CN116870162A - Stat3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗结直肠癌药物中的应用 - Google Patents

Stat3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗结直肠癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗p‑STAT3激活或p‑STAT3低表达的实体肿瘤药物中的应用。所述的p‑STAT3激活的实体肿瘤为敏感结直肠癌。所述的p‑STAT3低表达的实体肿瘤为奥沙利铂耐药结直肠癌。联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂治疗p‑STAT3激活的结直肠癌具有很好的协同效果，同时，联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂可以使p‑STAT3低表达的结直肠癌耐药细胞对奥沙利铂敏感性增加，增强了奥沙利铂在抑制CRC增殖、侵袭和迁移方面的作用，明显抑制CRC肿瘤在体内的生长速率，对p‑STAT3低表达的奥沙利铂耐药结直肠癌具有很好的协同效果。

Description

STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗结直肠癌药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗结直肠癌药物中的应用，具体涉及STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗奥沙利铂耐药性结直肠癌药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)是全世界癌症相关死亡的最常见原因之一，2023年新诊断病例140000例，死亡53200例。许多CRC患者在发生***转移或远处转移的晚期才被诊断出来。尽管在手术、化疗、分子靶向药物和免疫治疗转移性结直肠癌(mCRC)患者方面有了显著改善，但患者的3年或无病生存率仍然很低。
奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)是第三代基于铂(Pt)的化疗药物，结构如式(II)所示：
奥沙利铂与5-氟尿嘧啶和亚叶酸钙的联合使用(FOLFOX)是临床上治疗转移性结肠癌的经典一线方案，可获得近50％的缓解率，提高患者5年生存率及生存质量，但仍有约40％的患者对该化疗方案不敏感。研究称，联合使用西妥昔单抗、亚叶酸钙、5-氟尿嘧啶和Oxaliplatin(FOLFOX-4)可能会为RAS野生型mCRC患者带来良好的临床结果，增加无病生存期(DFS)和总生存期(OS)率。然而，在接受基于Oxaliplatin的化疗(CapeOx或FOLFOX联合贝伐珠单抗)治疗的mCRC患者中，中位DFS仅为9.4个月，中位OS仅为21.3个月。此外，研究人员发现mCRC患者对FOLFOX的总体反应率<50％。因此，对基于OXA的化疗的耐药性仍然是治疗mCRC患者的主要障碍，对奥沙利铂耐药机制的研究已成为临床上亟待解决的问题，而找到延迟或克服耐药性的策略对于改善结直肠癌患者的预后也是必要的。
信号转导和转录活化因子(STAT)蛋白家族为生物免疫***中最重要的转录因子活化转录因子之一。在所有的结直肠的肿瘤中，结肠癌的STAT3异常表达率达72％，而在结直肠腺瘤中则占18％。因此阻断STAT3相关信号转导通路或可有效遏制结直肠癌细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移等恶性生物学行为，并且STAT3可以协助癌细胞逃避药物杀伤，而STAT3在肿瘤耐药过程中的作用机制可能与STAT3调控细胞周期以及调亡基因有关。
全球共报导了14项应用STAT3抑制剂***的临床试验，包括单独使用或者联合化疗使用，用于早期、晚期或转移结直肠癌。然而，还未见STAT3抑制剂在制备奥沙利铂耐药性结直肠癌药物中的报道，也未见STAT3抑制剂联合奥沙利铂耐药性结直肠癌药物中的报道。
发明内容
发明人发现了一种通过调节STAT3发挥抗癌作用的途径。铂类药物对STAT3途径的影响与结直肠癌耐药相关，并且奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞具有低表达的磷酸化STAT3(p-STAT3)水平，这与奥沙利铂对STAT3的抑制相关。发明人基于该发现提出利用STAT3抑制剂进行针对p-STAT3高表达的结直肠癌细胞以及p-STAT3低表达的奥沙利铂耐药结直肠癌的治疗。细胞CCK-8增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验和小鼠体内成瘤实验结果显示，STAT3抑制剂LY1可以显著抑制p-STAT3激活的结直肠癌细胞，从而达到靶向抑制结直肠癌发生的作用。进一步发现LY1联合奥沙利铂可以明显抑制奥沙利铂耐药结直肠癌细胞在裸鼠体内的增长速率，联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂对p-STAT3高表达的结直肠癌细胞以及p-STAT3低表达的奥沙利铂耐药结直肠癌均具有很好的协同效果。
因此，本发明提出了通过联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂对p-STAT3高表达(即p-STAT3激活)的结直肠癌细胞以及p-STAT3低表达的奥沙利铂耐药结直肠癌进行靶向治疗的策略。
本发明的目的在于提供STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗p-STAT3激活或p-STAT3低表达的实体肿瘤药物中的应用。
所述的JAK2/STAT3信号通路为活化的JAK2(Janus Kinase 2)磷酸化修饰STAT3(Signal transducer and activator of Transcription 3)，磷酸化的STAT3以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。
所述的STAT3抑制剂为阻断JAK2/STAT3信号通路的小分子化合物、抗体或核酸类药物。
优选的，所述的STAT3抑制剂选自结构如式(I)所示的化合物LY1：
所述的p-STAT3激活的实体肿瘤为敏感结直肠癌。
所述的p-STAT3低表达的实体肿瘤为奥沙利铂耐药结直肠癌。
所述的STAT3抑制剂和奥沙利铂的物质的量之比1:2～1:10，优选为1:3～1:5。
本发明的另一个目的是提供STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗奥沙利铂耐药结直肠癌药物中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种治疗p-STAT3激活或p-STAT3低表达的结直肠癌的组合物，该组合物以STAT3抑制剂和奥沙利铂为主要有效成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂治疗p-STAT3激活的结直肠癌具有很好的协同效果，同时，联合使用STAT3抑制剂与奥沙利铂可以使p-STAT3低表达的结直肠癌耐药细胞对奥沙利铂敏感性增加，增强了奥沙利铂在抑制CRC增殖、侵袭和迁移方面的作用，明显抑制CRC肿瘤在体内的生长速率，对p-STAT3低表达的奥沙利铂耐药结直肠癌具有很好的协同效果。
附图说明
图1为结直肠癌敏感细胞株HCT 116和HCT 8以及结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株HCT 116L和HCT 8L的细胞形态。
图2为结直肠癌敏感细胞株HCT 116和HCT 8以及结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株HCT 116L和HCT 8L的克隆形成实验结果。
图3为结直肠癌敏感细胞株以及结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株对奥沙利铂的CCK8实验结果；其中，A为HCT 116和HCT 116L对奥沙利铂的CCK8实验结果；B为HCT 8与HCT 8L对奥沙利铂的CCK8实验结果。
图4为结直肠癌耐药细胞株HCT 116L和结直肠癌敏感细胞株HCT 116的细胞侵袭实验结果。
图5为结直肠癌耐药细胞株HCT 8L和结直肠癌敏感细胞株HCT 8的细胞迁移实验结果。
图6为结直肠癌耐药细胞株与敏感细胞株的抗凋亡能力比较结果；其中，与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图7为STAT3-siRNA沉默效率筛选结果。
图8为siRNA敲低后对奥沙利铂耐药细胞株的侵袭和耐药的影响；其中，A为siRNA敲低后HCT 8L对奥沙利铂的敏感性考察结果；B为STAT3敲低后HCT 116L细胞对奥沙利铂的敏感性考察结果。
图9为对STAT3敲低后结肠癌耐药株的增殖抑制的影响。
图10为siRNA敲低后对奥沙利铂耐药细胞株的侵袭的影响。
图11为STAT3敲低后HCT 116L和HCT 8L细胞凋亡的流式细胞术分析结果。
图12为化合物LY1梯度抑制磷酸化Stat3的表达。
图13为不同浓度的化合物LY1、奥沙利铂分别对HCT 116L、HCT 8L细胞的细胞活力的影响结果。
图14为化合物LY1和Oxaliplatin联用对HCT 116L和HCT 8L细胞株的IC50。
图15为化合物LY1、Oxaliplatin及两者联用分别对HCT 116L和HCT 8L后的细胞状态和细胞活力的影响。
图16为化合物LY1和Oxaliplatin联用对抑制结直肠癌耐药株HCT 8L克隆的结果。
图17为化合物LY1和Oxaliplatin联用对抑制结直肠癌耐药株HCT 8L迁移的结果。
图18为化合物LY1和Oxaliplatin联合使用对HCT 116/L和HCT 8/L细胞凋亡的考察结果。
图19为化合物LY1和Oxaliplatin联合使用对裸鼠皮下HCT8L异种移植瘤体积的影响；A为瘤体积，B为分析结果。
图20为化合物LY1和Oxaliplatin联合给药后裸鼠体重变化(N＝6)。
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图进一步说明本发明的技术方案，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株较敏感细胞株对奥沙利铂耐受性更强
通过比较结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株HCT 116L、HCT 8L和结直肠癌奥沙利铂敏感细胞株HCT 116、HCT 8的生物学行为，在体外研究结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株和结直肠癌奥沙利铂敏感细胞株生物学特性的差异。
(1)、形态学观察：分别于6孔板中按100000个细胞/每孔接种上述细胞，含10％FBS和1％ PS(青霉素-链霉素溶液(双抗)，青霉素G钠盐10kU/mL，硫酸链霉素10mg/mL，下同)的1640完全培养基培养3天，用活细胞工作站拍摄HCT 116、HCT 116L、HCT 8、HCT 8L的细胞形态。
(2)、细胞平板克隆实验：分别在6孔板中按1000个细胞/每孔接种上述细胞，含10％FBS和1％ PS的1640完全培养基培养7天，PBS清洗过后用甲醇固定，并用0.1％结晶紫染色，计数比较各组细胞克隆形成数目和大小。
(3)、将四株细胞(HCT 116、HCT 116L、HCT 8、HCT 8L)接种在96孔板中，每孔5000个细胞，含10％ FBS和1％ PS的1640完全培养基孵育24小时；采用1640完全培养基将Oxaliplatin稀释至终浓度分别为0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9、218.7、700μM，采用上述含Oxaliplatin的1640完全培养基孵育48h，使用CCK8测定法鉴定活力。在490nm处读取吸光度。
结直肠癌奥沙利铂耐药株HCT 116L和HCT 8L较敏感株形态发生了较大变化，奥沙利铂耐药细胞株由敏感细胞株的圆形变为长梭形(图1)。但是与敏感细胞株相比，耐药细胞株的增殖能力较弱(图2)。由图3和表1可知，耐药细胞株HCT 116L、HCT 8L对奥沙利铂的抵抗能力大幅度提高。上述结果表明，奥沙利铂结直肠癌耐药株的形态较敏感株形态发生较大变化，增值能力减弱，但是耐药细胞株HCT 116L、HCT 8L对奥沙利铂的耐受性(Resistantindex)较敏感细胞株分别提高了17.69倍和23.40倍。说明奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株较敏感细胞株对奥沙利铂耐受性更强。
表1.HCT 116L和HCT 8L的耐药系数
Cell line IC50(μM) Resistant index
HCT 116 2.95 -
HCT 116L 52.19 17.69
HCT 8 5.44 -
HCT 8L 127.32 23.40
实施例2
奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株较敏感株侵袭和抗凋亡能力更强
通过比较HCT 116L、HCT 8L和HCT 116、HCT 8的生物学行为，在体外研究生物学特性的差异。
(1)、侵袭实验：基质胶(BD生物科学，美国)4℃解冻过夜。在包板前，按照1640无血清生长培养基和基质胶的体积比为1:8，用冷的无血清生长培养基稀释基质胶。将冷却的稀释基质胶(70μL)放置在上室的中心；将板放入培养箱中60分钟以使稀释基质胶凝胶化。将细胞(1×105个/每室)接种到上室1640无血清培养基中，并向下室加入含有15％FBS的1640培养基，迁移的细胞穿过膜并附着在膜的下室侧。孵育48小时后，用结晶紫染色并计数迁移的细胞。
由图4可知，奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株HCT 116L的侵袭能力较敏感株能力更强。
(2)、迁移实验：将HCT 8和HCT 8L细胞接种在六孔板中，采用含10％ FBS和1％ PS的1640完全培养基培养细胞，当细胞达到100％汇合时，使用黄色尖端刮擦细胞并洗涤两次以去除非贴壁细胞，让细胞迁移到划痕区域24小时，并在活细胞工作站下观察拍照，计算伤口愈合百分比。
伤口愈合百分比＝[(间隙面积：0小时)-(间隙面积：24小时)]/(间隙面积：0小时)的平均值
由图5可知，奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株和敏感株的迁移能力差别不大。
(3)、分别将HCT 116、HCT 116L、HCT 8、HCT 8L接种在6孔板中过夜。Control组给予1640完全培养基培养，HCT 116和HCT 116L给药组给予含15μM奥沙利铂(5％葡萄糖溶液配制)的1640完全培养基，HCT 8和HCT 8L给药组给予含25μM奥沙利铂(5％葡萄糖溶液配制)的1640完全培养基，各组细胞孵育24h后，V-FITC和PI分别及共同染色15分钟，对样品进行流式细胞术检测，凋亡早期的细胞膜联蛋白V-FITC呈阳性，PI呈阴性，凋亡晚期的细胞两种染色均呈阳性。由图6可知，奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株较敏感株的抗凋亡能力显著性的提高。
上述结果表明：奥沙利铂结直肠癌耐药细胞株的侵袭能力和抗凋亡能力较敏感株更高。
实施例3
siRNA STAT3敲低后对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株生物学行为的影响
通过siRNA敲低HCT 116L和HCT 8L结直肠癌细胞系，在体外研究STAT3敲低后对结直肠癌耐药细胞生长的影响。
(1)siRNA STAT3沉默效率研究
将对数生长期的HCT 116L和HCT 8L细胞，胰酶消化处理后接种于6孔板中，接种密度5×105/孔，每组设置3个复孔，含10％ FBS和1％ PS的1640完全培养基培养，待细胞80-90％融合时，分别设置Control组、Negative control组、Positive control组和3个ST AT3siRNA组，Negative control组、Positive control组和STAT3 siRNA组细胞进行转染。首先将18μL Lipofectamine 3000和750μL 1640基础培养基轻轻混匀，室温放置5min，再将750μL1640基础培养基与4.5μL Control siRNA(GAPDH siRNA)或STAT3 siRNA(siR NA 1729，siRNA 1272，siRNA 1878，均ddH2O溶解)溶液混合，室温静置20min，形成Lipofectamine3000与control siRNA或STAT3 siRNA复合物溶液。将细胞培养基换成1.5mL新鲜培养基，加入500μL复合物溶液，轻轻摇晃细胞培养板，48h后收样。Control组细胞在含10％ FBS和1％PS的1640完全培养基孵育；Negative control组：将培养基替换成1.5mL新鲜培养基，加入500μL 1640完全培养基培养(18μL Lipofectamine 3000和750μL含10％ FBS和1％ PS的1640培养基)。所有的siRNA的终浓度均为20nM(下同)。
siRNA 1729序列：sense(5'-3')GGGACCUGGUGUGAAUUAUTT；antisense(5'-3')AUAAUUCACACCAGGUCCCTT；
siRNA 1272序列：sense(5'-3')CCCGGAAAUUUAACAUUCUTT；antisense(5'-3')AGAAUGUUAAAUUUCCGGGTT；
siRNA 1878序列：sense(5'-3')GGUACAUCAUGGGCUUUAUTT；antisense(5'-3')AUAAAGCCCAUGAUGUACCTT。
如图7所示，通过WB筛选了三个未知siRNA片段，siRNA敲低后HCT 116L和HCT 8L中的STAT3均显著降低，以siRNA 1878的选择沉默效率最高，因此，选择沉默效率最高的siRNA1878片段进行后续试验。
(2)细胞活力测定：将HCT 116L、HCT 8L接种在96孔板中，每孔5000个细胞，采用1640完全培养基(含10％ FBS和1％ PS)孵育24小时，将奥沙利铂用1640完全培养基分别稀释至0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9、218.7、700μM后与siRNA STAT3共同处理细胞，孵育48小时，并使用CCK8测定法鉴定活力。在490nm处读取吸光度。
结果如图8所示，siRNA敲低后奥沙利铂对HCT 8L的IC50由127.32μM降至12.38μM，对HCT 116L的IC50由52.19μM降至22.84μM，提示STAT3敲低后能够增强奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株的杀伤力。
(3)细胞平板克隆实验：HCT 8L细胞按照1000个/孔接种在六孔板中过夜。分别设置Control组、Oxaliplatin组(Oxaliplatin浓度为25μM)、siRNA组、siRNA+Oxaliplatin组(Oxaliplatin浓度为25μM)。以1640完全培养基(含10％ FBS和1％ PS)稀释药物(siRNASTAT3、Oxaliplatin)后，分别用含药1640完全培养基继续培养，同时以采用1640完全培养基培养作为Control组，培养10天后，PBS清洗过后用甲醇固定，并用0.1％结晶紫染色，计数，比较各组细胞克隆形成数目和大小。
克隆实验结果见图9，提示siRNA敲低后，结直肠癌奥沙利铂的耐药细胞株的增殖能力显著性的降低，敲低STAT3并加入低浓度奥沙利铂能够显著增强奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株增殖能力的抑制。
以上结果表明：结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株对奥沙利铂的敏感度增加(图7、图8)，并且敲低STAT3后耐药株增殖能力降低(图9)。
实施例4
siRNA STAT3敲低后对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株生物学行为的影响
通过siRNA敲低HCT 116L和HCT 8L结直肠癌细胞系，在体外研究STAT3敲低后对结直肠癌耐药细胞生长的影响。
(1)基质胶(BD生物科学，美国)4℃解冻过夜。按照1640无血清生长培养基和基质胶的体积比为1:8，用冷的1640无血清生长培养基稀释基质胶。将冷却的稀释基质胶(70μL)放置在上室的中心，将板放入培养箱中60分钟使稀释基质胶凝胶化。将细胞(1×105个/每室)接种到上室无血清培养基中，并向Control组、Oxaliplatin组、siRNA+Oxaliplatin组的下室分别对应的加入含15％FBS的1640完全培养基、含15μM Oxaliplatin的1640完全培养基、含15μM Oxaliplatin、siRNA STAT3的1640完全培养基，孵育48小时，迁移的细胞穿过膜并附着在膜的下室侧，用结晶紫染色并计数迁移的细胞(图10)。
(2)HCT 116L接种在6孔板中过夜。Control组细胞给予1640完全培养基培养，Oxaliplatin组细胞给予含15μM奥沙利铂(5％葡萄糖溶液配制)的1640完全培养基，siRNA+Oxaliplatin组细胞给予含siRNA STAT3和15μM奥沙利铂(5％葡萄糖溶液配制)的1640完全培养基。各组细胞孵育24h后，V-FITC和PI分别及共同染色15分钟，对样品进行流式细胞术检测，凋亡早期的细胞膜联蛋白V-FITC呈阳性，PI呈阴性，凋亡晚期的细胞两种染色均呈阳性。
结果如图10和图11所示，表明siRNA敲低后结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株对奥沙利铂抑制肿瘤侵袭的能力增加(图10)，并且敲低后耐药株抗凋亡能力降低(图11)。
实施例5
利用STAT3抑制剂(化合物LY1)，通过细胞CCK-8增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验和小鼠体内成瘤实验进行评估。
(一)、通过Western Blot(WB)蛋白免疫印迹实验探究梯度浓度的化合物LY1(0μM、1μM、2μM、4μM)对p-STAT3的抑制，方法参照《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社)，具体步骤如下：
(1)、配制7.5％SDS-PAGE凝胶电泳
使用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒制备7.5％SDS-PAGE凝胶，根据试剂盒说明书，制备7.5％ SDS-PAGE凝胶。将制好的蛋白样品各10μL和蛋白预染Marker 5μL用10μL移液枪注射入胶孔内，以75V电压电泳45min，再将电压调至110V，继续电泳至溴酚蓝完全跑出胶外。
(2)、转膜
在电泳结束前，用剪刀剪取与凝胶差不多大小的PVDF膜和两张厚滤纸纸板，将PVDF膜放于甲醇中浸泡1min活化，同时将滤纸纸板和PVDF膜浸泡于1X转膜缓冲液中平衡，平衡5分钟。电泳结束后，将SDS-PAGE凝胶小心拆下，将凝胶浸泡于1X转膜缓冲液中平衡，平衡5分钟。在半干转膜仪上按阳极-滤纸纸板-PVDF膜-凝胶-滤纸纸板-阴极的顺序安放，小心赶去气泡，以25V电压转膜30min。
(3)、封闭
转膜结束后，把PVDF膜取出，根据蛋白预染Marker所指示的分子量范围，剪取STAT3(88kDa)、p-STAT3(88kDa)和GAPDH(36kDa)所在的分子量区间条带，浸没在5％脱脂奶粉的封闭液中，在水平摇床上室温封闭，封闭1h。
(4)、孵育一抗
用移液器将封闭液吸去，分别向条带中加入用5％山羊血清封闭液稀释1000倍的抗E-cadherin和抗vimentin单克隆抗体，20000倍稀释的抗GAPDH单克隆抗体，于4℃水平摇床上孵育过夜。
(5)、孵育二抗
用移液器将使用过的一抗回收，4℃保存。用1TBST洗涤条带3次，每次10分钟。分别加入用1×TBST稀释的1000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(STAT3、p-STAT3和GAPDH)，于水平摇床中室温孵育1h。
(6)、显色
弃去二抗，用1×TBST溶液洗涤条带3次，前三次每次8min，最后一次15min。将条带取出，在条带上滴加A、B液按体积比1:1预混的ECL显色底物，用凝胶成像***(ChemiDocMPTM Imaging System，BIO-RAD)进行成像。
结果见图12，表明：化合物LY1对STAT3的总蛋白并无抑制作用，对STAT3的磷酸化能够梯度抑制。
(二)、化合物LY1、奥沙利铂的剂量的筛选
细胞活力测定：将HCT 116L、HCT 8L细胞分别接种在96孔板中，每孔5000个细胞，1640完全培养基(含10％ FBS和1％ PS)孵育24小时；使用1640完全培养基将Oxaliplatin稀释至23、24、25、26μM给予HCT 8L；使用1640完全培养基将Oxaliplatin稀释至13、14、15、16μM给予HCT 116L；使用1640完全培养基稀释化合物LY1至1、1.5、2、2.5μM分别给予HCT116L和HCT 8L。含药培养基孵育48h之后，使用CCK8测定法鉴定细胞活力。在490nm处读取吸光度。
结果见图13，选择化合物LY1和奥沙利铂对HCT 116L、HCT 8L细胞的细胞活力为80％左右作为后续的实验剂量：化合物LY1为2μM，奥沙利铂为15μM(HCT 116L)和25μM(HCT8L)。
(三)、细胞活力测定：将HCT 116L、HCT 8L细胞分别接种在96孔板中，每孔5000个细胞，1640完全培养基(含10％ FBS和1％ PS)孵育24小时；使用1640完全培养基稀释Oxaliplatin(HCT 116L：15μM，HCT 8L：25μM)，将化合物LY1稀释至0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μM，经同时含Oxaliplatin和化合物LY1的培养基孵育48h后，使用CCK8测定法鉴定活力。在490nm处读取吸光度。
(四)、细胞活力测定：将HCT 116L、HCT 8L细胞分别接种在96孔板中，每孔5000个细胞，1640完全培养基(含10％ FBS和1％ PS)孵育24小时后；使用1640完全培养基将化合物LY1稀释至2μM后，将Oxaliplatin稀释至0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9、218.7、700μM，经同时含化合物LY1和Oxaliplatin的培养基孵育48h后，使用CCK8测定法鉴定活力。在490nm处读取吸光度。
结果表明：化合物LY1对HCT 116L、HCT 8L细胞株的IC50分别为4.44μM、13.53μM；化合物LY1与Oxaliplatin(HCT 116L：15μM，HCT 8L：25μM)联用后，对HCT 116L、HCT 8L细胞的IC50分别降低至1.34μM和4.01μM；化合物LY1(2μM)与梯度Oxaliplatin联用，奥沙利铂对HCT116L的IC50值由52.19μM降低至16.34μM、对HCT 8L的IC50值由84.78μM降低至20.91μM(图14)。说明与单独使用化合物LY1或奥沙利铂相比，化合物LY1与奥沙利铂联用后，能够显著性的增强奥沙利铂对结直肠癌耐药细胞株的抑制。并且根据曲线推测出：化合物LY1与不同浓度的Oxaliplatin进行联用，两者的物质的量浓度之比为1:2即开始起效。
将化合物LY1(2μM)和Oxaliplatin((HCT 116L：15μM，HCT 8L：25μM))联用分别作用于HCT 116L和HCT 8L，与奥沙利铂单独给药相比，可以明显观察到联用给药的细胞数减少并且凋亡小体产生增多，提示化合物LY1能够显著性的增强奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药株的杀伤力(图15)。
实施例6
利用STAT3抑制剂化合物LY1，通过克隆形成实验、细胞迁移实验进行评估。
(1)、克隆形成实验：将细胞接种在6孔板中，每孔1000个细胞，培养24小时后，将细胞培养基分别替换为含化合物LY1(2μM)的新鲜1640完全培养基(10％ FBS、1％ PS)、含Oxaliplatin(HCT 8L：25μM)的新鲜1640完全培养基、含化合物LY1和奥沙利铂联合(HCT8L：2μM LY1+25μM Oxaliplatin)的新鲜1640完全培养基，以1640完全培养基为对照组(Control)，孵育10天后，取出培养基并用PBS洗涤细胞两次，使用预冷多聚甲醛固定20分钟，结晶紫染色10分钟，洗涤、干燥细胞，计数。
(2)、细胞迁移实验：将细胞(每孔5×105)接种在6个孔中板，当细胞达到100％汇合时，用黄色尖端刮伤，并清洗两次去除非粘附细胞；分别给予含化合物LY1(2μM)的1640完全培养基、含Oxaliplatin(HCT 8L：25μM)的1640完全培养基(10％ FBS、1％ PS)、含化合物LY1和奥沙利铂联用(HCT 8L：2μM LY1+25μM Oxaliplatin)的1640完全培养基，以1640完全培养基为对照组(Control)，24h后观察，并于荧光倒置显微镜拍照。
如图16所示，与单独使用奥沙利铂相比，低浓度的化合物LY1与奥沙利铂联合使用后，HCT 8L细胞数量显著性的降低，提示化合物LY1能够增强奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株的增殖抑制作用。如图17所示，在划痕实验中，与单独使用奥沙利铂相比，化合物LY1和奥沙利铂联用后，HCT 8L细胞的迁移能力显著性的减弱。提示低浓度的化合物LY1就能够增强奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药株的迁移和增殖的抑制作用。
实施例7
利用异种移植小鼠模型探究LY1和Oxaliplatin联用后对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞系的影响。
(1)、利用AnnexinV和PI双染法流式检测细胞凋亡：将细胞接种在12孔板中，1640完全培养基(10％ FBS、1％ PS)培养24h后分别替换成含化合物LY1(2μM)的1640完全培养基、含Oxaliplatin(HCT 116L：15μM，HCT 8L：25μM)的1640完全培养基、二者联用(HCT116L：2μM LY1+15μM Oxaliplatin，HCT 8L：2μM LY1+25μM Oxaliplatin)的1640完全培养基，孵育24h后，V-FITC和PI分别及共同染色15分钟，对样品进行流式细胞术检测，凋亡早期的细胞膜联蛋白V-FITC呈阳性，PI呈阴性，凋亡晚期的细胞两种染色均呈阳性。
结果如图18所示，HCT 116L和HCT 8L单独给予奥沙利铂后凋亡率分别为4.76％和7％，LY1单独给药后HCT 116L和HCT 8L的凋亡率为4.38％和7.75％，Oxaliplatin同等剂量在与低浓度LY1(2μM)联用后，HCT 116L和HCT 8L的细胞凋亡率为18.93％和28.5％，提示化合物LY1能够显著性的提高奥沙利铂对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株的杀伤作用。
(2)、异种移植瘤小鼠，4-6周龄BALB/c nu/nu裸鼠，于左腋皮下接种1×106个/只HCT 8L细胞。接种后裸鼠随机分为安慰剂组(0.9％生理盐水)、STAT3抑制剂组(化合物LY1给药剂量：5mg/kg，0.9％生理盐水配制)、Oxaliplatin组(OXA给药剂量：10mg/kg，5％葡萄糖溶液配制)及联合用药组(化合物LY1给药剂量：5mg/kg，OXA给药剂量：10mg/kg)，每组5只，待肿瘤长到2×2×2mm3后，奥沙利铂尾静脉注射一周两次，化合物LY1口服隔天给药，并测量肿瘤大小。在实验终点(第21天)处死小鼠分离肿瘤组织，统计并称重。
如图19所示，与两个单独给药组相比，联合用药组小鼠瘤重(图19A)和瘤体积(图19B)明显降低，提示化合物LY1在体内能够增强奥沙利铂抑制奥沙利铂耐药结直肠癌的作用。如图20所示，单独给予奥沙利铂后动物体重随着时间推移逐渐降低，但是联合用药组小鼠的体重波动与安慰剂组相比并无差异，提示化合物LY1或许能够降低奥沙利铂的毒性。

Claims (9)

1.STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗p-STAT3激活或p-STAT3低表达的实体肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的p-STAT3激活的实体肿瘤为敏感结直肠癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的p-STAT3低表达的实体肿瘤为奥沙利铂耐药结直肠癌。
4.STAT3抑制剂联合奥沙利铂在制备治疗奥沙利铂耐药结直肠癌药物中的应用。
5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：所述的STAT3抑制剂为阻断JAK2/STAT3信号通路的小分子化合物、抗体或核酸类药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的STAT3抑制剂选自结构如式I所示的化合物LY1：
7.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：所述的STAT3抑制剂和奥沙利铂的物质的量之比为1:2～1:10。
8.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：所述的STAT3抑制剂和奥沙利铂的物质的量之比为1:3～1:5。
9.一种治疗p-STAT3激活或p-STAT3低表达的结直肠癌的组合物，其特征在于：该组合物以STAT3抑制剂和奥沙利铂为主要有效成分。
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