KR102249814B1 - 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 조성물 - Google Patents
칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유함으로써 E-cadherin, β-catenin, α-SMA의 발현 조절, AKT 및 ERK의 인산화 조절 등과 같은 세포의 이동성 또는 침윤성과 관련된 신호전달을 조절하고, 암세포에 의한 파골세포 분화를 저해하여 암전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유함으로써 E-cadherin, β-catenin, α-SMA의 발현 조절, AKT 및 ERK의 인산화 조절 등과 같은 세포의 이동성 또는 침윤성과 관련된 신호전달을 조절하고, 암세포에 의한 파골세포 분화를 저해하여 암전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
Description
본 발명은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
암을 치료하는 많은 방법들이 개발 및 발전되어 왔음에도 불구하고, 아직까지도 암이 다른 장기에 전이되어 완치되지 못하는 경우가 많이 발생하고 있으며, 특히 암에 의한 사인의 대부분이 원발소가 아닌 전이에 의해 필수 장기가 기능하지 못하게 되는 경우이다.
따라서 암의 전이를 효율적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하는 것이 암을 정복하는데 있어서 매우 중요한 과제라고 할 수 있다.
암의 일종인 유방암은 특히 전이가 많이 이루어지는 암종으로 유명하다. 유방암 환자의 약 10%가 진단 당시 이미 전이를 갖고 있을 정도이며, 항암, 절제술 및 화학요법 등의 발전과 치료효과가 향상되고 있음에도 중앙생존기간(MST, Median Survival Time)이 24개월을 넘지 못한다.
또한, 유방암은 세계적으로 여성 암 사망률의 주요 원인으로 진단되고 있으며, 임상학적으로 골전이 발생율은 모든 전이성 유방암의 60 ~ 70%을 차지한다. 병적골절, 척수 압박, 뼈에 대한 방사선 필요성, 뼈에 대한 수술을 포함한 골격관련 증상(SRE, sekeletal related events)이 동반된 경우 골전이 환자의 생존율은 약 2.5% 정도로 현저히 낮아진다.
현재 뼈로 전이된 암은 비스포스포네이트 계열의 약물이나 방사선 및 외과적 수술 등으로 치료를 시도하고 있으나, 비스포스포네이트 계열 약물 투여의 경우 투여방법이 까다롭고 소화계통의 이상반응을 유발함과 더불어 심낭염, 두통, 발열, 내분비계, 위장관계 및 암 유발 등의 부작용을 초래한다.
한편, 전이성 뇌종양은 뇌종양 중 가장 흔한 형태로, 악성종양이 있는 환자의 20 ~ 50% 정도가 뇌로 전이되는 것으로 추정된다. 전이성 뇌종양의 경우 수술이나 방사선을 통한 적극적인 치료법 외에도 증상의 완화를 위해 스테로이드 및 만니톨 같은 보조약물을 사용한다. 그러나 이들은 장기복용 시 호르몬 관련 여러 부작용이 발생할 수 있다. 뇌전이성 암 치료를 위한 기존 항암화학요법은 전뇌병변과 전신에 퍼져 있는 암을 동시에 치료할 수 있는 장점이 있으나 뇌에는 혈액-뇌 장벽(BBB, Blood-Brain-Barrier)이라는 것이 존재하기 때문에 그 효과는 매우 제한적이다.
본 발명자는 상기와 같은 암전이에 따른 문제를 해결할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였으며, 특히 암전이 기전에 선택적으로 작용하여 부작용의 발생 가능성이 낮고 우수한 암전이 억제 효과를 나타낼 수 있는 암전이 억제제를 개발하고자 하였다.
J Oral Biosci. 2019 61(2):95-98.
Trends Cancer. 2019 5(2):95-110.
J Med Econ. 2013 16(1):19-29.
Endocrinol Metab(Seoul). 2016 31(4):485-492.
J Bone Miner Res. 2018 33(12):2099-2113.
따라서 본 발명의 주된 목적은 암전이를 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 암전이 억제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 암전이는 골전이 또는 뇌전이인 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 암전이는 유방암의 전이인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 암전이는 골전이 또는 뇌전이인 것이 바람직하다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 암전이는 유방암의 전이인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유함으로써 E-cadherin, β-catenin, α-SMA의 발현 조절, AKT 및 ERK의 인산화 조절에 따라 세포의 이동성 또는 침윤성과 관련된 신호전달을 조절하고, 암세포에 의한 파골세포 분화를 저해하여 암전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명 조성물의 유효성분인 칼키톡신 티오아마이드 알코올의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 2는 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)이 세포활성 및 세포의 콜로니 형성능에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이다. A, 세포활성 실험결과; B, 세포의 콜로니 형성능 실험결과.
도 3은 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 처리 농도에 따른 암세포의 이동성(migration) 및 침윤(invasion) 억제 효과를 나타낸 것이다. A, 이동성 및 침윤 실험결과; B, A의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 4 및 5는 암세포의 이동성 관련 단백질의 발현에 대한 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과를 나타낸 것이다. 도 4, 칼키톡신 티오아마이드 알코올 처리 농도에 따라 중간엽상피이행(EMT, epithelial to mesenchymal transition) 관련 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과; 도 5, 도 4의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 6은 암세포에 의한 파골세포 분화에서 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과를 나타낸 것이다. 상단, 유방암 세포주(MDA-MB-231) 성장 배지(CM, conditioned media)와 KTA에 처리에 의한 파골세포 분화(파골세포의 전구세포로써 Raw 264.7을 이용) 억제 효과 실험결과; 하단, 상단의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 7은 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 동물실험을 위한 일정표(A)(빨간 화살표: KTA 복용한 기간)와 전이성 동물모델에서 암전이에 대한 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과(B)를 나타낸 것이다. B의 상단, 실험동물의 IVIS 영상 이미지(5주째); B의 하단, 넓적다리뼈(Femur)와 뇌(brain) 부위의 ROI(region of interest) 값에 대한 평균 그래프; CTRL, 대조군; Low, KTA 2㎍/㎏, weight/day 투여군; Medium, KTA 20㎍/㎏, weight/day 투여군; High, KTA 100㎍/㎏, weight/day 투여군.
도 2는 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)이 세포활성 및 세포의 콜로니 형성능에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이다. A, 세포활성 실험결과; B, 세포의 콜로니 형성능 실험결과.
도 3은 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 처리 농도에 따른 암세포의 이동성(migration) 및 침윤(invasion) 억제 효과를 나타낸 것이다. A, 이동성 및 침윤 실험결과; B, A의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 4 및 5는 암세포의 이동성 관련 단백질의 발현에 대한 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과를 나타낸 것이다. 도 4, 칼키톡신 티오아마이드 알코올 처리 농도에 따라 중간엽상피이행(EMT, epithelial to mesenchymal transition) 관련 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과; 도 5, 도 4의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 6은 암세포에 의한 파골세포 분화에서 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과를 나타낸 것이다. 상단, 유방암 세포주(MDA-MB-231) 성장 배지(CM, conditioned media)와 KTA에 처리에 의한 파골세포 분화(파골세포의 전구세포로써 Raw 264.7을 이용) 억제 효과 실험결과; 하단, 상단의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프.
도 7은 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 동물실험을 위한 일정표(A)(빨간 화살표: KTA 복용한 기간)와 전이성 동물모델에서 암전이에 대한 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA)의 효과(B)를 나타낸 것이다. B의 상단, 실험동물의 IVIS 영상 이미지(5주째); B의 하단, 넓적다리뼈(Femur)와 뇌(brain) 부위의 ROI(region of interest) 값에 대한 평균 그래프; CTRL, 대조군; Low, KTA 2㎍/㎏, weight/day 투여군; Medium, KTA 20㎍/㎏, weight/day 투여군; High, KTA 100㎍/㎏, weight/day 투여군.
본 발명은 칼키톡신 티오아마이드 알코올(kalkitoxin thioamide alcohol)이 암전이를 효과적으로 억제할 수 있음을 뒷받침하는 새로운 연구결과를 바탕으로 안출된 것이다.
칼키톡신 티오아마이드 알코올의 화학구조는 도 1과 같다.
본 발명에 따르면 칼키톡신 티오아마이드 알코올은 종양세포의 이동성 및 침윤성을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 칼키톡신 티오아마이드 알코올은 E-cadherin, β-catenin, α-SMA의 발현을 조절하고, AKT 및 ERK의 인산화를 조절하는 등 종양세포의 이동성 또는 침윤성과 관련된 신호전달을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 칼키톡신 티오아마이드 알코올은 종양세포와 골세포들 사이의 신호전달에 관여하여 파골세포 분화를 억제할 수 있다. 종양세포와 골세포 사이의 신호전달, 그리고 이로 인한 파골세포 분화는 암전이에 매우 중요한 기작으로, 상기와 같은 억제효과는 칼키톡신 티오아마이드 알코올이 강력한 암전이 효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 따르면 칼키톡신 티오아마이드 알코올은 실제 동물에서 암전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 암전이 중에서도 특히 골전이 또는 뇌전이를 억제하는데 효과적이다. 이때 골전이는 암세포가 뼈로 전이되는 것을 의미하며, 뇌전이는 암세포가 뇌로 전이되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 암전이 중에서도 특히 유방암의 전이를 억제하는데 효과적이다. 이때 유방암의 전이는 유방암세포가 다른 장기로 전이되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 유방암 중에서도 특히 삼중음성유방암의 전이를 억제하는데 효과적이다. 삼중음성유방암은 면역조직화학염색에서 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로, 비삼중음성유방암에 비해 상대적으로 불량한 예후를 보이며 비특이적 항암치료 이외에 특별한 치료 방법이 없는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 약학 조성물 중 유효성분인 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염의 함량은 용도나 투여방법 등에 따라 다양한 범위로 적용될 수 있으나, 통상적으로 본 발명의 약학 조성물 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 100중량%로 함유할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 약학 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명 약학 조성물의 일일 투여량은 조성물에 함유되는 칼키톡신 티오아마이드 알코올을 기준으로 하루에 약 0.1 내지 10㎎/㎏, 바람직하게는 0.5 내지 2㎎/㎏일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이다.
실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있을 것이다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있을 것이다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있을 것이다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있을 것이다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 유효량을 기준으로 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체와 혼합한 조성물일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품 형태가 가능할 것으로 판단된다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상기 약학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. KTA가 세포의 활성에 미치는 영향 조사(Cell viability assay)
실험에 이용할 세포주(MDA-MD-231 및 Raw 264.7)의 배양을 위해 각각의 세포 성장 배지에 10%의 소혈청을 첨가하여 37℃ 온도가 유지되는 항온배양기 내에서 5% CO2 농도를 유지하며 배양하였다.
칼키톡신 티오아마이드 알코올(이하, 'KTA'라 한다)에 의한 세포독성 및 세포성장률을 조사하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 대조군과 실험군의 배지에 세포(MDA-MB-231, 삼중음성유방암세포주)를 동일한 세포수로 씨딩(seeding)하여 하룻밤(overnight, 약 16시간) 배양한 다음, 실험군의 배지에 KTA를 25, 50, 100nM의 농도로 첨가하고, 24시간, 48시간이 경과하였을 때 96 well 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 세포활성도를 측정하는 방법을 사용하였다.
실험결과, 도 2의 A와 같이 대조군에 비해 유의성 있는 세포독성은 나타나지 않았다.
2. KTA가 세포의 콜로니 형성능에 미치는 영향 조사(Cell colonyformation assay)
KTA에 의한 세포의 콜로니 형성능 분석을 위해, 대조군과 실험군 각각의 6 well 배양접시에 500개의 세포(MDA-MD-231)를 씨딩(seeding)하여 하룻밤(overnight, 약 16시간) 배양한 다음, 실험군의 배지에 KTA를 25, 50, 100nM의 농도로 첨가하고, 2주간 배양하여 배양접시 내 콜로니 형성정도를 확인하고 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 정량화하는 방법을 사용하였다.
실험결과, 도 2의 B와 같이 콜로니 형성에서 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.
3. KTA가 암세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 영향 조사(Transwell migration and invasion assay)
KTA의 처리에 따른 암세포의 이동성 및 침윤성의 변화를 조사하기 위해 세포 이동성(transwell migration)과 침윤(invasion) 측정 방법을 이용하였다.
세포 이동성 실험의 경우, SPL migrarion chamber (SPL, Korea)를 이용하여 3×104 수의 암세포(MDA-MD-231)를 안쪽 부분에 뿌려준 다음, 48시간 후에 chamber 하단으로 이동한 세포의 수를 확인하고 크리스탈 바이올렛 염색을 실시하여 정량하는 방법이고, 세포 침윤 실험의 경우 동일한 chamber 상단에 BD Bioscience 사의 matrigel을 코팅하여 굳은 것을 확인한 후, migration과 같은 방법으로 세포를 접종하고 48시간 후 하단의 이동한 세포를 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 정량하는 방법이다.
실험결과, 도 3의 B와 같이 KTA는 25, 50 및 100nM의 농도에서 통계학적으로 유의성 있게 암세포의 이동성 및 침윤성을 감소시키는 것으로 나타났다.
4. KTA가 암세포 내 단백질 발현에 미치는 영향 조사(Western blot analysis)
KTA의 처리에 따른 암세포 내 단백질 발현의 변화를 조사하기 위해 western blot 방법을 이용하였다.
대조군과 실험군의 배지에 암세포(MDA-MD-231)를 씨딩(seeding)하여 하룻밤(overnight, 약 16시간) 배양한 다음, 실험군의 배지에 KTA를 25, 50, 100nM의 농도로 첨가하고, 48시간 배양하여 세포를 수집하였다.
수집된 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 3번 세척한 후, RIPA 용액 [20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton-X-100, 0.2% 디옥시콜레이트(dexycholate), 프로테아제(protease)와 포스페이트억제제(phosphate inhibitor)]을 이용하여 용해시키고, 30분간 차갑게 얼음에서 유지하였다. 원심분리를 통해 획득된 전체 단백질 성분은 단백질 실험 키트[Protein Assay kit (Bio Rad)]를 이용하여 정량하였다. 동등한 양의 전체 단백질 성분을 SDS-PAGE 젤에서 전기영동하여 PVDF(polyvinylidene diflouride) 멤브레인(Bio Rad)으로 이동시켰다. 특정 단백질의 항원-항체 반응 후 현상하여 화학적 형광 테크닉(Bio Rad)을 이용하여 감광하고 정량하였다.
항체로는 E-cadherin, β-catenin, Vimentin, VEGF, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, α-SMA, β-actin을 위한 특이 항체를 사용하였으며, 이들 항체는 Cell Signaling Technology 또는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.
KTA를 처리한 세포에서 세포의 이동성과 관련된 EMT 마커(marker)들의 발현 변화를 확인한 결과, 도 4와 같이 epitherial marker인 E-cadherin의 발현이 대조군에 비해 KTA 100nM 처리군에서 증가하는 것으로 나타났고, 반대로 mesenchimal marker인 β-catenin, α-SMA의 발현이 KTA 처리 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 반면 Vimentin, VEGF의 발현의 감소는 확인되지 않았다. 또한 세포의 이동성, 침윤성과 밀접한 관련이 있는 p-AKT와 p-ERK 신호체계에 있어서 KTA 처리 농도에 따라 p-AKT와 p-ERK 발현 경감효과를 나타냈다. 이들의 발현 감소는 도 5에서보는 바와 같이 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 관련이 있음을 확인하였다.
5. KTA가 암세포에 의한 파골세포 분화에 미치는 영향 조사(Breast cancer induced osteoclast differentiation in Raw 264.7 cells)
암세포가 증식하기 위해서는 주변 환경과의 상호작용이 매우 중요하다. 뼈로 전이된 암세포는 뼈 내에 존재하는 정상세포들(조골세포 혹은 파골세포)과의 상호간 신호전달을 통해 더욱 활성화 된다. 특히 유방암과 파골세포 분화는 과도한 뼈 손실을 유발하고 동시에 암세포가 뼈로 전이되는 것을 촉진시킨다. 이에 암세포에 의해 파골세포 분화가 유도되는 상황에서 KTA가 이들의 상호관계에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
파골세포 전구세포인 Raw 264.7 세포를 플레이트에 동일한 세포수로 씨딩(seeding)하여 하룻밤(overnight, 약 16시간) 배양한 다음, 유방암세포(MDA-MD-231)의 CM(conditioned media) 배양액을 실험군의 배지와 KTA를 25, 50, 100nM의 농도로 첨가하고 파골세포 분화를 유도하였다. 그 결과, 도 6과 같이 유방암세포(MDA-MD-231)의 CM(conditioned media) 배양액은 Raw 264.7 세포의 파골세포 분화를 유도하고 있고, 이들 유방암세포(MDA-MD-231)의 CM(conditioned media) 배양액에 의해 분화되는 파골세포는 KTA의 농도에 따라 파골세포 분화 정도가 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다.
이는 KTA가 유방암세포와 파골세포의 상호작용에 관여하고 있음을 의미한다.
6. 전이성 동물모델에서 KTA의 효과 조사
루시퍼레이즈(luciferase)와 GFP(green fluorescence protein)는 대표적인 리포터 단백질로서 생물발광(bioluminescence)을 발생시킬 수 있는 연구에 많이 이용된다. 특히 루시퍼레이즈는 ATP와 반응하여 그것의 기질인 D-luciferin을 oxoluciferin으로 전환시키는 촉매제 역할을 하면서 빛을 발생시킨다. 이러한 빛은 생체내부의 장기에서도 발광 및 검출이 가능하기 때문에 루시퍼레이즈를 발현시키는 유전자를 체내 주입시킨 후 리포터 단백질의 발현되는 위치, 정도, 기간 등을 모니터링하는 방법을 사용하면 동물의 희생없이도 실험이 가능하다. 암 연구에서도 암세포에 루시퍼레이즈 발현 유전자를 주입시키고, 동물에 이식하여 암을 유발시키고, 암세포 사멸을 유도할 수 있는 치료제를 주사하여 암세포 치료 및 예방을 위한 연구에 이용한다. 본 실험에서도 이러한 방법을 이용하여 동물실험을 수행하였다.
유방암 세포주 MDA-MB-231(삼중 음성 유방암)에 루시퍼레이즈 벡터(luciferase vector)(pGL4.51, promega)를 LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질전환시키고, hygromycin(항생제)으로 선별하여 안정적인 루시퍼레이즈 양성 세포주인 'MDA231-Luc'을 생성하였다.
100% 산소 1ℓ/min의 isoflurane(BK pham, korea) 2 ~ 3%를 혼합한 흡입가스로 마취를 유지하고, 알코올과 포비돈 요오드액으로 마우스 좌측 흉부를 소독하였다. 흉부에서 심부 박동을 확인한 후, 100㎕에 분산시킨 1×106 개의 MDA231-Luc 세포를 천천히 주입하였다. MDA231-Luc 세포를 좌심실에 주입한 이틀 후부터 KTA를 경구 투여하였다. 전이 종양의 발생과 전이 과정을 추적하기 위해 MDA231-Luc 세포를 주입 후, 2주, 3주, 5주 동안 생물발광 영상을 획득하였다. 증류수에 용해된 luciferin 150㎎/㎏을 복강내 주사하고 5분후 IVIS Spectrum (Perkin Elmer)으로 영상을 획득하였다. 5주 동안 영상 촬영 후 마우스를 안락사시켰다.
실험결과, 도 7과 같이 5주 경과 후, 대조군을 통해 주입된 MDA231-Luc 세포는 뇌(brain)와 대퇴부(Femur) 부위로 전이되는 것을 확인하였고, 이와 비교하여 뇌(brain)와 대퇴부(Femur) 부위로 전이 정도가 KTA의 처리군에서 감소되고 있는 것을 확인하였다.
특히 뇌에는 뇌혈관 장벽으로 인해 약물의 통과가 어렵기 때문에 항암화학요법의 경우 그 효과가 매우 제한적이다. 그러나 본 연구결과 칼티톡신 티오아마이드 알코올(KTA)을 처리한 그룹에서는 전이성 뇌종양의 정도가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 칼키톡신 티오아마이드 알코올(KTA) 또는 그 대사산물이 뇌혈관장벽을 효과적으로 통과하여 뇌로의 전이 및 침윤 정도를 억제시키고 있음을 보여주는 간접적인 결과로 사료되며 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.
7. 통계학적 분석(Statistisal analysis)
상기의 모든 정량 결과는 평균±표준편차(SD)의 결과이며 각각의 실험은 3회 이상 수행하였다. 통계분석은 ANOVA의 방법을 이용하였다(p<0.05).
Claims (6)
- 칼키톡신 티오아마이드 알코올 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 암전이는 골전이 또는 뇌전이인 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 암전이는 유방암의 전이인 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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| J BRIAN MORGAN ET AL, MAR DRUGS, 2015, 13(3):1552_1568 |
| JAMES D WHITE ET AL, CHEM COMMUN (CAMB). 2003;(16):2012_2013 |
| JAMES D WHITE ET AL, ORG BIOMOL CHEM., 2004, 2(14):2092_2102 |
| 이양, 전북대학교 석사논문, 2016.02. |
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