV-2棘mRNA疫苗接種小鼠的細胞中存在增加量的IFN-γ斑點( 圖 15B和 圖 15C)。本揭示的棘mRNA疫苗可誘導個體中針對SARS-CoV-2的免疫反應， 例如通過增加個體中的IFN-γ水準。 實施例 16 ： 記憶 T 細胞的 Th1/Th2 細胞因數分析 。
在用對應於S蛋白的肽庫(S1和S2)重新刺激後，使用Th1/Th2細胞因數11-plex小鼠原心複合體組對來自RV-1730免疫小鼠的脾細胞培養物上清液中分泌的細胞因數進行了評估。九週加強後，從每組5隻小鼠中分離出脾細胞，並在存在蛋白質轉運抑制劑混合物的情況下，用無肽或來自SARS-CoV-2S蛋白的重疊肽池重新刺激。16小時後，細胞內細胞因數染色(ICS)用於量化CD4 +和CD8 +T細胞反應。
結果和結論：CD4 +/IFN-γ與未接種疫苗的對照小鼠相比，來自SARS-CoV-2棘mRNA疫苗接種小鼠的脾細胞培養物中的CD8 +/IFN-γT細胞反應增加( 圖 16)。本揭示的SARS-CoV-2棘mRNA疫苗可以在個體中誘導針對SARS-CoV-2的免疫反應， 例如通過增加CD4 +/IFN-γ和CD8 +/IFN-γT細胞在個體中的反應。RV-1730誘導強大的中和活性和CD8T細胞反應、平衡的Th1/Th2抗體同種型反應，以及通過SARS-CoV-2棘蛋白肽的 離體刺激從T細胞釋放細胞因數。強大的細胞免疫反應提供了獨特的不僅能夠使用RV-1730對抗當前/現有的SARS-CoV-2變異體和其中的後代譜系，而且能夠實施RV-1730對抗未來可能出現的任何新的SARS-CoV-2變異體。
SEQ ID NO: 1，S蛋白之胺基酸序列： MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISN CVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVN FNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP GTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQE VFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDC LGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAM QMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRA SANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDP LQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 2，包含下列者之S蛋白之胺基酸序列D614G (以粗體加上底線標記)及S6P突變(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P，以粗體及斜體加上底線標記)： MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISN CVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP GTNTSNQVAVLYQ G VNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQE VFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRS P IEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDC LGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAG P ALQIPF P M QMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSST P SALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRA SANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 3，未經最佳化之DNA序列，其編碼SEQ ID NO: 2： ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTTCGCGGGCAGGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCACCTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTCCTGCATTACAAATACCATTTCCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACACCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACCCACCTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA
SEQ ID NO: 4，未經最佳化之RNA序列，其編碼SEQ ID NO: 2： AUGUUUGUUUUUCUUGUUUUAUUGCCACUAGUCUCUAGUCAGUGUGUUAAUCUUACAACCAGAACUCAAUUACCCCCUGCAUACACUAAUUCUUUCACACGUGGUGUUUAUUACCCUGACAAAGUUUUCAGAUCCUCAGUUUUACAUUCAACUCAGGACUUGUUCUUACCUUUCUUUUCCAAUGUUACUUGGUUCCAUGCUAUACAUGUCUCUGGGACCAAUGGUACUAAGAGGUUUGAUAACCCUGUCCUACCAUUUAAUGAUGGUGUUUAUUUUGCUUCCACUGAGAAGUCUAACAUAAUAAGAGGCUGGAUUUUUGGUACUACUUUAGAUUCGAAGACCCAGUCCCUACUUAUUGUUAAUAACGCUACUAAUGUUGUUAUUAAAGUCUGUGAAUUUCAAUUUUGUAAUGAUCCAUUUUUGGGUGUUUAUUACCACAAAAACAACAAAAGUUGGAUGGAAAGUGAGUUCAGAGUUUAUUCUAGUGCGAAUAAUUGCACUUUUGAAUAUGUCUCUCAGCCUUUUCUUAUGGACCUUGAAGGAAAACAGGGUAAUUUCAAAAAUCUUAGGGAAUUUGUGUUUAAGAAUAUUGAUGGUUAUUUUAAAAUAUAUUCUAAGCACACGCCUAUUAAUUUAGUGCGUGAUCUCCCUCAGGGUUUUUCGGCUUUAGAACCAUUGGUAGAUUUGCCAAUAGGUAUUAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGCACUUGACCCUCUCUCAGAAACAAAGUGUACGUUGAAAUCCUUCACUGUAGAAAAAGGAAUCUAUCAAACUUCUAACUUUAGAGUCCAACCAACAGAAUCUAUUGUUAGAUUUCCUAAUAUUACAAACUUGUGCCCUUUUGGUGAAGUUUUUAACGCCACCAGAUUUGCAUCUGUUUAUGCUUGGAACAGGAAGAGAAUCAGCAACUGUGUUGCUGAUUAUUCUGUCCUAUAUAAUUCCGCAUCAUUUUCCACUUUUAAGUGUUAUGGAGUGUCUCCUACUAAAUUAAAUGAUCUCUGCUUUACUAAUGUCUAUGCAGAUUCAUUUGUAAUUAGAGGUGAUGAAGUCAGACAAAUCGCUCCAGGGCAAACUGGAAAGAUUGCUGAUUAUAAUUAUAAAUUACCAGAUGAUUUUACAGGCUGCGUUAUAGCUUGGAAUUCUAACAAUCUUGAUUCUAAGGUUGGUGGUAAUUAUAAUUACCUGUAUAGAUUGUUUAGGAAGUCUAAUCUCAAACCUUUUGAGAGAGAUAUUUCAACUGAAAUCUAUCAGGCCGGUAGCACACCUUGUAAUGGUGUUGAAGGUUUUAAUUGUUACUUUCCUUUACAAUCAUAUGGUUUCCAACCCACUAAUGGUGUUGGUUACCAACCAUACAGAGUAGUAGUACUUUCUUUUGAACUUCUACAUGCACCAGCAACUGUUUGUGGACCUAAAAAGUCUACUAAUUUGGUUAAAAACAAAUGUGUCAAUUUCAACUUCAAUGGUUUAACAGGCACAGGUGUUCUUACUGAGUCUAACAAAAAGUUUCUGCCUUUCCAACAAUUUGGCAGAGACAUUGCUGACACUACUGAUGCUGUCCGUGAUCCACAGACACUUGAGAUUCUUGACAUUACACCAUGUUCUUUUGGUGGUGUCAGUGUUAUAACACCAGGAACAAAUACUUCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGGUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCCUACUUGGCGUGUUUAUUCUACAGGUUCUAAUGUUUUUCAAACACGUGCAGGCUGUUUAAUAGGGGCUGAACAUGUCAACAACUCAUAUGAGUGUGACAUACCCAUUGGUGCAGGUAUAUGCGCUAGUUAUCAGACUCAGACUAAUUCUCCUUCGCGGGCAGGUAGUGUAGCUAGUCAAUCCAUCAUUGCCUACACUAUGUCACUUGGUGCAGAAAAUUCAGUUGCUUACUCUAAUAACUCUAUUGCCAUACCCACAAAUUUUACUAUUAGUGUUACCACAGAAAUUCUACCAGUGUCUAUGACCAAGACAUCAGUAGAUUGUACAAUGUACAUUUGUGGUGAUUCAACUGAAUGCAGCAAUCUUUUGUUGCAAUAUGGCAGUUUUUGUACACAAUUAAACCGUGCUUUAACUGGAAUAGCUGUUGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGUUUUUGCACAAGUCAAACAAAUUUACAAAACACCACCAAUUAAAGAUUUUGGUGGUUUUAAUUUUUCACAAAUAUUACCAGAUCCAUCAAAACCAAGCAAGAGGUCACCUAUUGAAGAUCUACUUUUCAACAAAGUGACACUUGCAGAUGCUGGCUUCAUCAAACAAUAUGGUGAUUGCCUUGGUGAUAUUGCUGCUAGAGACCUCAUUUGUGCACAAAAGUUUAACGGCCUUACUGUUUUGCCACCUUUGCUCACAGAUGAAAUGAUUGCUCAAUACACUUCUGCACUGUUAGCGGGUACAAUCACUUCUGGUUGGACCUUUGGUGCAGGUCCUGCAUUACAAAUACCAUUUCCUAUGCAAAUGGCUUAUAGGUUUAAUGGUAUUGGAGUUACACAGAAUGUUCUCUAUGAGAACCAAAAAUUGAUUGCCAACCAAUUUAAUAGUGCUAUUGGCAAAAUUCAAGACUCACUUUCUUCCACACCAAGUGCACUUGGAAAACUUCAAGAUGUGGUCAACCAAAAUGCACAAGCUUUAAACACGCUUGUUAAACAACUUAGCUCCAAUUUUGGUGCAAUUUCAAGUGUUUUAAAUGAUAUCCUUUCACGUCUUGACCCACCUGAGGCUGAAGUGCAAAUUGAUAGGUUGAUCACAGGCAGACUUCAAAGUUUGCAGACAUAUGUGACUCAACAAUUAAUUAGAGCUGCAGAAAUCAGAGCUUCUGCUAAUCUUGCUGCUACUAAAAUGUCAGAGUGUGUACUUGGACAAUCAAAAAGAGUUGAUUUUUGUGGAAAGGGCUAUCAUCUUAUGUCCUUCCCUCAGUCAGCACCUCAUGGUGUAGUCUUCUUGCAUGUGACUUAUGUCCCUGCACAAGAAAAGAACUUCACAACUGCUCCUGCCAUUUGUCAUGAUGGAAAAGCACACUUUCCUCGUGAAGGUGUCUUUGUUUCAAAUGGCACACACUGGUUUGUAACACAAAGGAAUUUUUAUGAACCACAAAUCAUUACUACAGACAACACAUUUGUGUCUGGUAACUGUGAUGUUGUAAUAGGAAUUGUCAACAACACAGUUUAUGAUCCUUUGCAACCUGAAUUAGACUCAUUCAAGGAGGAGUUAGAUAAAUAUUUUAAGAAUCAUACAUCACCAGAUGUUGAUUUAGGUGACAUCUCUGGCAUUAAUGCUUCAGUUGUAAACAUUCAAAAAGAAAUUGACCGCCUCAAUGAGGUUGCCAAGAAUUUAAAUGAAUCUCUCAUCGAUCUCCAAGAACUUGGAAAGUAUGAGCAGUAUAUAAAAUGGCCAUGGUACAUUUGGCUAGGUUUUAUAGCUGGCUUGAUUGCCAUAGUAAUGGUGACAAUUAUGCUUUGCUGUAUGACCAGUUGCUGUAGUUGUCUCAAGGGCUGUUGUUCUUGUGGAUCCUGCUGCAAAUUUGAUGAAGACGACUCUGAGCCAGUGCUCAAAGGAGUCAAAUUACAUUACACAUAA
SEQ ID NO: 5，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、及D950N；S2P (K986P及V987P)之δ變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 6，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N；S2P (K986P及V987P)之δ變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)。其缺少相對於SEQ ID NO: 5之P681R突變： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 7，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、及D950N；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P)之δ變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)。其進一步包含相對於SEQ ID NO: 5之F817P、A892P、A899P、及A942P突變： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 8，經最佳化之DNA序列，其編碼SEQ ID NO: 7： ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID NO: 9，經最佳化之RNA序列，其編碼SEQ ID NO: 7： AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGCCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCUGGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAAAAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA
SEQ ID NO: 10，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、及D950N；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P)之δ變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)。其缺少相對於SEQ ID NO: 7之P681R突變： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNS P SRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 11，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、及D950N；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P)之δ變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHFSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSVLEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGLTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 12，經最佳化之DNA序列，其編碼SEQ ID NO: 11： ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACTTCTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGTCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCCTGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAcATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID NO: 13，經最佳化之RNA序列，其編碼SEQ ID NO: 11： AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACUUCUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGUCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCCUGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAACAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA
SEQ ID NO: 14，包含下列突變之S蛋白之胺基酸序列：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、及D950N；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P)之δ變異體突變；E484K之β變異體突變；N440K之變異體突變；及類弗林蛋白酶切割位點突變(R682S及R685G)： MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHFSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSVLEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGLTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.
SEQ ID NO: 15，經最佳化之DNA序列，其編碼SEQ ID NO: 14： ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACTTCTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGTCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCCTGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAcATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAAGCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCAAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA
SEQ ID NO: 16，經最佳化之RNA序列，其編碼SEQ ID NO: 14： AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACUUCUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGUCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCCUGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAACAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAAGCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCAAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA
SEQ ID NO: 17，3’ UTR之DNA序列： GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
SEQ ID NO: 18，3’ UTR之RNA序列： GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGC
SEQ ID NO: 19，β-球蛋白5’ UTR之DNA序列： ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC
SEQ ID NO: 20，β-球蛋白5’ UTR之RNA序列： ACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACC
SEQ ID NO: 21，SYS UTR 2.0之DNA序列： GGCGCTCGAGCAGGTTCAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAACGCCACC
SEQ ID NO: 22，SYS UTR 2.0之RNA序列： GGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC
SEQ ID NO: 23，SYS UTR 1.0之DNA序列： GGGCGCTCGAGCAGGTTCAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAAC
SEQ ID NO: 24，SYS UTR 1.0之RNA序列： GGGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAAC
SEQ ID NO: 25，SYS4 5’ UTR之DNA序列： GGCGCACGAGCAGGGAGAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAACGCCACC
SEQ ID NO: 26，SYS4 5’ UTR之RNA序列： GGCGCACGAGCAGGGAGAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC
SEQ ID NO: 27，多腺苷酸40之DNA及RNA序列： AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 28，多腺苷酸60之DNA及RNA序列： AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 29，多腺苷酸訊息 HSV之DNA序列： CGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTC
SEQ ID NO: 30，多腺苷酸訊息 HSV之RNA序列： CGGCAAUAAAAAGACAGAAUAAAACGCACGGUGUUGGGUCGUUUGUUC
SEQ ID NO: 31，例示之5’UTR-δC S6P-3’ UTR-多腺苷酸之DNA序列： GGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCAATAGGCCGAAATCGGCAAGCGCGATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 32，例示之5’UTR-δC S6P-3’ UTR-多腺苷酸之RNA序列： GGACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACCGCCACCAUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGCCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCUGGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAAAAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCCAAUAGGCCGAAAUCGGCAAGCGCGAUCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO: 33，質體DNA序列： TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTAATACGACTCACTATAAGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCAATAGGCCGAAATCGGCAAGCGCGATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTCCTCGAGATTTAAATTCGCGAGTACTATGCATATGGGCCCAATATTAATTAAGCGCTAGCACGCGTTTAAACAGGCCTCGAGGCGCGCCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
SEQ ID NO: 34，HKP側鏈： KHKHKHKHK
SEQ ID NO: 35，HKP側鏈：HKHKHKHKHK
SEQ ID NO: 36，HKP側鏈：KHKHKHKHKH
SEQ ID NO: 37，HKP側鏈：HKHKHKHKHKH
SEQ ID NO: 38，HKP側鏈：KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK
SEQ ID NO: 39，HKP側鏈：KHHHKHHHKHHHKHHHK
SEQ ID NO: 40，HKP側鏈：KHHHKHHHKHHHHKHHHK
SEQ ID NO: 41，HKP側鏈：KHHHKHHHKHHHHKHHHK，其中第1、5、9；14及18個胺基酸係D-胺基酸。
SEQ ID NO: 42，HKP側鏈：HKHHHKHHHKHHHHKHHHK
SEQ ID NO: 43，HKP側鏈：HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK
SEQ ID NO: 44，HKP側鏈：KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK
SEQ ID NO: 45，HKP側鏈：KHHHKHHHKHHHKHHHHK
SEQ ID NO: 46，HKP側鏈：KHHHKHHHHKHHHKHHHK
SEQ ID NO: 47，HKP側鏈：KHHHKHHHHKHHHKHHHHK
SEQ ID NO: 48，類弗林蛋白酶切割位點：RRAR
SEQ ID NO: 49：-HHHK-
SEQ ID NO: 50：RX(K/R)R
SEQ ID NO: 51：TAATACGACTCACTATAA
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SEQ ID NO: 53: 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除非另有界定，否則用於本文中的所有技術及科學用語具有如本技術所屬的技術領域中具有通常知識者一般所瞭解之相同意義。
在本文中所說明性地描述的本技術可在沒有任何未在本文中具體揭示的任何單獨或多個元件、單獨或多個限制下適當地實施。因此，例如，用語“包含”、“包括”、“含有”等應被廣義地讀取且不受限制。此外，在本文中所利用的用語和表現方式是作為描述性用語而非限制性用語使用的，且在使用這些用語和表現方式時，並不打算排除所顯示和描述的特徵或其部分的任何等效物，但應理解的是，在所請本技術的範圍內可有各種修改。
因此，應理解的是，這裡所提供的材料、方法、及實例係較佳態樣的代表，係例示性的，而非意欲作為對本技術範圍的限制。
應理解的是，儘管本發明已藉由某些態樣面、實施態樣、及視需要之特徵來具體揭露示，但熟習本技術領域者可採取這些態樣、實施態樣、和視需要之特徵的修改、改進和變化，並且這些修改、改進和變化被認為是在本揭露的範圍之內。
本技術在本文中已廣義及一般性說明。落入上位揭露的各狹義下位及次上位群組，也形成本技術的一部分。這包括對本技術的上位描述，惟有但書或負面限定，將任何標的物從該上位移去，而不論被刪除的材料是否在本文中具體列出。
此外，當本技術的特徵或態樣係以馬庫西群組來描述時，熟習本技術領域者將理解，本技術也因此以馬庫西群組的任何單個成員或成員的次群組來描述。
在本文中所提到的所有出版物、專利申請、專利、及其他參考文獻均明確地藉由引用方式全部併入，其程度如同各文獻藉由引用方式個別併入。若有相衝突之情況，以本說明書、包括定義為主。
其他態樣係在下列申請專利範圍中闡述。
[ 圖 1]提供NanoAssemblr Ignite的代表性參數設定，用於製造在RL-007脂質中之RNA。RL-007是藉由混合最終濃度為6.25 mM的SM-102、1.25 mM的DSPC、4.815 mM的膽固醇、及0.1875 mM的DMG-PEG2000( 即50:10:38: 1.5的莫耳比)來製備。0.13 mg/mL的mRNA與RL-007以3:1 (v/v)的比例混合。
[ 圖 2A-2C]提供了代表性圖像，顯示了藍色螢光蛋白在用編碼藍色螢光蛋白並包含各種多腺苷酸尾( 圖 2A，多腺苷酸40；和 圖 2B，多腺苷酸60)或沒有多腺苷酸尾的RNA轉染的細胞中的表現( 圖 2C)。
[ 圖 3]提供了顯示藍色螢光蛋白表現的條形圖，該表現由在轉染編碼該蛋白的RNA的不同時間點(0小時、24小時、48小時、72小時、96小時和144小時)測量的螢光強度指示藍色螢光蛋白，包含不同的UTR。左起第一組條代表使用β-球蛋白5' UTR獲取的數據。左起第二組條代表使用本文揭示的SYS 5' UTR獲取的數據。從左起表示使用無5' UTR獲取的數據。左起第四組條表示從空白對照組獲取的數據。誤差條表示3個重複的標準偏差。
[ 圖 4]顯示了如實施例9中詳述的代表性IFN-α和IFN-β ELISA結果。SWT代表棘蛋白野生型。S RBD代表棘受體結合蛋白。S2P代表包含K986P和V987P突變。用於包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P的突變。UK代表首先在英國發現的alpha變異體。SA代表首先在南非發現的beta變異體。GS代表序列優化的RNA(SEQ ID NO: 54)。A549表示陰性對照A549肺癌上皮細胞。
[ 圖 5A-5B]提供了如實施例9中所示的IFN-α ELISA的定量結果。 圖 5A是標準曲線，而 圖 5B提供了相應的計算。
[ 圖 6A-6B]提供了如實施例9中所示的IFN-β ELISA結果的定量結果。 圖 6A是標準曲線，而 圖 6B提供了相應的計算。
[ 圖 7]顯示免疫和未免疫小鼠在SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020病毒挑激後的臨床嚴重程度評分曲線。第1組小鼠給予PBS，第2組小鼠給予mRNA RL免疫  -007 1 µg/動物，第3組小鼠用mRNA RL007 5 µg免疫/動物，第4組小鼠用mRNA RL007 10 µg免疫/病毒挑激前的動物。
[ 圖 8A-8D]顯示了治療小鼠的體重。 圖 8B顯示了在用SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020分離株(NCBI登錄號：MT066156)進行病毒挑激後未免疫和免疫小鼠的組平均體重。第1至4組小鼠的體重在NLS免疫後，以及用SARS-CoV-2/human/ITA/INMI1/2020分離株進行病毒挑激後。每隻小鼠的體重計算為交付至NLS後測量的體重的百分比，以及在GMU進行病毒挑激前測量的體重。顯示了每組小鼠的平均值和平均值的標準誤差(SEM)。第1組-“C”代表對照未免疫小鼠。圖 8C顯示了在使用SARS-CoV-2 B.1.1617.2 Delta變異體進行病毒挑激之前未免疫和免疫小鼠的組平均體重。 圖 8D顯示了用SARS-CoV-2 B.1.1617.2 Delta變異體進行病毒挑激後未免疫和免疫小鼠的組平均體重。m-Co是一種以低劑量(0.50微克/小鼠)遞送的對照疫苗，並且高劑量(5微克/小鼠)非對照小鼠接種了使用RL-007載體的RV-1730(在 圖 8C和 圖 8D 中標記為“RNAImmune”)。
[ 圖 9]顯示第1組至第4組小鼠在SARS-CoV-2/ human/ITA/INMI1/2020 (NCBI Accession number：MT066156)病毒挑激後的體溫曲線，均值和標準誤差(SEM)代表每組小鼠。第1組小鼠使用PBS，第2組小鼠用mRNA RL-007 1 µg/動物免疫，第3組小鼠用mRNA RL007 5 µg免疫/動物，第4組小鼠用mRNA RL007 10 µg免疫/病毒挑激前的動物。實驗在實施例10中描述。
[ 圖 10]是Kaplan Meier曲線，顯示了用SARS-CoV-2挑激的小鼠的存活率。第1組小鼠被施用PBS，第2組小鼠用mRNA RL-007 1 μg/動物免疫，第3組小鼠被用mRNA RL007 5 µg免疫/動物，第4組小鼠用mRNA RL007 10 µg免疫/病毒挑激前的動物。實驗在實施例10中描述。
[ 圖 11A]、[ 圖 11B]、[ 圖 11C]、和[ 圖 11D]顯示了針對SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020的小鼠血清力價數據，使用溶斑減少中和力價法(PRNT)進行評估。比50%減少(PRNT 50)或90%減少(PRNT 90)相對於陰性對照血清的噬菌斑形成單位(pfu.)。 圖 11A顯示第13天收集的初次免疫後小鼠血清的PRNT 50； 圖 11B顯示第13天收集的初次免疫後小鼠血清的PRNT 90； 圖 11C顯示收集的加強免疫後小鼠血清的PRNT 50在第27天； 圖 11D顯示了在第27天收集的加強免疫後小鼠血清的PRNT 90。符號和水準線分別代表每個樣品的個體效價和每個組的平均效價。血清效價表示為Log 2稀釋度的倒數實施例10中描述了實驗。中和效價的計算方法是，相對於陰性對照血清，導致斑塊形成單位(p.f.u.)減少超過50%(PRNT50)或90%(PRNT90)的最低稀釋度的倒數。圖11A顯示了第13天收集的初始免疫後小鼠血清的PRNT50；圖11B顯示了第13天收集的初始免疫後小鼠血清的PRNT90；圖11C顯示了第27天收集的增強免疫後小鼠血清的PRNT50；圖11D顯示了第27天收集的增強免疫後小鼠血清的PRNT90。符號和橫線分別代表每個樣本的個體效價和每組的平均效價。血清效價以倒數Log2稀釋度表示。實驗在實施例10中描述。
[ 圖 12]顯示了在安樂死時採集的肺組織的組織病理學評分。組織病理學評分是總肺評分、間質性肺炎(pn)和血管套囊評分的圖形表示，基於涉及肺的百分比(0=無；1=0-25%；2=26-50%；3=51-75%；4=76-100%和(特定肺部病變：0=無；1=最小；2=輕度；3=中度；在SARS-CoV-2/human/ITA/INMI1/2020挑激後的第3天指定安樂死小鼠的一部分肺組織用於肺組織中的病毒效價分析。肺組織中的病毒效價在五隻小鼠(5)來自每組病毒挑激後三(3)天。第1組小鼠被給予PBS對照(在 圖 7 中標識為 “C”)。第2、3和4組小鼠用第1劑RL007 mRNA疫苗免疫分別為µg/動物、5 µg/動物、10 µg/動物。
[ 圖 13]顯示了如 圖 7中所揭示處理的小鼠的代表性肺組織的組織病理學圖像，在用SARS-CoV-2挑激後13天收穫。以20倍放大倍數掃描每組代表性小鼠的H&E 染色組織切片。第1組小鼠接受PBS對照。第2、3和4組小鼠用mRNA疫苗RL007免疫，劑量為1 µg/動物、5 µg/動物、10 µg/動物，分別為。左上：第1組，鼠標R24-101-010；右上：第2組，鼠標R24-101-013；左下：第3組，鼠標R24-101-023；右下：組4、鼠標R24-101-034。
[ 圖 14]顯示Th-1和Th-2細胞因數測量 在加強後 9 週，如圖7所示處理的小鼠的數量。從每組5隻小鼠中分離出脾細胞，並用來自SARS-CoV-2 S蛋白的無肽或重疊肽庫重新刺激。72小時後，培養通過離心收集補充物，並使用基於珠子的11-plex TH1/TH2小鼠ProcartaPlex多重免疫測定(Thermo Fisher Scientific)。使用Luminex100/200系統測量螢光並使用ProcartaPlex Analyst 1.0軟件(Thermo Fisher Scientific)進行分析。低於量化下限設置為零。** P＜0.01, ***P＜0.001, and ****P＜0.0001 (unpaired Student's t-test, compared to PBS control)。實驗在實施例14中描述。
[ 圖 15A]、[ 圖 15B]和[ 圖 15C]顯示對脾細胞的IFN-γ ELISPOT分析。加強後9週，從每組5隻小鼠中分離出脾細胞，然後將脾細胞(每96孔2x10 5個細胞)接種到小鼠IFN-γ ELISpot平板(Mabtech)上，並用來自SARS-CoV-2 Delta棘蛋白次單元S1和S2 16小時。 圖 15A顯示使用Cytation7拍攝和量化的圖像。*P＜0.05，****P＜0.001。 圖 15B是量化每2x10 5個用Delta棘蛋白次單元S1 離體再刺激的細胞的IFN-γ斑點的圖表。 圖 15C是量化每2x10 5個細胞的IFN-γ斑點的圖表。x10 5個細胞用Delta棘蛋白次單元S2在 體外重新刺激。
[ 圖 16]顯示了使用流式細胞術對記憶T細胞進行的細胞因數分析。加強後9週，從每組5隻小鼠中分離出脾細胞，並在沒有肽或來自SARS-CoV-2 S蛋白的重疊肽池中重新刺激存在蛋白質轉運抑制劑混合物。如實施例16所示處理小鼠。16小時後，進行細胞內細胞因數染色(ICS)以量化CD4 +和CD8 +T細胞反應。考慮背景並從測量的反應中減去每隻小鼠的S1和S2肽庫。
[ 圖 17]顯示RV-1730免疫血清針對不同變異體棘蛋白的終點IgG效價。RV-1730是代表性的RL-007 mRNA製劑疫苗，根據實施例3製備，包含SEQ ID NO: 52。SEQ ID NO: 52包含開放閱讀框架描述於SEQ ID NO:55。RV-1730使用根據實施例3製備的RL-007載體。實驗描述於實施例12。
[ 圖 18A]和[ 圖 18B]顯示了第14天( 圖 18A)和第35天( 圖 18B) 的RV-1730免疫後針對SARS-CoV-2假病毒顆粒(PP)的中和抗體效價，如實施例13所示。數據顯示為Brazil：Gamma變異體、614D：野生型、UK：Alpha變異體、Delta：Delta變異體、614G：D614G變異體、SA：Beta變異體假病毒顆粒。實驗在實施例13中描述。
[ 圖 19A–19D]顯示免疫小鼠血清對五組小鼠(G1、G2、G3、G4和G5)不同SARS-CoV-2-PP感染的影響。x軸顯示化合物濃度，Y軸顯示化合物濃度顯示相對PP感染性。顯示614D-PP( 圖 19A)、Delta-PP( 圖 19B)、Omicron-PP( 圖 19C)、BA.2-PP( 圖 19D)的數據。描述了實驗在實施例13中。
[ 圖 20]是在五組小鼠(G1、G2、G3、G4和G5)的假病毒中和試驗中異源疫苗接種血清的IC 50(血清%)圖表 。針對SARS-CoV-2假病毒顆粒的中和抗體效價包括野生型SARS-CoV-2、Delta SARS-CoV-2、Omicron BA.1 SARS-CoV-2和Omicron BA.2 SARS-CoV-2，在第一個和第二個SARS-CoV-2 mRNA之後進行測量疫苗免疫劑量。小鼠接受了RV-1730的第一和第二疫苗免疫劑量的組合，或本領域已知的SARS-CoV-2疫苗，例如BNT162b2可從Pfizer-BioNTech獲得，或mRNA-1273可從Moderna獲得。
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Claims (95)

  1. 一種編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之核糖核酸(RNA)，該S蛋白或其致免疫性片段包含至少一種非天然存在的胺基酸突變，其中該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含下列者之一或多者： 絲胺酸(S)作為對應SEQ ID NO: 1的R682之胺基酸(R682S)、 甘胺酸(G)作為對應SEQ ID NO: 1的R685之胺基酸(R685G)、 脯胺酸(P)作為對應SEQ ID NO: 1的F817之胺基酸(F817P)、 P作為對應SEQ ID NO: 1的A892之胺基酸(A892P)、 P作為對應SEQ ID NO: 1的A899之胺基酸(A899P)、 P作為對應SEQ ID NO: 1的A942之胺基酸(A942P)、 P作為對應SEQ ID NO: 1的K986之胺基酸(K986P)、或 P作為對應SEQ ID NO: 1的V987之胺基酸(V987P)， 惟該RNA不包含SEQ ID NO: 2。
  2. 如請求項1之RNA，其中該S蛋白進一步包含下列者之一者或兩者： 離胺酸(K)作為對應SEQ ID NO: 1的N440之胺基酸(N440K)，或 K作為對應SEQ ID NO: 1的E484之胺基酸(E484K)。
  3. 如請求項1或2之RNA，其中該S蛋白進一步包含下列者之一或多者： 精胺酸(R)作為對應SEQ ID NO: 1的T19之胺基酸(T19R)、 ***酸(F)作為對應SEQ ID NO: 1的V70之胺基酸(V70F)、 異白胺酸(I)作為對應SEQ ID NO: 1的T95之胺基酸(T95I)、 天冬胺酸(D)作為對應SEQ ID NO: 1的G142之胺基酸(G142D)、 對應SEQ ID NO: 1的E156之刪除(E156Δ)、 對應SEQ ID NO: 1的F157之刪除(F157Δ)、 G作為對應SEQ ID NO: 1的R158之胺基酸(R158G)、 纈胺酸(V)作為對應SEQ ID NO: 1的A222之胺基酸(A222V)、 白胺酸(L)作為對應SEQ ID NO: 1的W258之胺基酸(W258L)、 天冬醯胺酸(N)作為對應SEQ ID NO: 1的K417之胺基酸(K417N)、 R作為對應SEQ ID NO: 1的K417之胺基酸(L452R)、 K作為對應SEQ ID NO: 1的T478之胺基酸(T478K)、 G作為對應SEQ ID NO: 1的D614之胺基酸(D614G)、 R作為對應SEQ ID NO: 1的P681之胺基酸(P681R)、或 N作為對應SEQ ID NO: 1的D950之胺基酸(D950N)。
  4. 如請求項1至3中任一項之RNA，其中該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含R682S及R685G。
  5. 如請求項1至4中任一項之RNA，其中該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含或進一步包含下列者之任一者、或任二者、或任三者、或任四者、或任五者：F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、或V987P。
  6. 如請求項5之RNA，其中該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含或進一步包含K986P及V987P。
  7. 如請求項1至6中任一項之RNA，其中該至少一種非天然存在的胺基酸突變包含或進一步包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、及V987P。
  8. 如請求項1及3至6中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 5或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 5之等效物留存下列之突變：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、R682S、R685G、D950N、K986P、及V987P。
  9. 如請求項8之RNA，其包含編碼SEQ ID NO: 5或其等效物之多核苷酸。
  10. 如請求項1及3至6中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 6或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 6之等效物留存下列之突變：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、R682S、R685G、D950N、K986P、及V987P。
  11. 如請求項10之RNA，其包含編碼SEQ ID NO: 6或其等效物之多核苷酸。
  12. 如請求項1、3、4及7中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 7或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 7之等效物留存下列之突變：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S及R685G。
  13. 如請求項12之RNA，其包含SEQ ID NO: 9或其等效物之多核苷酸，其中該SEQ ID NO: 9之等效物編碼SEQ ID NO: 7或其等效物。
  14. 如請求項1、3、4及7中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 10或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 10之等效物留存下列之突變：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S及R685G。
  15. 如請求項14之RNA，其包含編碼SEQ ID NO: 10或其等效物之多核苷酸。
  16. 如請求項1、3、4及7中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 11或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 11之等效物留存下列之突變：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S及R685G。
  17. 如請求項16之RNA，其包含SEQ ID NO: 13或其等效物之多核苷酸，其中該SEQ ID NO: 13之等效物編碼SEQ ID NO: 11或其等效物。
  18. 如請求項1至4及7中任一項之RNA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 14或其等效物之多肽，其中該SEQ ID NO: 14之等效物留存下列之突變：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、E484K、N440K、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S及R685G。
  19. 如請求項18之RNA，其包含SEQ ID NO: 16或其等效物之多核苷酸，其中該SEQ ID NO: 16之等效物編碼SEQ ID NO: 14或其等效物。
  20. 如請求項9、11、13、15、17及19中任一項之RNA，其中該SEQ ID NO: 9、13、或16中任一項之等效物由整個該等效物之全長約35%至約70%之GC含量組成。
  21. 如請求項8至20中任一項之RNA，該等效物與全長參考序列係至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或更多為相同。
  22. 如請求項1至21中任一項之RNA，其進一步包含3’ UTR。
  23. 如請求項22之RNA，其中該3’ UTR包含SEQ ID NO: 18、22、或24之任一者。
  24. 如請求項1至23中任一項之RNA，其進一步包含5’ UTR。
  25. 如請求項24之RNA，該5’ UTR包含SEQ ID NO: 20或26。
  26. 如請求項1至25中任一項之RNA，其進一步包含多腺苷酸尾(polyA tail)。
  27. 如請求項26之RNA，其中該多腺苷酸尾包含SEQ ID NO: 27、28、或30之任一者。
  28. 如請求項1之RNA，其包含下列者或由下列者組成：SEQ ID NO: 32。
  29. 如請求項1至28中任一項之RNA，其中該RNA係經化學修飾且視需要包含下列者之一或多者：N1-甲基假尿苷殘基或假尿苷殘基。
  30. 如請求項29之RNA，其中該RNA中的尿苷殘基至少約50%、或至少約70%、或約100%係N1-甲基假尿苷或假尿苷。
  31. 一種編碼如請求項1至30中任一項之RNA之多核苷酸、或與其互補之多核苷酸，視需要其中該多核苷酸係選自下列群組：去氧核糖核酸(DNA)、RNA、DNA及RNA之雜合體、或其各類似物。
  32. 一種編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之多核苷酸，該S蛋白或其致免疫性片段包含至少一種非天然存在的胺基酸突變，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO: 55之序列或其等效物。
  33. 一種編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之棘(S)蛋白或其致免疫性片段之多核苷酸，該S蛋白或其致免疫性片段包含至少一種非天然存在的胺基酸突變，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO: 52之序列或其等效物。
  34. 一種載體，其包含如請求項31至33中任一項之多核苷酸。
  35. 如請求項34之載體，其進一步包含與該多核苷酸可操作地連接之調節序列，以導引該多核苷酸之轉錄。
  36. 如請求項35之載體，其中該調節序列包含啟動子。
  37. 如請求項36之載體，其中該啟動子包含：噬菌體RNA聚合酶啟動子，視需要為T7啟動子、或SP6啟動子、或T3啟動子。
  38. 如請求項34至37中任一項之載體，其進一步包含標記，其選自可偵測標記、純化標記、或篩選標記。
  39. 如請求項34至38中任一項之載體，其中該載體係非病毒載體，視需要為質體、或脂質體、或微胞。
  40. 如請求項39之載體，其中該質體包含下列者或由下列者組成：SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 53或其等效物。
  41. 如請求項32至36中任一項之載體，其中該載體係病毒載體，視需要為腺病毒載體、或腺相關病毒載體、或反轉錄病毒載體、或慢病毒載體、或植物病毒載體。
  42. 一種細胞，其包含下列者之一或多者：如請求項1至30中任一項之RNA、如請求項31至33中任一項之多核苷酸、或如請求項34至41中任一項之載體。
  43. 如請求項42之細胞，其中該細胞係原核細胞，視需要為大腸桿菌細胞。
  44. 如請求項42之細胞，其中該細胞係真核細胞，視需要為哺乳動物細胞、昆蟲細胞、或酵母菌細胞。
  45. 一種組成物，其包含載劑及下列者之一或多者：如請求項1至30中任一項之RNA、如請求項31至33中任一項之多核苷酸、如請求項34至41中任一項之載體、或如請求項42至44中任一項之細胞。
  46. 如請求項45之組成物，其中該載劑係醫藥上可接受之載劑。
  47. 一種製造如請求項1至30中任一項之RNA之方法，其包含在適合表現該RNA之條件下，培養如請求項42至44中任一項之細胞。
  48. 一種製造如請求項1至30中任一項之RNA之方法，其包含在適合表現該RNA之條件下，將如請求項31至33中任一項之多核苷酸或如請求項34至41中任一項之載體與RNA聚合酶、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、鳥苷-5'-三磷酸(GTP)、及尿苷三磷酸(UTP)或經化學修飾之UTP接觸。
  49. 如請求項47或48之方法，其進一步包含分離該RNA。
  50. 一種組成物，其包含如請求項1至30中任一項之RNA及醫藥上可接受之載劑。
  51. 如請求項50之組成物，其中該醫藥上可接受之載劑包含聚合奈米顆粒，其包含組胺酸-離胺酸共聚物(HKP)。
  52. 如請求項51之組成物，其中該HKP包含選自SEQ ID NO: 34 - 47之側鏈。
  53. 如請求項51或52之組成物，其中該醫藥上可接受之載劑進一步包含脂質。
  54. 如請求項53之組成物，其中該脂質包含陽離子脂質。
  55. 如請求項54之組成物，其中該陽離子脂質係可離子化的。
  56. 如請求項51或52之組成物，其中該陽離子脂質包含Dlin-MC3-DMA (MC3)或二油醯基氧基-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)或兩者。
  57. 如請求項54至56中任一項之組成物，其中該脂質進一步包含下列者之一或多者：輔助者脂質、膽固醇、或經PEG化之脂質。
  58. 如請求項50之組成物，其中該醫藥上可接受之載劑包含脂質奈米顆粒(LNP)。
  59. 如請求項58之組成物，其中該LNP包含下列者之一或多者：9-十七基 8-{(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一基氧基)己基]胺基}辛酸酯(SM-102)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧(DLin-KC2-DMA)、二亞麻油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基) 9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七二酸酯(L319)、或其各等效物。
  60. 如請求項59之組成物，其中該LNP進一步包含下列者之一或多者：輔助者脂質、膽固醇、或經PEG化之脂質。
  61. 如請求項57或60之組成物，其中該輔助者脂質包含下列者之一或多者：二硬脂醯基磷脂醯膽鹼 (DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、(2 R)-3-(十六醯基氧基)-2-{[(9 Z)-十八-9-烯醯基]氧基}丙基 2-(三甲基銨氮基)乙基磷酸酯 (POPC)、或二油醯基磷脂醯乙醇胺 (DOPE)。
  62. 如請求項57及60至61中任一項之組成物，其中該膽固醇包含植物膽固醇或動物膽固醇或兩者。
  63. 如請求項57及60至62中任一項之組成物，其中該經PEG化之脂質包含下列者之一或多者：PEG-c-DOMG (R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油)視需要為PEG2000-DMG ((1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]、或PEG-DPG (1,2-二軟脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。
  64. 如請求項57及60至63中任一項之組成物，其中該LNP包含SM-102、DSPC、膽固醇及PEG2000-DMG。
  65. 如請求項64之組成物，其中SM-102、DSPC、膽固醇及PEG200-DMG的質量比係約1:1:1:1，及/或其中SM-102、DSPC、膽固醇及PEG2000-DMG的莫耳比係約50:10:38.5:1.5。
  66. 一種製造如請求項50至57中任一項之組成物之方法，其包含將如請求項1至30中任一項之RNA與HKP接觸，從而使該RNA及該HKP係經自組裝成奈米顆粒。
  67. 如請求項58或59之方法，其中在接觸步驟中，該HKP及該RNA的質量比係約10:1至約1:10，視需要為2.5:1。
  68. 如請求項66或67之方法，其進一步包含將該HKP及RNA與陽離子脂質接觸。
  69. 如請求項68之方法，其中該陽離子脂質包含Dlin-MC3-DMA (MC3)或DOTAP(二油醯基氧基-3-(三甲基銨基)丙烷)或兩者。
  70. 如請求項68或69之方法，其中在接觸步驟中，該陽離子脂質及該RNA的質量比係約10:1至約1:10，視需要為1:1。
  71. 如請求項68至70中任一項之方法，其中在接觸步驟中，該HKP、該mRNA及該陽離子脂質的質量比係約4:1:1。
  72. 一種製造如請求項50及58至65中任一項之組成物之方法，其包含將如請求項1至30中任一項之RNA與脂質接觸，從而使該RNA及該脂質係經自組裝成脂質奈米顆粒(LNP)。
  73. 如請求項72之方法，其中該LNP包含下列者之一或多者：9-十七基 8-{(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一基氧基)己基]胺基}辛酸酯(SM-102)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧(DLin-KC2-DMA)、二亞麻油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基) 9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七二酸酯 (L319)、或其各等效物。
  74. 如請求項73之方法，其中該LNP進一步包含下列者之一或多者：輔助者脂質、膽固醇、或經PEG化之脂質。
  75. 如請求項74之方法，其中該輔助者脂質包含下列者之一或多者：二硬脂醯基磷脂醯膽鹼 (DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、(2 R)-3-(十六醯基氧基)-2-{[(9 Z)-十八-9-烯醯基]氧基}丙基 2-(三甲基銨氮基)乙基磷酸酯(POPC)、或二油醯基磷脂醯乙醇胺 (DOPE)。
  76. 如請求項74或75之方法，其中該膽固醇包含植物膽固醇或動物膽固醇或兩者。
  77. 如請求項74至76中任一項之方法，其中該經PEG化之脂質包含下列者之一或多者：PEG-c-DOMG (R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油)視需要為PEG2000-DMG ((1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]、或PEG-DPG (1,2-二軟脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。
  78. 如請求項72至77中任一項之方法，其中該LNP包含SM-102、DSPC、膽固醇及PEG2000-DMG。
  79. 如請求項78之方法，其中SM-102、DSPC、膽固醇及PEG200-DMG的質量比係約1:1:1:1，及/或其中SM-102、DSPC、膽固醇及PEG2000-DMG的莫耳比係約50:10:38.5:1.5。
  80. 如請求項64至79中任一項之方法，其中該接觸步驟係在微流體混合器中進行，該微流體混合器視需要為選自狹縫指叉狀微混合器(slit interdigitial micromixer)，或交錯鯡魚骨形微混合器(staggered herringbone micromixer)(SHM)。
  81. 一種包含下列者之一或多者之方法： (a)  防止個體有症狀性SARS-CoV-2感染， (b)  在有需要之個體中誘發對SARS-CoV-2之免疫反應， (c)  在有需要之個體中減少SARS-CoV-2或其S蛋白與血管張力素轉化酶2 (ACE2)之結合， (d)  治療感染SARS-CoV-2之個體，或 (e)  減少有需要之個體之SARS-CoV-2病毒負荷， 該方法包含將下列者之一或多者投予該個體：如請求項1至30中任一項之RNA或如請求項50至65中任一項之組成物。
  82. 如請求項79之方法，其進一步包含以另外之治療劑治療該個體。
  83. 如請求項82之方法，其中該另外之治療劑包含下列者之一或多者： 抗病毒劑，視需要為瑞德西韋(remdesivir)、洛比那維爾(lopinavir)、利托那維爾(ritonavir)、艾弗麥克素(ivermectin)、克流感(tamiflu)、或法匹拉韋(favipiravir)； 抗發炎劑，視需要為迪皮質醇(dexamethasone)、塔西單抗(tocilizumab)、kevzara、colcrys、羥氯喹(hydroxychloroquine)、氯喹(chloroquine)、或激酶抑制劑； 從SARS-CoV-2感染恢復的個體之恢復期血漿(covalescent plasma)； 與SARS-CoV-2結合之抗體，視需要為巴尼韋單抗(bamlanivimab)、埃特司韋單抗(etesevimab)、凱西瑞單抗(casirivimab)、或伊德維單抗(imdevimab)；或 抗生素劑，視需要為亞茲索黴素(azithromycin)。
  84. 如請求項81至83中任一項之方法，其中當該個體經以該RNA或該組成物投予時，該個體沒有SARS-CoV-2感染。
  85. 如請求項81至84中任一項之方法，其中在投予前或期間，該RNA或該組成物係藉由霧化器吸入系統來霧化。
  86. 如請求項85之方法，其中該霧化器系統係用於整個呼吸道藥物遞輸之可攜式霧化器。
  87. 如請求項81至84中任一項之方法，其中該RNA或該組成物係藉由皮下注射來投予。
  88. 如請求項81至84中任一項之方法，其中該RNA或該組成物係藉由肌內注射來投予。
  89. 如請求項81至84中任一項之方法，其中該RNA或該組成物係藉由腹腔內注射(i.p)來投予。
  90. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該RNA或該組成物係以至少21天、至少28天、至少35天、至少42天、至少49天、至少56天、或至少64天的間隔投予兩次。
  91. 一種吸入系統，其包含如請求項1至30中任一項之RNA或如請求項50至65中任一項之組成物及霧化器。
  92. 如請求項91之吸入系統，其中該霧化器係用於整個呼吸道藥物遞輸之可攜式霧化器。
  93. 一種用於如請求項81至90中任一項之方法之套組，該套組包含使用說明及下列者之一或多者：如請求項1至30中任一項之RNA、如請求項48至63中任一項之組成物、或如請求項89或90之吸入系統。
  94. 一種用於如請求項47及66至80中任一項之方法之套組，該套組包含使用說明及下列者之一或多者：如請求項1至30中任一項之RNA、如請求項31至33中任一項之多核苷酸、如請求項34至41中任一項之載體、如請求項42至44中任一項之細胞、如請求項45或46之組成物、HKP、或脂質，視需要為陽離子脂質。
  95. 一種用於如請求項48或49之方法之套組，其包含使用說明、如請求項31至33中任一項之多核苷酸或如請求項34至41中任一項之載體、RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP、及UTP或經化學修飾之UTP。
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