CN116904377B - 一种产共轭亚油酸菌株及降脂发酵乳和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产共轭亚油酸菌株及降脂发酵乳和应用，所述菌株命名为发酵乳杆菌L1，保藏编号为CCTCC NO：M2023862，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。使用发酵乳杆菌L1可生产风味、质地良好，富含活菌数和共轭亚油酸的发酵乳。富含共轭亚油酸发酵乳可改善生理、生化指标，提高肠道菌群中拟杆菌门和双歧杆菌的丰度，使肠道菌群恢复平衡，促进初级胆汁酸的分泌，在双歧杆菌和拟杆菌的作用下将初级胆汁酸转换为次级胆汁酸，从而实现胆汁酸代谢良性循环，达到减肥降脂的效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种领域，尤其涉及一种产共轭亚油酸菌株及降脂发酵乳和应用。
背景技术
共轭亚油酸是亚油酸的一组构象和位置异构体，由一系列含有碳9、10、11位置的共扼双键、具有几何异构的十八碳二烯酸构成的。共轭亚油酸被称为“二十一世纪的新型营养素”，主要存在于乳制品和反刍动物的肉中。随着人民生活水平的提高和对优质不饱和脂肪酸需求的增加，共轭亚油酸因其具有抗癌、降脂、抗氧化等众多生理功能，逐渐成为研究热点。共轭亚油酸在药物研发、营养保健等行业都有巨大的研究价值。
自从1966年第一株可以产生共轭亚油酸的菌株-丁酸弧菌(Kepleretal,1966)被报道至今，已有许多产CLA(共轭亚油酸)菌株被发现，如双歧杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等。由于化学生成CLA伴随着其他副产物，所以高纯度的CLA产品价格不菲；与化学合成CLA相比，使用乳酸菌合成CLA是十分理想的途径。本申请通过筛选得到一株高产共轭亚油酸的乳酸菌，并利用乳酸菌发酵生产富含共轭亚油酸的发酵乳。
发明内容
本发明旨在提供一种高产共轭亚油酸菌株，并围绕肥胖和超重人群对个性化营养的需求，基于云南高原特色，从理论出发，解析云南原生代乳酸菌高产共轭亚油酸的机制；利用乳酸菌发酵生产富含共轭亚油酸的发酵乳并构建了产品特征成分指纹图谱；将产品与动物干预实验相结合，阐明富含共轭亚油酸发酵乳的降脂机制。
本发明的技术方案如下：一种高产共轭亚油酸菌株，所述菌株命名为发酵乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)Ll，保藏编号为CCTCCNO：M2023862，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2023年5月30日。
本发明还提供含有所述高产共轭亚油酸菌株的微生物制剂，每毫升或者每克微生物制剂中菌浓度不低于1×109CFU。
本发明还提供所述高产共轭亚油酸菌株或者所述微生物制剂在制备共轭亚油酸中的应用。
本发明还提供一种降脂发酵乳，所述发酵乳采用所述高产共轭亚油酸菌株发酵得到；或者采用所述微生物制剂发酵得到。
进一步地，所述降脂发酵乳制备过程如下：采用蒸馏水溶解脱脂乳后，加入红花籽油和安赛蜜混合，在室温下以25-30MPa的参数使用高压均质机均质混合液体3-10min，重复均质2-4次；然后将均质液维持在75-85℃的条件下水浴加热20-40min，待温度降至33-37℃后在无菌环境下将发酵乳杆菌L1接入均质液中，然后在33-36℃的条件下进行发酵。
进一步地，所述发酵乳杆菌L1活化后以0.8-1.5％(w/w)的接种量接入MRS肉汤中培养至第三代，然后接种到均质液中，接种量为0.5-3％(w/w)。
进一步地，所述发酵乳采用发酵乳杆菌L1、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同作为发酵剂；所述发酵乳杆菌L1、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1.5-2.5：0.8-1.2：0.8-1.2。
更进一步地，所述脱脂乳的添加量为8-15％，红花籽油的添加量为5-7％，安赛蜜的添加量为0.008-0.015％。
本发明还提供所述降脂发酵乳在降脂和减肥中的应用。
本发明筛选得到一株发酵乳杆菌L1，以红花籽油为底物能够高产共轭亚油酸。利用发酵乳杆菌L1发酵含红花籽油的脱脂乳，是一款富含共轭亚油酸、质地细腻、酸甜可口的发酵乳。富含共轭亚油酸发酵乳有区别于普通酸奶的特征活性成分：主要含有脂肪酸、氨基酸、有机酸、生物碱类和木脂素类等多种特征成分；脂肪酸主要为肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸、共轭亚油酸，亚油酸处于脂肪酸带代谢的核心位置；苹果酸处于有机酸代谢的核心位置，是典型的有机酸，赋予了产品良好的风味。富含共轭亚油酸发酵乳可提高肠道菌群中拟杆菌门和双歧杆菌的丰度，使肠道菌群恢复平衡，促进初级胆汁酸的分泌，在双歧杆菌和拟杆菌的作用下将初级胆汁酸转换为次级胆汁酸，从而实现胆汁酸代谢良性循环，达到减肥降脂的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本申请中高产共轭亚油酸菌株随着菌体密度和信号分子强度的增加，S-腺苷-L-蛋氨酸代谢通路上调，luxS/AI-2群体感应***被激活，正向调控关键酶(eno,MCRA)的表达，提高菌体将亚油酸转换成CLA的效率，进而提高CLA的产量。
(2)使用发酵乳杆菌L1可生产风味、质地良好，活菌数和共轭亚油酸高的发酵乳。该发酵乳产品的特征成分为脂肪酸、氨基酸、有机酸、生物碱、木脂素。所有特征成分中脂肪酸的含量最高，亚油酸处于脂肪酸代谢的中心位置，促进了花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、α-亚麻酸代谢，以及共轭亚油酸的生成；典型的有机酸为苹果酸，赋予了产品良好的风味。该产品是一款活性成分丰富、共轭亚油酸和益生菌含量高的发酵乳。
(3)富含共轭亚油酸发酵乳可提高肠道菌群中拟杆菌门和双歧杆菌的丰度，使肠道菌群恢复平衡；上调与胆汁酸代谢相关基因、PPAR信号通路、初级胆汁酸生物合成途径的表达，促进初级胆汁酸的分泌；在双歧杆菌和拟杆菌的作用下将初级胆汁酸转换为次级胆汁酸，从而实现胆汁酸代谢良性循环，达到减肥降脂的效果。
附图说明
图1发酵乳杆菌L1的形态学特征；左图为发酵乳杆菌L1在MRS琼脂平板菌落形态图，右图为发酵乳杆菌L1革兰氏染色镜检图；
图2发酵乳杆菌L1在4种发酵底物中的CLA产量；
图3不同乳制品CLA含量比较，注：L1为本申请的富含共轭亚油酸发酵乳；M1-M4代表4种不同市售全脂乳；Y1-Y4代表4种不同的市售酸奶；
图4三种发酵乳的代谢物概况；
图5富含共轭亚油酸发酵乳指纹图谱；
图6发酵乳对摄食量的影响注：11到13周内不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)；
图7发酵乳对小鼠体重的影响注：11到13周内不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)；
图8不同分组的小鼠体型和腹部脂肪大小注：A：不同分组的小鼠体型；B：不同分组的小鼠腹部脂肪大小。
图9不同分组的脏器重量注：A：腹部脂肪重量；B：心脏重量；C：肝脏重量；D：脾重量；E：肾重量；
图10小鼠肠道微生物的属水平差异；注：左侧是Bray-Curtis距离聚类树结构，样品聚类越近，分支越短，代表分组物种组成越相似；右侧的是各分组在门水平上的物种相对丰度分布图，所占比例越大表示丰度越高；
图11不同处理组的胆汁酸代谢途径中代谢物的表达量；
图12富含共轭亚油酸发酵乳降脂机制一览图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1菌种的分离纯化
取采自大理喜洲的牛乳样品10ml，加入到100mL无菌生理盐水中荡均匀，梯度稀释后吸取100uL涂布在1％CaCO3-MRS固体培养基上，于37℃中培养48h。挑选CaCO3-MRS固体培养基上形成溶钙圈的菌落在MRS固体培养基上反复划线进行纯化，直到菌株的菌落形态一致。将纯化的乳酸菌接种于MRS斜面培养基于4℃保存，并将菌株与20％甘油接入冻存管中，混合均匀后于-80℃保藏。
将吐温-80和0.04％LA(亚油酸)的LA/MRS培养基以1∶1比例混合后，加入蒸馏水，油水比(LA∶水)为1∶1，混合后在冰水浴下进行超声乳化：功率：80w，单次超声乳化时间：10s，间歇时间：15s，总超声时间：20min，乳化结束后，于90～95℃下杀菌5～8min。
将筛选得到的菌种活化至第三代，镜检后按6％(v/v)的接种量接种于15mL添加了0.04％LA乳化液的MRS液体培养基中，于37℃下发酵培养48h，得到产CLA最高的发酵乳杆菌(发酵乳杆菌L1)。
菌种的鉴定
菌种的形态学特征
如图1所示，发酵乳杆菌L1的形态学特征如下：发酵乳杆菌L1在MRS琼脂培养基培养48h后，菌落形态呈乳白色，半透明，较湿润，光滑，边缘整齐，有明显的凸起。发酵乳杆菌L1的镜检结果为：不产芽孢，革兰氏染色为紫色的阳性菌。
16SrDNA基因测序
使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)提取细菌基因组，以提取到的菌株的基因组为模板，采用细菌通用引物：27F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16SrDNA的PCR实验。将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.gov/blast/)中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的菌株种属。该菌株经16SrDNA基因测序，如SEQ ID NO.1所示，基因测序的结果该序列与发酵乳杆菌的16SrDNA序列同源性超过99％，确定筛选的乳酸菌为发酵乳杆菌。
通过形态学和16SrDNA测序确定筛选的菌株为发酵乳杆菌，并将其命名为发酵乳杆菌L1(Limosilactobacillusfermentum Ll)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：M2023862。
实施例2菌种产共轭亚油酸条件筛选
底物对CLA产量的影响
以红花籽油、辣木籽油、茶籽油和核桃油为发酵底物，探究发酵乳杆菌L1在4种发酵底物中的CLA产量。发酵乳杆菌L1在4种发酵底物中的CLA产量图如图2所示。
由图2可知，发酵乳杆菌L1在4种发酵底物中的CLA产量不尽相同。当发酵底物的浓度在0％～12％的范围内，在添加辣木籽油、红花籽油、茶籽油为底物的发酵液中CLA产量呈先上升后下降的趋势；发酵乳杆菌L1在以核桃油为发酵底物时，CLA的产量呈上升趋势，当核桃油添加量为12％，发酵液中CLA含量为314.86μg/mL。当辣木籽油添加量为8％时，发酵液中CLA含量为858.8μg/mL；当茶籽油添加量为10％，发酵液中CLA含量为532.7μg/mL；当红花籽添加量为6％，发酵液中CLA含量最高为1025.26μg/mL。由此可得，与辣木籽油、茶籽油、核桃油相比，以红花籽油更适合作发酵乳杆菌L1的发酵底物。
培养条件对CLA产量的影响
由于乳酸菌的培养时间、温度和培养液的初始pH值对乳酸菌的生长代谢有影响，为使发酵乳杆菌L1在以红花籽油为发酵底物中CLA产量更高，分别于不同的培养时间、不同培养温度、不同培养液初始pH值、不同接种量下发酵辣木籽油，探究不同培养温度、不同时间、不同培养液初始pH值对活菌数和CLA产量的影响；以及不同接种量对CLA产量的影响。经单因素和多因素分析，最终确定该菌株的最优培养温度为33-35℃，培养时间为20-24h、初始pH值为6.3-6.5。
实施例3降脂发酵乳的制备
活化后的菌种以1％的接种量接入MRS肉汤中培养(37℃，24h)至第三代。用热蒸馏水溶解脱脂乳(10％w/w)后与红花籽油混合(6％w/w)后加入0.01％安赛蜜。在室温下以25-30MPa的参数使用高压均质机均质混合液体5min，重复均质3次。然后将均质液维持在80℃的条件下水浴加热30min,待其温度降至35℃后在无菌环境下将传至第三代的发酵剂以1％(v/v)的接种量接入其中后在35℃的条件下进行培养20-24h得到发酵乳。
进行发酵乳制作时，对照组(control)不含红花籽油和发酵乳杆菌L1，SO(supplementsaf flowerseedoil)组含有红花籽油但不接种发酵乳杆菌L1，L1组(inoculated发酵乳杆菌L1)组含有红花籽油和发酵乳杆菌L1，除以上提到的不同之处，三个处理组均含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(接种量均为1％)，且其他条件不变，每个处理组有三个重复。
实施例4发酵乳的性能检测
富含共轭亚油酸发酵乳工艺及品质分析
不同发酵乳在不同发酵时间段的滴定酸度、pH值和共轭亚油酸含量如表1所示。由表1可知，随着发酵时间的延长，3种发酵乳的TA(滴定酸度)和CLA值都增加，pH值都降低，当发酵时间超过20h时，三种发酵乳的滴定酸度超过120°T，pH值低于4.2。后通过感官评价雷达图的结果发现，所有组相比，L1组的感官评分总体分值在发酵20h后最高，组织状态、润滑程度、酸甜比和香气占有的分值最高。发酵乳具有良好的酸甜比更有助于其被消费者接受。有研究指出，消费者更接受滴定酸度在120°T，pH值在3.9-4.2之间的发酵乳。L1组发酵20h的CLA含量为814.26μg/mL，显著高于其他各组，而发酵24h后感官评分低于20h。为了使产品的风味和CLA含量都较好，综合考虑感官评分和CLA含量，将发酵乳的发酵时间固定在20h。
发酵20h后(冷藏后熟24h)不同发酵乳的质构和微生物指标如表2所示。从表2的结果可知，L1组和SO组的凝胶强度、黏度和持水力均显著高于对照组(p<0.05)；此外，三种发酵乳的活菌数均超过108CFU/mL，其中L1组活菌数最高(为109CFU/mL)。乳制品的质地与脂肪酸密切相关，蛋白质是发酵乳的关键营养成分，也是形成胶体体系的重要因素。发酵乳中的乳清蛋白可以通过氢键、二硫键等与酪蛋白结合，形成可以保持小油滴的多孔结构；此外，这些多孔结构表面的蛋白质还可以阻止油滴的再聚，因此，油滴在这些空隙中可达到稳定状态。随着油脂的加入，发酵乳的杨氏模量(Young’smodulus)提高，这意味着随着发酵乳中油脂含量的增加，发酵乳的失水率将逐渐降低。因此，与脱脂发酵乳(对照组)相比，加入了红花籽油的发酵乳结构更稳定，且具有更好的口感和质地。发酵乳质地、风味和口感与发酵剂有关系。结果表明，添加发酵乳杆菌L1后，发酵乳的硬度、稠度和黏度等性能都有所提高，经发酵乳杆菌L1发酵，L1组的口感和质构都优于SO组。
表1发酵乳在不同发酵时间的滴定酸度、pH值和共轭亚油酸含量
注：表中的不同小写字母表示组内不同发酵时间段对应的指标存在显著差异(p＜0.05)；不同大写字母表示同一发酵时间内组间对应指标存在显著差异(p＜0.05)。
表2发酵乳的质地和微生物指标
注：不同字母表示组间存在显著差异(p＜0.05)。
L1与本土4款牛乳和4款发酵乳比较CLA含量结果如图3所示。由图3可知，L1的CLA含量高于其他8款产品。综上，利用发酵乳杆菌L1与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌复配发酵含红花籽油的脱脂乳20h可得到口感、质地良好，共轭亚油酸和活菌数高的发酵乳。
发酵乳的代谢物概况
对发酵乳中的代谢物进行主成分分析(PCA)，结果如图4-A所示。从图4-A可知，三种样品分布在不同的区间，且三个处理组的3个样品较为聚集，说明三种样品组内重复性好，而组间存在差异。对三种样品中的代谢物(正、负离子合并)两两进行比较，结果如图4-B、C、D所示。由图4-B可知，与对照组相比，L1组共鉴定到4241种差异代谢物(p＜0.05)：有1970种相对上调，2271种下降；SO组与对照组相比(图4-C)，有2045个代谢物含量上升，2663个代谢物含量下调；与SO组相比，L1组有1038个代谢物上调，1149个代谢物下调(图4-D)。这一结果说明使用不同的菌株生产的发酵乳质组成存在显著差异(p＜0.05)。
对差异(p＜0.05)代谢物进行分类，除了不可鉴定的物质外，所有的代谢物可被分成35种类别。L1和SO两种发酵乳的脂肪酸、氨基酸及其衍生物、有机酸、生物碱、木脂素种类较多(5种以上)。富含共轭亚油酸发酵乳中有54种脂肪酸、43种氨基酸及其衍生物、12种有机酸、11种生物碱、6种木脂素。L1组和SO组的特征活性成分种类较为相似，但是含量存在显著差异(p＜0.05)。由此可见，发酵剂和底物均影响了发酵乳的活性成分。
特征活性成分指纹图谱
为了详细解析富含CLA发酵乳的特征成分，对种类较多(5种以上)的代谢物进一步分析，挖掘关键代谢物。由于发酵乳的脂肪酸种类最多，采用KEGG代谢通路注释查找关键的脂肪酸，并对脂肪酸进行定量，以进一步确认脂肪酸的构成比；对有机酸进行代谢通路注释，查找关键有机酸，分析其对发酵乳风味的影响；对氨基酸及其衍生物、生物碱、木脂素进行详细分类，以进一步了解特征成分的构成。基于以上筛查的关键代谢物，构建发酵乳的特征。
活性成分指纹图谱
脂肪酸
L1组和SO组的脂肪酸均在花生四烯酸代谢(arachidonicacidmetabolism)、不饱和脂肪酸生物合成(biosynthesisofunsaturatedfattyacids,)、α-亚麻酸代谢(alpha-Linolenicacidmetabolism)、次生代谢产物生物合成(biosynthesisofsecondarymetabolites)中富集。对这些代谢途径进行整合后，发现这些代谢物的变化与亚油酸代谢途径有关，亚油酸(linoleicacid)处于中心代谢位置。
氨基酸
对氨基酸及其衍生物进行归类，发酵乳中可被鉴定和分类的氨基酸有12种。L1和SO两种发酵乳的氨基酸含量存在差异(p＜0.05)，经过发酵乳杆菌L1发酵，可丰富甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、蛋氨酸的种类，进而丰富发酵乳的氨基酸谱。
有机酸
L1组和SO组的有机酸均在次生代谢产物的生物合成(biosynthesisofsecondarymetabolites)、柠檬酸循环(citratecycle，TCA循环)、乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylateanddicarboxylatemetabolism)、抗生素的生物合成(biosynthesisofantibiotics)、酿酒酵母的生物合成(saccharomycescerevisiae)、氧羧酸代谢(oxocarboxylicacidmetabolism)富集。对这些代谢途径整合分析发现，L-苹果酸处于中心代谢位置。本申请从富含CLA发酵乳中共检测到12种有机酸，其中L-苹果酸、顺式-乌头酸、酮亮氨酸、4,6-二氧代庚酸、戊二酸的含量相对较高。有研究指出顺式-乌头酸在减轻通风(Oliveiraetal,2021)和抑菌方面有较好的效果。关于酮亮氨酸、4,6-二氧代庚酸、戊二酸的功效鲜见报道。在本申请中，三种发酵乳的滴定酸度与苹果酸含量的变化趋势相同。当所有样品发酵20h时，对照组中苹果酸含量最高，其次是SO组；而L1组的苹果酸和TA含量最低。发酵乳具有良好的酸甜比更有助于其被消费者接受。L1组发酵乳发酵20h后感官评价得分最高，这也可能与苹果酸有关。值得注意的是，L1组在添加红花籽油和发酵乳杆菌L1后，脂肪被发酵乳杆菌L1代谢。苹果酸是TCA循环的重要底物，且TCA循环产生的ATP为发酵乳杆菌L1的不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸生物合成、亚麻酸代谢提供了能量。这意味着为了给其他代谢活动提供能量，L1组的苹果酸在其他代谢途径中被消耗，故L1组的苹果酸低于其他两个组，而苹果酸的含量恰好为L1组带来了良好的酸甜比。
其它特征成分
本申请在发酵乳中检测到了11种生物碱，其中部分生物碱的减肥效果已被报道。木脂素大多在植物中发现，且种类繁多，具有抗癌、抗氧化、调节激素代谢水平等功能(Alessandraetal,2018)。本申请中木脂素类共检测到6种物质：N-阿魏酰基-1,4-丁二胺、4-羟基肉桂酸、邻香豆酸间、香豆酸属于肉桂酸和其他未能被鉴定的木脂素(2种)，其中4-羟基肉桂酸、邻香豆酸间、香豆酸属于羟基肉桂酸可被归类为肉桂酸。
指纹图谱的构建
综合考虑发酵乳中特征成分的种类和含量，以及文献报道的功能，对该富含共轭亚油酸发酵乳建立的指纹图谱如图5所示。整个指纹图谱呈现圆形，位于指纹图谱中心的是高产CLA菌株-发酵乳杆菌L1，表明菌体在该款产品的生产中占主导作用；外圈分为5个区域，由脂肪酸、氨基酸、有机酸、生物碱和木脂素构成，占比分别为42.86％、34.13％、9.52％、8.73％、4.76％。脂肪酸主要由共轭亚油酸、亚油酸、棕榈酸和肉豆蔻酸构成。氨基酸由12种物质构成，包括甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等。有机酸主要有戊二酸、L-苹果酸、酮亮氨酸、顺式乌头酸、4,6二氧代庚酸构成。生物碱主要由次黄嘌呤、咖啡因、甜菜碱构成。木脂素类主要由N-阿魏酰基-1,4-丁二胺、4-羟基肉桂酸构成。
原料乳、发酵工艺、发酵剂等变化使乳制品的特征活性成分存在差异。通过鉴定产品的特征活性成分，可全方位了解产品的物质构成和营养特征。越来越多的研究发现多种营养素的协同作用大于单一营养素对人体健康或食品特性的作用，在今后的研究中食品本身的作用与单一营养素的作用应该受到同等重视。总体而言，本申请提供的发酵乳产品是一款富含CLA，并含有益生菌，以及多种活性成分的产品。
综上，可以得出以下结论:
(1)利用发酵乳杆菌L1发酵含红花籽油的脱脂乳，可生产感官、理化、微生物指标合格，风味、质地良好的发酵乳，且该产品的共轭亚油酸含量和活菌数较高。是一款富含共轭亚油酸、质地细腻、酸甜可口的发酵乳。
(2)富含共轭亚油酸发酵乳有区别于普通酸奶的特征活性成分：主要含有脂肪酸、氨基酸、有机酸、生物碱类和木脂素类等多种特征成分；脂肪酸主要为肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸、共轭亚油酸，亚油酸处于脂肪酸带代谢的核心位置；苹果酸处于有机酸代谢的核心位置，是典型的有机酸，赋予了产品良好的风味。
(3)富含共轭亚油酸发酵乳的特征成分指纹图谱由高产共轭亚油酸的益生菌、脂肪酸(共轭亚油酸、亚油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸)、氨基酸(甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)、有机酸(L-苹果酸、顺式乌头酸、酮亮氨酸、戊二酸等)、生物碱(次黄嘌呤、甜菜碱、咖啡因等)和木脂素(N-阿魏酰基-1，4-丁二胺、肉桂酸)构成。为富含共轭亚油酸发酵乳的鉴定和发酵食品特征活性成分指纹图谱的构建提供了科学依据。
实施例5发酵乳降脂研究
实验动物及分组
3周龄雄性C57BL/6J小鼠，APF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK(湘)2019－0004。将小鼠饲养于12/12h昼夜周期的控温(22±2℃)动物房中(云南农业大学食品科学技术学院动物房)，每个笼子饲养6只老鼠，自由饮水。干预前1周所有老鼠均饲喂普通饲料以适应环境，干预期间每天进行灌胃，发酵乳冻干粉用蒸馏水化开，早晚各一次，每次灌胃容积0.4mL。根据《保健食品功能评价指导原则》(2020年版)将小鼠随机分为6组(每组18只)分别为：(1)正常组(NF)：普通饲料+蒸馏水；(2)模型组(HF)：高脂饲料+蒸馏水；(3)普通酸奶组(HFY)：高脂饲料+中剂量普通酸奶(0.67g冻干粉/次)；(4)高剂量组(HFH)：高脂饲料+高剂量富含共轭亚油酸发酵乳(1g冻干粉/次)；(5)中剂量组(HFM)：高脂饲料+中剂量富含共轭亚油酸发酵乳(0.67g冻干粉/次)；(6)低剂量组(HFL)：高脂饲料+低剂量含共轭亚油酸发酵乳(0.33g冻干粉/次)。适应期和干预期间每隔3d换干净的笼子和垫料，每日更换饲料和水。实验单位使用许可证编号：SYXK(滇)K2015-0002，所有实验流程均符合动物福利规定。
发酵乳对生理、生化指标的影响
对小鼠摄食量、体重的影响
在发酵乳连续干预的13周内，各组小鼠身体和精神状况正常，未出现死亡现象，各组小鼠均能正常饮水进食，小鼠14周内(包含1周适应期)的摄食量和体重分别如图6和图7所示。
由图6的结果可知，对比不同组间每周的摄食情况，可以发现饲喂60％高脂饲料的HFH组摄食量明显高于其他各组，经过发酵乳干预且饲喂高脂饲料的HFH、HFM、HFL、HFY组的摄食量不存在显著差异，说明与高脂组相比，经过发酵乳干预小鼠食欲降低，但与发酵乳的种类和灌胃剂量无关。对比不同时期相同组内的摄食量，小鼠在干预后期的摄食量高于前期，且9周后趋于稳定。这与小鼠鼠龄的增加以及对饲料的适应程度有关。小鼠在出生后4-8周为生长期，出生后60-90d为成年期。随着鼠龄的增加，小鼠的摄食量增加，进入成年期后小鼠的摄食量趋于稳定。当小鼠在适应期(饲喂普通饲料)转入干预期(饲喂高脂饲料)，由于高脂饲料与普通饲料的原料配比存在较大差异，小鼠还未能及时适应饲料，故在干预第一周的摄食量较低；此外，由于本实验用的普通饲料及高脂饲料原料配比不同，使饲料密度和重量不同(高脂饲料：6.88g/粒，普通饲料：2.92g/粒)，故HFH组的摄食量高于其他各组。
由图7的结果可知，在第1周适应期和13周(第2-14周)的干预期内，小鼠的体重逐渐增加，到第9周逐渐趋于稳定，第9周后，HF组的体重明显高于其他各组，NF组的体重最低，其次是HFH组和HFM组。在干预后期(干预11-13周)，高脂模型组小鼠的体重平均值达到34.28g，显著高于其他各组(p＜0.05)；正常组小鼠的体重平均值为27.83g，显著低于其他各组(p＜0.05)，HFH组的平均体重为29.92g，HFM组平均体重为31.15g，HFL组平均体重为32.22g，HFY组平均体重为32.29g。从14周的体重变化曲线看，HFH组的体重与NF组最接近。
综上，与高脂组相比，经过发酵乳干预后小鼠的摄食量降低，但是摄食量降低与灌胃剂量和发酵乳的种类无关。此外，经过富含CLA酸发酵乳干预可显著降低高脂小鼠的体重，尤其是高剂量组对降低高脂小鼠体重的效果最好。
发酵乳对小鼠体型、腹部脂肪大小和脏器指标的影响
经过13周的干预后，各组小鼠的体型和腹部脂肪在1×1的方格中的大小，以及心、肝、脾、肾、脂肪重量分别如图8、图9所示。从图8可知，NF组小鼠体型明显小于其他各组，而HF组小鼠体型在所有分组中最大。富含CLA发酵乳干预后小鼠体型呈现出HFH组、HFM组＜HFL组，HFY和HFL组小鼠的体型接近；从小鼠腹部脂肪的大小可以看出，HF组的腹部脂肪明显大于HFH、HFM、HFL、NF组，其中NF组的腹部脂肪最小，其次是HFH组和HFM组。
从图9的结果可知，NF组的脂肪重量最低，HF组和HFY组的脂肪重量最高，HFH组的脂肪重量与HFM组和HFL组不存在显著差异；HFH组的心脏重量与NF组相比不存在显著差异；NF组的肝脏重量最低，HFY组的肝脏重量最高，而其他各组的肝脏重量未存在显著差异；各组小鼠的脾和肾重量未存在显著差异。综上所述，与正常组相比，经过高脂饲料饲喂，将显著提高小鼠的腹部脂肪重量，使小鼠的腹部脂肪大小和体型偏大；经过不同剂量的富含CLA发酵乳干预，有助于小鼠腹部脂肪和体型回归正常，小鼠的腹部脂肪大小和重量呈现出一定的剂量依赖性；尤其是经过高剂量的富含共轭亚油酸发酵乳干预，可使高脂小鼠的腹部脂肪大小显著降低，使高脂小鼠的体型接近正常组。
发酵乳对小鼠血脂指标的影响
经过富含CLA发酵乳干预后小鼠血清的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)变化如表3的结果所示。高脂饮食显著提高了小鼠血清的TG、TC和LDL-C含量，而HDL-C含量显著降低。与模型组相比，经过高、中、低剂量富含共轭亚油酸发酵乳和普通酸奶干预后均可显著降低小鼠血清中TG、TC和LDL-C含量，提高HDL-C含量。经过高剂量富含共轭亚油酸发酵乳干预后小鼠血脂指标与正常组并无显著差异，低剂量组和普通酸奶组的小鼠血脂指标也无显著差异，且小鼠的血脂指标与灌胃剂量表现出一定的剂量依赖性。TG包含LDL-C和HDL-C，TG、TC、LDL-C含量过高则说明可能患有高脂血症；HDL-C被称为―好胆固醇∥，具有保护心血管的作用(Suastikaetal,2019)。综上所述，经过发酵乳干预可调节高脂小鼠的血脂水平。结合体重和体型变化情况，以及普通酸奶组和低剂量组间的体重和血脂指标未存在显著差异，且生理、生化指标变化表现出一定的剂量依赖性，故选取高、中剂量组、普通酸奶组、正常组和模型组进行后续实验。
表3发酵乳对小鼠血脂指标的影响
注：上标字母不同表示组间差异显著。
发酵乳对肠道菌群、血清代谢和肝脏转录的影响
发酵乳对小鼠肠道菌群的影响
为了进一步探究不同处理组小鼠的肠道微生物的差异和相似性，使用Bray-Curtis(***聚类法中使用最普遍的一个距离指标，主要用于描述样品间的相近程度，距离的大小是进行样品分类的主要依据)对样品中属水平上相对丰度T30的群落进行聚类，结果如图10所示。从图10的结果可知，在属水平上，5个处理组的肠道微生物的相对丰度被聚为4类，其中HF组和HFY组的相对丰度最相似。与HF组相比，HFY、HFM、HFH、NF组的丹毒梭状芽孢杆菌(Erysipelatoclostridium)相对丰度较低。值得注意的是，与高脂组相比，经过富含CLA发酵乳干预后，小鼠肠道中的双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度增加。上述结果表明，通过富含CLA发酵乳干预可改善高脂饮食引起的肠道菌群结构的变化，在减少有害菌Erysipelatoclostridium方面，与富含CLA发酵乳的灌胃剂量呈负相关；同时，富含CLA发酵乳有利于提高高脂饮食小鼠的Bifidobacterium菌群丰度。
发酵乳对小鼠肝脏基因转录的影响
将HFH、HFM、HFY、NF组HF对比后，对两组间差异表达基因进行KEGG富集分析，选取p值最小的前20个KEGG通路绘制气泡图。四个比较组共同注释到的通路是过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路(PPARsignalingpathway)和胆汁分泌(bilesecretion)，这一结果表明，与HF组相比，无论是正常组或是其他三个发酵乳干预组它们的PPARsignalingpathway和bilesecretion代谢都发生了显著变化(p＜0.05)。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是脂肪酸及其衍生物的受体。PPAR有三个亚型(PPARα、β和γ)，在脊椎动物中表现出不同的表达模式，PPAR通过调节肝脏和骨骼肌脂质代谢的基因表达，在清除细胞脂质方面发挥作用，PPARβ参与脂质氧化和细胞增殖；PPARγ促进脂肪细胞分化，增强血糖摄取(Hauner,2010)。胆汁对小肠内脂肪和脂溶性维生素的消化、吸收至关重要；并对清除过多胆固醇、药物和有毒化合物起重要作用。胆汁的分泌取决于肝细胞和胆管细胞的膜转运***的功能，以及胆道结构和功能的完整性(Kostersetal,2008)。胆固醇在肝细胞中被氧化成胆汁酸后与牛磺酸或甘氨酸反应形成初级胆汁酸并进入肠道，经过肠道微生物和胆盐水解酶等作用形成次级胆汁酸，并参与脂肪的乳化和吸收(Klaassenetal,2010)。四个比较组中，HFH组和NF组注释到的相同的代谢通路最多，总共有10个：Retinolmetabolism(视黄醇代谢)、PPARsignalingpathway(PPAR信号通路)、
Chemicalcarcinogenesis(化学致癌)、Bilesecretion(胆汁分泌)、Steroidhormonebiosynthesis(类固醇激素生物合成)、Drugmetabolism-otherenzymes(药物代谢－其他酶)、Ascorbateandaldaratemetabolism(抗坏血酸和盐酸盐代谢)、Arachidonicacidmetabolism(甘氨酸)、Glycine,serineandthreoninemetabolism(丝氨酸和苏氨酸代谢)、Porphyrinandchlorophyllmetabolism(卟啉和叶绿素代谢)。此外，发酵乳干预组(HFH、HFM、HFY)与HF组相比，含有的共同的差异代谢通路是Mineralabsorption(矿物质的吸收)、Endocrineandotherfactor-regulatedcalciumreabsorption(内分泌等因素调节钙再吸收)PPARsignalingpathway，以及Bilesecretion。综上所述，通过发酵乳干预确实能改变高脂饮食小鼠的肝脏基因转录，而这些改变也中在与脂肪酸代谢相关的PPARsignalingpathway(过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路)和bilesecretion(胆汁分泌)方面。
为了进一步研究肝脏基因转录的差异表达情况，聚焦主要代谢途径，寻找发酵乳干预后引起的主要通路的变化，本申请将5个处理组中关于PPARsignalingpathway(过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路),bilesecretion(胆汁分泌)和Primarybileacidbiosynthesis(初级胆汁酸生物合成，属于bilesecretion通路)的差异基因进行差异基因聚类热图分析，NF组和其他4个组的基因表达存在显著差异(p＜0.05)，
NF组大部分与胆汁酸代谢相关的基因相对于其他4个添加了高脂饮食组(HF、HFH、HFM、HFY)下调；经过发酵乳干预后(HFH、HFM、HFY)与胆汁酸代谢相关的基因上调数量存在差异HFH＞HFM＞HFY。值得注意的是，与NF组相比，大量报道的与胆汁酸代谢相关的基因CYP7A1、CYP27A1、CYP81、PPARα、PPARβ、PPARγ地表达在HFH组中上调。总体而言5个处理组的肝脏基因转录存在差异，经过富含CLA发酵乳干预可上调高脂饮食小鼠的胆汁酸代谢途径中相关基因的表达。
发酵乳对血清代谢的影响
为了进一步研究发酵乳对高脂小鼠血清代谢的影响，并查找关键代谢通路，将HF组对正常组(NF)和发酵乳干预组(HFH、HFM、HFY)的差异代谢物进行KEGG注释，从HF组对4个处理组的差异代谢物富集的代谢通路数量分析，从多到少依次是：HFVSNF(25条)、HFVSHFY(9条)、HFVSHFM(9条)、HFVSHFH(8条)，HFVSNF共注释到25条代谢通路。与高脂饮食组相比，其他4个组的差异基因共同注释到4条代谢通路：泛酸和辅酶A的生物合成(PantothenateandCoAbiosynthesis)，嘧啶代谢(Pyrimidinemetabolism)，不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesisofunsaturatedfattyacids)，初级胆汁酸生物合成(Primarybileacidbiosynthesis)。PantothenateandCoAbiosynthesis主要为辅助因子和维生素的代谢，Pyrimidinemetabolism与核苷酸代谢息息相关，Biosynthesisofunsaturatedfattyacids和Primarybileacidbiosynthesis与脂肪酸和胆固醇代谢也有相关性。总体而言，经过发酵乳干预后，高脂小鼠的血清代谢水平发生了明显的变化。
由于肝脏转录组和血清代谢组的代谢途径注释结果均指向与胆汁酸代谢相关的途径；灌胃高剂量的富含CLA发酵乳对高脂小鼠的干预效果最好，以及不同组间16SrRNA肠道微生物多样性、肝脏基因转录表达情况和血清代谢物表达情况的主成分分析结果显示，HFH组与NF组最接近。本申请选取与肝脏转录组样本编号相同的小鼠血清样本，研究HFH组、NF和HF组的胆汁酸代谢相关通路(PPARsignalingpathway、bilesecretion、Primarybileacidbiosynthesis)代谢物的表达量，结果如图11所示。从图11可知，HFH组的胆汁酸代谢途径中的代谢物发生了明显的上调，值得注意的是HFH组的鹅去氧胆酸(Tauro-Chenodeoxycholicacid)和熊去氧胆酸(Ursodeoxycholicacid)的含量高于NF组和HF组。
发酵乳对肠道菌群和胆汁酸代谢的影响
综合小鼠肝脏基因转录组和血清代谢组的结果可以发现，高脂小鼠经过发酵乳干预后，与脂肪酸代谢和胆汁酸代谢相关的通路均发生了改变。胆汁酸代谢在调节脂肪代谢中发挥了重要的作用；而本申请还发现高脂小鼠经发酵乳干预后肠道菌群发生了明显的变化。
肝脏基因转录与胆汁酸代谢
高剂量灌胃组与高脂组(HFHVSHF)和正常组与高脂组(NFVSHF)的胆汁酸代谢物与胆汁酸代谢相关基因进行关联分析。结果发现差异代谢物与胆汁酸代谢中的基因表现出一定的相关性，尤其是PPARα(Ppara)、PPARβ(Ppard)、aPPARγ(Pparg)、Cyp7a1、Cyp27a1、Cyp8b1与PPAR信号通路(PPARSignalingpatyway)通路中的代谢物，以及鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸呈现正相关关系。从肝脏转录组的结果得，到在HFH组中PPARα、PPARβ、PPARγ、Cyp7a1、Cyp27a1、Cyp8b1表现出上调，由此可以判定经过富含共轭亚油酸发酵乳干预可上调PPARSignalingpatyway的基因(PARα、PPARβ、aPPARγ)和初级胆汁酸生物合成(Primarybileacidbiosyntheie)途径的基因(Cyp7a1、Cyp27a1、Cyp8b1)表达，并提高鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸的含量。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是调节目标基因表达的受体，是配体激活的转录因子，能够诱导几乎每一种细胞类型中数百个基因的表达。PPAR通过调节肝脏和骨骼肌脂质代谢的基因表达，在清除细胞脂质方面发挥作用。PPAR每一种亚型都有不同的功能，PPARα、PPARβ参与脂质氧化和细胞增殖，PPARγ促进脂肪细胞分化，增强血糖摄取。PPARα是PPAR家族中研究最为广泛和深入的，PPARα与肝脏中的脂代谢息息相关，几乎调控肝脏中所有与脂质代谢相关的基因表达，包括脂肪酸摄取、细胞内脂肪酸激活和结合、脂肪酸延伸和去饱和，甘油三酯和脂滴的形成和分解，血浆脂蛋白代谢等。在调节胆汁酸代谢的过程中，PPAR家族与视黄醛衍生物X受体(retinoidXreceptor,RXR)结合为异二聚体，识别胆汁酸代谢靶基因(CYP7A1、CYP27A1、CYP81等)并启动靶基因的转录，促进胆汁酸代谢，降低血脂。
经典的胆汁酸合成途径由胆固醇7α-羟化酶(cholesterol7α-hydroxylase,CYP7A1)启动，该途径也是成年人胆汁酸合成的重要途径。CYP7A1将7α位的胆固醇羟基化，形成7α-羟基胆固醇，并由3β-羟基-Δ5-C27-steroid脱氢酶(HSD3B7)转化为7α-羟基-4-胆甾-3-酮(命名为C4)，C4是胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)的共同前体，CA和CDCA是人类肝脏中的两种主要胆汁酸(Gonzálezetal,2017)。在小鼠和人体内，CDCA中的7α-OH基团可以异构化为7β-OH形成熊去氧胆酸(UDCA)。与HF组相比，HFH组的CDCA的含量上调。综上所述，高脂饮食小鼠经过富含CLA发酵乳干预，可上调PPAR信号通路部分代谢物的表达，并上调胆汁酸代谢中CYP7A1、CYP27A1、CYP81基因的表达，促进初级胆汁酸的合成。
肠道微生物与胆汁酸代谢
高剂量灌胃组与高脂组(HFHVSHF)和正常组与高脂组(NFVSHF)的胆汁酸代谢物与属水平上的肠道微生物进行关联分析，结果可知Firmicutes和Erysipelatoclostridium与鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸呈现负相关关系；而Bacteroidales和Bifidobacterium与PPAR信号通路中的部分代谢物，以及鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸呈现正相关关系。肠道微生物与胆汁酸代谢密切相关，有研究发现初级胆汁酸在肠道微生物作用经过肠道微生物的胆盐水解酶和7α-羟基类固醇脱氢酶(7-HSDH)的作用生成次级胆汁酸(脱氧胆酸、石胆酸和酮基石胆酸)，机体通过肠肝循环实现胆汁酸的再利用。Ridlon等人(2005)发现初级胆汁酸在肠道内的转化成次级胆汁酸与主要与肠道中的Bacteroidales和梭状芽孢杆菌(Clostridium)有关，在这些菌的胆盐水解酶(Biliarysalinehydrolyase，BSH)作用下将牛磺酸和甘氨酸与胆汁酸盐去结合，形成次级胆汁酸，然后这些次级胆汁酸部分被利用，一部分通过肠肝循环回到肝脏进行下一轮的循环。目前已经在一些细菌中发现了BSH，这些细菌主要属于厌氧菌，如Bacteroidales、梭菌属、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和大肠杆菌属(Escherichiacoli)；此外，BSH还有助于菌体对胆汁酸建立耐受，从而在次级胆汁酸转换和胆汁酸环境中维持活性(Jonesetal,2016)。Liang等人(2020)发现动物双歧杆菌亚种具有降低高脂血症小鼠血脂水平的功效，同时动物双歧杆菌亚种可上调肝脏LXR受体的转录水平，以及CYP7A1的蛋白表达，从而调节胆汁酸代谢。肠道微生物在肝脏胆汁酸代谢中起关键作用，这种交互作用构成了肠-肝轴，肠道微生态的稳态是肠-肝轴良性循环的基础。胆汁酸不仅与脂肪消化代谢息息相关，在肠－肝循环中依托负反馈调节机制作为连接肠道微生态和肝脏胆汁酸代谢的信号分子发挥重要的传递作用。一旦肠道微生态出现紊乱，将影响胆汁酸循环，从而使脂代谢失调。综上所述，经过富含CLA发酵乳干预，可调节高脂小鼠的肠道微生物，提高双歧杆菌属和拟杆菌属丰度，调节肠道微生物恢复平衡的同时，促进次级胆汁酸分泌，从而实现脂肪的乳化和吸收，达到降脂效果。胆汁酸代谢与富含共轭亚油酸降脂机制
综合分析以上结果可得，高脂饮食小鼠经过富含CLA发酵乳干预，可上调肝脏中PPAR受体的表达，诱导肝脏中胆汁酸代谢的关键基因(CYP7A1、CYP27A1、CYP81)的表达，进而促进初级胆汁酸(鹅去氧胆酸)的分泌；同时，经过该发酵乳干预，可提高小鼠肠道中,双歧杆菌属和拟杆菌属丰度；降低厚壁菌门和丹毒梭状芽孢杆菌丰度，使厚壁菌门和拟杆菌门的比值(F/B)降低，起到恢复高脂饮食小鼠肠道微生物平衡的效果。在双歧杆菌属和拟杆菌属的作用下，初级胆汁酸被转变为次级胆汁酸，次级胆汁酸参与脂肪的乳化和吸收，使高脂小鼠的血清中TC、TG、LDL-C含量降低HDL-C含量增加，并降低小鼠的体重和体脂水平。综上所述，富含CLA发酵乳可通过促进胆汁酸代谢，并恢复高脂小鼠的肠道微生态平衡，通过肠-肝轴的胆汁酸良性循环达到减肥降脂的效果(图12)。
综上所述，(1)富含CLA发酵乳可改善高脂小鼠的生理、生化指标：高脂小鼠经过高剂量的CLA发酵乳干预可显著降低小鼠的摄食量、体重、腹部脂肪重量，使高脂小鼠的体型和腹部脂肪与正常小鼠接近。同时，经过CLA发酵乳干预，高脂小鼠的各项血脂指标趋于正常；
(2)富含CLA发酵乳对高脂小鼠肠道微生物、血清代谢和肝脏转录的正向调节：经过富含CLA发酵乳干预后，高脂小鼠的肠道微生物多样性提高，在门水平上，提高了高脂小鼠拟杆菌门的丰度，降低了F/B；在属水平上，降低了丹毒梭状芽孢杆菌的丰度，并提高了双歧杆菌的丰度。经过干预后，高脂小鼠的肝脏基因转录水平发生了变化，这些差异基因的代谢通路主要集中在与胆汁酸代谢相关的通路，小鼠肝脏中与胆汁酸代谢相关的关键基因(Cyp7a1、Cyp27a1、Cyp8b1、PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ)均表现出上调。高脂小鼠经过CLA发酵乳干预后血清代谢物发生了变化，不同处理组与高脂组间的差异代谢物在初级胆汁酸生物合成(Primarybileacidbiosynthesis)富集。
(3)差异代谢物与肝脏基因转录组的关联分析显示：CYP7A1、CYP27A1、CYP81、PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ基因和胆汁酸代谢中的代谢物呈现出正相关关系；属水平的肠道微生物和差异代谢物的关联分析结果显示，拟杆菌门和双歧杆菌与胆汁酸代谢中的代谢物呈现出正相关关系。综上所述，高脂饮食小鼠经过富含CLA发酵乳干预后，可上调与胆汁酸代谢相关基因的表达，并促进初级胆汁酸的分泌，同时可恢复肠道微生物平衡，并在双歧杆菌和拟杆菌的作用下将初级胆汁酸转换为次级胆汁酸，促进胆汁酸代谢，通过肠-肝轴的良性循环达到减肥降脂的效果。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种产共轭亚油酸菌株，其特征在于，所述菌株命名为发酵乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)L1，保藏编号为CCTCC NO：M2023862，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2023年5月30日。
2.一种含有权利要求1所述的产共轭亚油酸菌株的微生物制剂，其特征在于，每毫升或者每克微生物制剂中菌浓度不低于1×109CFU。
3.根据权利要求1所述的产共轭亚油酸菌株或者权利要求2所述的微生物制剂在制备共轭亚油酸中的应用。
4.一种降脂发酵乳，其特征在于，所述发酵乳采用权利要求1所述的产共轭亚油酸菌株发酵得到；或者采用权利要求2所述的微生物制剂发酵得到。
5.根据权利要求4所述的降脂发酵乳，其特征在于，所述降脂发酵乳制备过程如下：采用蒸馏水溶解脱脂乳后，加入红花籽油和安赛蜜混合，在室温下以25-30MPa的参数使用高压均质机均质混合液体3-10min，重复均质2-4次；然后将均质液维持在75-85℃的条件下水浴加热20-40min，待温度降至33-37℃后在无菌环境下将发酵乳杆菌L1接入均质液中，然后在33-36℃的条件下进行发酵。
6.根据权利要求5所述的降脂发酵乳，其特征在于，所述发酵乳杆菌L1活化后以0.8-1.5％的接种量接入MRS肉汤培养基中培养至第三代，然后接种到均质液中，接种量为0.5-3％。
7.根据权利要求6所述的降脂发酵乳，其特征在于，所述发酵乳采用发酵乳杆菌L1、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同作为发酵剂；所述发酵乳杆菌L1、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1.5-2.5：0.8-1.2：0.8-1.2。
8.根据权利要求5所述的降脂发酵乳，其特征在于，所述脱脂乳的添加量为8-15％，红花籽油的添加量为5-7％，安赛蜜的添加量为0.008-0.015％。
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