CN116855534B - PdCSD2基因在促进树木生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PdCSD2基因在促进树木生长中的应用，对SEQ ID NO:1所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列以及包含上述核苷酸序列的载体、菌株在促进杨树生长中应用；过表达PdCSD2基因在促进杨树生长中的应用；PdCSD2基因在增加杨树形成层细胞层数和木质部宽度中的应用。本发明提供的PdCSD2基因在促进树木生长中的应用，通过过表达PdCSD2基因可以显著提高树木的株高、茎粗，明显促进树木的生长，加快树木成材的速度；可以显著增加树木形成层细胞数和木质部宽度，为树木的长高、增粗提供源源不断的动力；可以显著增加树木的纤维素含量，提高木材的韧性，使生产的木材具有特定用途成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及PdCSD2基因在促进树木生长中的应用。
背景技术
木材通常是指由维管形成层细胞分化形成的木质部，其形成是一个受基因和环境共同调控的复杂的动态生物学过程，大致可以分为三个阶段：(1)维管形成层细胞***(增殖与分化)；(2)维管形成层细胞向内形成初生木质部(包括木质部导管和纤维细胞)；(3)次生木质部的形成：初生木质部细胞进入程序化死亡，细胞的细胞壁在沉积木质素、纤维素和半纤维素的作用下，细胞壁逐渐加厚，细胞内含物逐渐溶解，最终形成由管状分子、木纤维和薄壁细胞组成的木材。
发明内容
本发明的目的是提供PdCSD2基因在促进树木生长中的应用，以提高树木的生长速度，缓解/解决我国木材产量低，对进口的依赖度高，速生杨木材的韧性差、应用范围窄的问题。
为实现上述目的，本发明提供PdCSD2基因在促进树木生长中的应用。
对SEQ ID NO:1所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列以及包含上述核苷酸序列的载体、菌株在促进树木生长中应用。
过表达PdCSD2基因在促进树木生长中的应用。
PdCSD2基因在增加树木形成层细胞层数和木质部宽度中的应用。
PdCSD2基因在增加树木纤维素含量中的应用。
南林895杨树是南京林业大学“九五”科技攻关选育出的新品种，具有速生、优质、高产等特点，2002年通过国家林木良种审定，并列入国家首批林木良种名录，成为国家***重点推广的杨树新品种(张跃虎,刘刚.杨树新品种南林95杨、895杨繁育技术[J].中国林副特产,2003,000(004):38-39.)，之后很快成为黄河以南的主要杨树种植品种。但是目前对杨树的研究主要针对北方种植的品种，如毛果杨和84K，而对于南林895杨树进行遗传改造进而有效提高其生物产量的方法报道相对较少，对南林895杨树遗传改造成功将对提高黄河以南地区杨树的生物产量以及我国木材的总产量产生重大影响。
因此，本发明提供的PdCSD2基因在促进树木生长中的应用，其具体技术效果如下：
(1)过表达PdCSD2基因可以显著提高树木的株高、茎粗，明显促进杨树的生长，加快树木成材的速度；
(2)过表达PdCSD2基因可以显著增加树木形成层细胞数和木质部宽度，为树木的长高、增粗提供源源不断的动力；
(3)过表达PdCSD2基因可以显著增加树木的纤维素含量，提高木材的韧性，使生产的树木木材具有特定用途成为可能。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例三中对转基因植株的鉴定结果；
图2是本发明实施例四中对转基因植株和野生型植株的转录水平鉴定结果；
图3是本发明实施例五中对转基因植株和野生型植株的株高和地径的统计结果；
图4是本发明实施例五中对转基因植株和野生型植株木质部发育情况的考察结果；
图5是本发明实施例五中对转基因植株和野生型植株的木质素和纤维素含量的测定结果。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
实施例中所用试剂、试剂盒、培养基、仪器设备均通过商业途径获得；实施例中所用的共培养液体培养基的配方、共培养固体培养基的配方、筛选培养基的配方、生根培养基的配方参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。
实施例一
构建PdCSD2基因的过表达载体，方法如下：
(1)利用试剂盒提取“南林895”的总RNA，通过反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA，对获得的cDNA进行PCR扩增，引物F为：5′-CGACTCTAGAAAGCTTATGCAAGCAGCTGCAATGGCAG-3′；引物R为：5′-CGGGCCCCTGCAGAAGCTTATATTGGAGTCAAACCAACAACTCCAC-3′。
(2)利用“HindIII-HF”限制性内切酶对pCAMBIA1300载体进行酶切，通过同源重组法，将PdCSD2扩增片段***到pCAMBIA1300载体的酶切位点之间，PdCSD2基因的CDS序列见SEQ ID NO:1。
(3)通过冰浴、热激等常规操作将步骤(2)获得的重组载体转化入感受态农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)EHA105中，涂板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的菌落摇菌至OD600为0.6-0.8，将菌液置于-80℃留存，具体操作方法参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。
实施例二
杨树叶片的遗产转化，方法如下：
(1)从-80℃冰箱中取出保存的菌液，加入1mL含卡那和利福平抗性的液体LB培养基中，28℃，220rpm孵育24h，以活化菌株，然后取200μL菌液加至50mL含有卡那和利福平抗性的液体LB培养基中培养至OD600为0.6-0.8。
(2)5000rpm，离心10min收集菌体，将菌体在含有浓度为100μM/L乙酰丁香酮(AS)的共培养液体培养基中于28℃，220rpm培养箱中培养至OD600为0.3-0.4，作为侵染液。
(3)取无菌苗的上端第2-5片嫩叶，用无菌刀片在主脉上划3-4刀放入侵染液中浸泡8min左右，将叶片放在灭菌滤纸上吸干水分，平铺到共培养固体培养基上，28℃条件下暗处理两d。
(4)将叶片转至选择培养基上，进行暗培养，当愈伤长至米粒大小后，用无菌刀片切下，转至诱导芽的筛选培养基上进行培养，当愈伤长出嫩芽后，将芽切下***生根培养基中进行培养。
实施例三
DNA阳性植株鉴定，方法如下：
取实施例二中在生根培养基中生长2个月的遗传转化苗，利用CTAB法提取杨树茎的DNA，对杨树茎利用GFP标签引物片段进行阳性鉴定。结果如图1所示。
GFP标签引物序列：
正向引物：5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′
反向引物：5′-CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′。
实施例四
基因转录鉴定，步骤如下：
分别提取野生型和实施例三鉴定的阳性苗叶片的RNA，利用试剂盒分别反转录成cDNA，以PaUBQ基因作内参，进行荧光定量PCR分析，每个样本设置3个生物学重复，结果见图2。
PaUBQ荧光定量PCR分析的特异性引物为:
正向引物：5′-AGACCTACACCAAGCCCAAGAAGAT-3′
反向引物：5′-CCAGCACCGCACTCAGCATTAG-3′。
PdCSD2荧光定量PCR分析的特异性引物为：
正向引物：5′-TTCCTCATTCCATGGCGTCTC-3′
反向引物：5′-AGCAACAACAAAAGGAGGTTGC-3′。
实施例五
表型鉴定，方法如下：
(1)关于株高和地径
将生长情况一致的野生型和PdCSD2转基因阳性苗同时扦插在温室中的营养土中培养(光周期为16h/8h，光照强度为80μmol/m2/s，温度24-26℃，湿度70％)，并进行表型观察。移栽至温室营养土中，前2周设为缓苗期，从移栽的第三周开始每周测量幼苗的株高和地径，统计结果见图3，其中图3的A部分为相应的转基因植株，B部分为株高统计结果，C部分为地茎统计结果。
(2)木质部发育情况
移栽至温室第60d，统计完植株株高和地径后，分别取野生型杨树895和PdCSD2转基因阳性苗的第20茎节(从下往上数)进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋过程获得包含茎节材料的蜡块；用切片机对蜡块进行切片后置于载玻片上，然后用展片机进行展片、封片，然后经过二甲苯、酒精处理的脱蜡过程后，用1％浓度的甲苯胺蓝(TBO)对切片材料进行染色，1min后，用水冲洗，即可用ZEISS显微镜进行观察拍照，具体步骤参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)，结果见图4，其中图4中的B部分为整体茎切面的显微照片，A部分为茎切面形成层部位的放大照片，C部分为茎切面木质部部位的放大照片，A和C部分的标尺均表示50μm，B部分的标尺表示200μm；图4中D部分为形成层细胞层数统计结果；E部分为木质部宽度统计结果；F部分为细胞壁厚度统计结果。
(3)细胞壁总纤维素含量测定
移栽至温室第60d，统计完植株株高和地径后，从下往上数分别取过表达阳性苗和野生型杨树895苗第5节间的茎秆放入液氮中速冻，利用组织破碎仪研磨成粉末，每个材料取约1mL研磨后的样品于2mL离心管中，加入80％的乙醇至1.8mL，12000rpm，离心10min，离心后用移液枪轻轻吸出上层液体，避免吸到沉淀；分别向上述沉淀中加入1mL80％乙醇，12000rpm，离心10min，离心后用移液枪轻轻吸出上层液体，再用1mL无水乙醇两次，12000rpm，离心10min，离心后用移液枪轻轻吸出上层液体，向获得的沉淀中加入1mL氯仿：甲醇＝1:1的混合物，37℃水浴加热40min，12000rpm离心10min，弃上清，重复上述加混合物、水浴、离心步骤一次；将获得的沉淀放入通风橱中，干燥沉淀即得纯净的细胞壁乙醇不溶物(AIR)。
称取2mg上述AIR样品于玻璃管中，贴壁缓慢加入0.5mL 2M TFA，于121℃金属浴中反应90min，溶解半纤维素；反应后的样品于室温冷却，5000g，离心5min，小心去除上清；向离心后得到的沉淀中加入超纯水800μL超纯水清洗沉淀，5000g，离心5min，小心去除上清，重复上述超纯水清洗、离心步骤操作一次；吸尽上清，加入200μL 72％硫酸放室温反应30min，溶解沉淀中的纤维素；向反应后的样品中加入800μL超纯水，12000rpm，离心5min，取500μL上清液作为实验组备用。
葡萄糖标准曲线的配制：称取1mg葡萄糖标准样，溶于1mL超纯水中，配做母液。分别稀释成0、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液，各取500μL进行下面实验；分别在实验组和标准曲线组中按顺序加入0.5mL苯酚(6％)混匀，和2.5mL硫酸(98％)混匀；吸取等量的上述反应溶液加入酶标板中，测定490nm下的吸光度值。绘制葡萄糖浓度和吸光度值的标准曲线，计算出样品中的葡萄糖含量即为纤维素含量。所得结果如图5中B部分所示。
(4)细胞壁总木质素含量测定
称取1mgAIR样品于2mL离心管中(留1个空管做对照)；轻轻加入新配的乙酰溴溶液(25％v/v乙酰溴/乙酸)，沿管壁缓慢加入100μL；盖上离心管的盖子置于水浴锅中，50℃反应2h；继续加热反应1h，中间每15min晃动混匀一次；反应后的材料置于冰上冷却至室温；向冷却后的反应样品中加入400μL 2M NaOH和70μL新配的0.5M盐酸羟氨，涡旋混匀；反应后的样品转移至大的离心管中，准确加入至2mL冰醋酸，混匀；加200μL反应后的溶液至酶标板中，测定280nm下吸光度值。
乙酰溴可溶性木质素(％ABSC)＝abs(吸光度值)/coeff(系数)*0.1cm*2mL*100％/weight(单位：mg)
Coeff：puplar＝18.21；crosses＝17.75。所得结果如图5中A部分所示。
结果分析
由图1可以看出，共得到8株阳性苗OE-1、4、5、6、7、8、10、12。
由图2可以看出，OE-4、OE-6和OE-12三个转基因植株的相对表达量最高，其中OE-6的相对表达量最高，OE-12的相对表达量次之。
由图3可以看出，转基因株系OE-4、OE-6和OE-12的株高依次比野生型增加了13.3％、12.5％和6.7％；茎粗依次增加了17.2％、24.3％和15.4％。
图4的统计结果发现PdCSD2过表达植株基部茎的形成层细胞层数显著增加，且木质部宽度也显著增加；经进一步统计，发现PdCSD2过表达植株形成层细胞层数增加2层左右，木质部宽度都增加了30％以上，但木纤维细胞的细胞壁厚度差异不显著。
由图5可以看出，与野生型植株相比较，PdCSD2过表达植株中木质素含量显著降低，在OE-4和OE-12转基因株系中分别下降了11.2％和18.6％；纤维素含量与野生型相比较发现，纤维素含量在不同的转基因株系中分别增加了15.2％(OE-4)和17.2％(OE-12)。
因此，本发明提供的PdCSD2基因在促进树木生长中的应用，通过过表达PdCSD2基因可以显著提高树木的株高、茎粗，明显促进树木的生长，加快树木成材的速度；可以显著增加树木形成层细胞数和木质部宽度，为树木的长高、增粗提供源源不断的动力；可以显著增加树木的纤维素含量，提高木材的韧性，使生产的木材具有特定用途成为可能。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.过表达PdCSD2基因在促进杨树生长中的应用，所述PdCSD2基因的CDS序列如SEQ IDNO:1所示。
2.过表达PdCSD2基因在增加杨树形成层细胞层数和木质部宽度中的应用，所述PdCSD2基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.过表达PdCSD2基因在增加杨树纤维素含量中的应用，所述PdCSD2基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。
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