CN116855530A - 玉米miR159a的靶基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用 - Google Patents

玉米miR159a的靶基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了玉米miR159a的靶基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用，属于分子生物学和分子育种技术领域。在本发明中，通过试验证明miR159a靶标ZmMYB138和ZmMYB74参与玉米抗病毒，利用RT‑qPCR和Western blot实验分析，发现ZmMYB138和ZmMYB74下调表达促进MCMV的侵染，ZmMYB138下游基因ZmCCoAOMT1下调表达同样促进MCMV的侵染，表明ZmMYB138、ZmMYB74和ZmCCoAOMT1基因为玉米褪绿斑驳病毒的抗性基因，为培育玉米褪绿斑驳病毒的玉米品种以及抗病植物种质资源的改良及遗传育种提供了思路。

Description

玉米miR159a的靶基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和分子育种技术领域，尤其涉及玉米miR159a的靶基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用。
背景技术
玉米是一种重要的粮食作物，但玉米病害一直在危害着玉米的产量以及品质，病毒病害给玉米的生产带来了严重损失。玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottlevirus,MCMV)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)的病毒。MCMV极易传播，其侵染对玉米的危害十分严重。被MCMV侵染的玉米植株，其叶片会出现褪绿、坏死症状以及流苏状畸形，MCMV与侵染玉米的马铃薯Y病毒科病毒复合侵染形成玉米致死性坏死病。目前病毒病并没有直接有效的药剂进行防治，更多的是进行抗病毒育种和传毒介体的防治，一旦传毒介体产生抗药性，该病毒病在小范围内将大面积扩展且无法防治，将造成难以预估的经济损失。运用miRNA序列及基因调控来达到防治玉米褪绿斑驳病毒的应用性研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供玉米miR159a的靶序列和ZmCCoAOMT1基因在抗玉米褪绿斑驳病毒中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明还提供了miR159a的靶序列ZmMYB138或ZmMYB74基因在调控玉米对玉米褪绿斑驳病毒抗性中的应用。
本发明还提供了过表达ZmMYB138或ZmMYB74的调控基因ZmCCoAOMT1基因或ZmDnaJ基因在提高玉米对玉米褪绿斑驳抗性中的应用。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明的玉米miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，通过试验证明miR159a靶标ZmMYB138和ZmMYB74参与玉米抗病毒，利用RT-qPCR和Western blot实验分析，表明ZmMYB138和ZmMYB74下调表达促进MCMV的侵染，表明ZmMYB138和ZmMYB74基因为玉米褪绿斑驳病毒的抗性基因，并且在ZmMYB138和ZmMYB74突变体和CMV-VIGS沉默ZmMYBs玉米中，ZmCCoAOMT1和ZmDnaJ均下调表达，表明ZmMYB138和ZmMYB74可能通过调控ZmCCoAOMT1和ZmDnaJ参与玉米抗病毒，并且ZmCCoAOMT1下调表达促进MCMV的侵染。为培育玉米褪绿斑驳病毒的玉米品种以及抗病植物种质资源的改良及遗传育种提供了思路。
附图说明
图1为miR159a靶标基因表达量；
图2为PCR检测突变体玉米中***的Ds转座子丢失情况；
图3为MCMV侵染ZmMYB138和ZmMYB74突变体玉米后症状加重；
图4为突变ZmMYB138有利于MCMV积累；A：zmmyb138中ZmMYB138表达量下调；B：zmmyb138中MCMV积累量上调*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001.****:p＜0.0001；
图5为突变ZmMYB74有利于MCMV积累；A：zmmyb74中ZmMYB74表达量下调；B：zmmyb74中MCMV积累量上调*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001.****:p＜0.0001；
图6为ZmMYB138和ZmMYB74突变体中MCMV CP蛋白积累量上调；
图7为菌落PCR检测CMV载体；
图8为在玉米中通过VIGS沉默ZmMYBs后MCMV侵染症状加重；
图9为沉默MYB家族后有助于MCMV的侵染；A：CMVVIGS ZmMYBs并接种MCMV后ZmMYB138表达量下调；B：CMVVIGS ZmMYBs并接种MCMV后ZmMYB74表达量下调；C：CMVVIGSZmMYBs后MCMV积累量上调*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001.****:p＜0.0001；
图10为CMVVIGS ZmMYBs后MCMV CP蛋白积累量上调；
图11为MYB突变体和CMV沉默MYB家族后ZmCCoAOMT1表达量也下调；A：zmmyb138突变体被MCMV侵染后ZmCCoAOMT1表达量下调；B：zmmyb74突变体被MCMV侵染后ZmCCoAOMT1表达量下调；C：沉默ZmMYBs并接种MCMV后ZmCCoAOMT1表达量下调*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001.****:p＜0.0001；
图12为MYB突变体和CMV沉默MYB家族后ZmDnaJ表达量也下调；A：zmmyb138突变体被MCMV侵染后ZmDnaJ表达量变化；B：zmmyb74突变体被MCMV侵染后ZmDnaJ表达量变化；C：沉默ZmMYBs并接种MCMV后ZmDnaJ表达量变化*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001.****:p＜0.0001；
图13为菌落PCR检测CMV-ZmCCoAOMT1；
图14为CMV沉默ZmCCoAOMT1后有助于MCMV侵染；A：CMVVIGS
ZmCCoAOMT1后接种MCMV，ZmCCoAOMT1表达量下调；B：CMVVIGS
ZmCCoAOMT1后接种MCMV，MCMV积累量上调*:p＜0.05.**:p＜0.01.***:p＜0.001；
图15为CMVVIGS ZmCCoAOMT1后MCMV CP蛋白积累量上调。
具体实施方式
本发明实施例中所用生物材料如下所示：
供试毒源：MCMV；
供试植物：本氏烟(用于接种CMV)、玉米自交系B73(用于接种MCMV)；
试剂：RNA提取试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司；
反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
SYBR qPCR Master Mix*购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
本发明所用其它试剂，如无特殊说明，都可以通过常规渠道购买得到。
miR159a序列：UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG(SEQ ID NO.1)
ZmMYB138完整CDS序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：
ATGTACCGGGTGAAGAGCGAGGGGGAGGGCGAGGGCGAGGGCGACTGCGAAATGATGCTGCAGGAACAGATGGACTCGCTGGTGGCCGACGACGTCAGCAGCGGAGGAGGGTCGCCTCACAGGGGCGTCGGCACGCCCCTGAAGAAGGGGCCATGGACGTCCGCGGAGGACGCCATCCTGGTGGACTACGTTAAGAAGAACGGCGAGGGCAACTGGAACGCGGTGCAGAAGAACACCGGGCTGTTCCGCTGCGGCAAGAGCTGCCGCCTCCGGTGGGCGAACCACCTCAGGCCCAACCTCAAGAAGGGGGCCTTCACCCCCGAGGAGGAGCGCCTCATCATCCAGCTCCACGCCAAGATGGGGAACAAGTGGGCGAGGATG GCTGGTCACTTGCCAGGGCGTACTGACAATGAGATCAAGAACTACTGGAACACTCGAATAAAGAGATGTCAACGAGCTAGCCTTCCTATTTATCCTGCTAGTGTATGCAATCAATCTACAAATGAAGATCAGCAACTGTCTGGTAATTTTAACGGTGGCGAGAATATATCCAATGATCTTCTATCTGGGAACAGCCTTTATCTGCCAGATTTTACCAGTGACAATTTCATTGCGAACCCAGAGGCTTTATCCTATGCACCACAGTTGTCAGCTGTTTCAATAAGCAATTTGCTCGGCCAAAGCTTTGCATCAAAAAGTTGTAGCTTCATGGATCAGGTTGACCAAGCGGGGATGCTGAAACAATCTGGCTGTGTGCTTCCTGCATTGAGCGATGCCATTGACAGTGTGCTTTCCTCAGCTGATCATTTTTCAAATGACTCTGAGAAGCTCAGGCAGGCTTTAGGTTTTGATTATCTGAATGAAGCCAATGCTAGCAGCAAGAGTATTGCACCTTTCGGGGTTGCACTTACTGGCAGCCATGCCTTTTTAAATGGCAATTTCTCTGCTTCTAGGCCCACAAATGGTCCTTTGAAGATGGAGCTCCCTTCACTCCAAGATACTGAATCTGATCCAAATAGCTGGCTCAAGTATACTGTGGCTCCTGCAATGCAGCCTACTGAATTAGTAGATCCTTACCTGCAGTCTCCATCAGCGACCCCTTCAGTGAAATCTGAGTGTGCATCGCCGAGGAACAGTGGTCTTTTGGAAGAGCTGCTTCATGAAGCTCAGGCACTAAGATCTGGGAAGAACCAACAATCATCGGTCCGAAGTTCAAGTTCTTCTGCTGGCACACCTTATGAGACTACCACGGTGGTTAGCCCAGAGTTTGATATGGGTCAGGAATATTGGGAAGAACAGCCCAGTTCTTTCCTCAGTGAATATGCTCATTTTAGTGGAAATTCTTTCACTGAATCCACTCCTCCTGTTAGTGCTGCGTCACCTGATATCTTCCAGCTCTCCAAGATTTCTCCTGCACAAAGCCCTTCAATGGGCTCTGGCGAGCAGGCGTTAGAGCCTAAACATGAGTCGGCAGCTTCACCTCGTCCTGAAAACTTGAGGCCTGATGCATTATTCTCTGGGAACACAGCCGATCCATCCATTTTCAATAATGCCATAGCCATGCTCCTGGGCAATGGCATTGATGCCGAGTACAAACCTGTTCTTGGTGATGGAATTGTGCTCGATTCTTCGTCATGGAACAACATGCAACATGCTTTTCAGATGGCGGGATTCAAATGA
ZmMYB74完整CDS序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：
ATGTACCGGGTGAAGAGCCAGGCGGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGGACGAGATGATGTCGCAGGACCAGATGGACTCGCCGGTGGACAACGATGTCAGCAGCAGCCGCAGGTCGCCTCGCAGGGGCGTCGGGGCGCCCCTGAAGAAAGGGCCCTGGACGGACGCGGAGGACGCCATCCTGATAGACTACGTTAAGAAGCACGGCGTGGGCAACTGGAACGCGGTGCGGAAGAACACCGAGCTATTGCGCTGCGGCAAGAGCTGCCGCCTCAGGTGGGCGAACCACCTCAGGCCCAACCTCAAGAAGGAGGCCTTCACCCCGGAGGAGGAGCGCCTCATCATCCAGCTCCACGCCAAGCTGGGGAACAAGTGGTCGAGGATGGCTATTCATTTGCCAGGGCGTACTGACAACGAAATAAAAAACTACTGGAACACACGAAAAAAGAGATGTGAACGAGCTAGCCTTCCTATCTATCCTGCTGGTGTACGTAATCAATCTTCAAATGAAGACCAGCAATTGTCTGGTGATTTGAACGGTGGCGAGAACATGTCCAATGATCTTCTATCCGGAAACAGCCTTTGTCTACCAGATTTTAACAATGACAGTTTCCGTGCGAAACTGAAGGCTTTACCACCACAGCTGCCAGCTGTTTCAATAAGCAATTTGCTCGGCCAAAGCTTTGCATCAAAAGGTTGTAGCTTCATGGATCAGGTAGACCAAGCAGGGATGCTGAAACAATCTGGCAGTGCGCTTCCTACATTGAGCGATGCCATTGACGATGTGATTTCCTCGGTTGATCAATTTTCAAATGACTCTGAGAAGCTCATGCAGACTTTAGGTTTTGGTTATCTCAATGAAGCCAACGCTACCAGCAAGAGTATTGCGCCTTTTGGGGTTGCACTTACTGGCAGCCATGCCCCTTTAAATGGTATTTTCTCTGCATCTAGG CTCACAAATGGTCCTTCGAAGATGGAGCCCCCTTCAGTCCAAAATAGCAGGCTCAAGTATACTGTGGATCCTGCAATGCAGCCTACTGAGTTAGTAGATCCTTACATGCAGTCTCTATCAGCGACCCCTTCAGTGAAATCAGAGTGTGCATCGCCGAGAAACAGTGGTCTTTTCGAAGAGCTGCTTCATGAACCTCATGCACTAAGATCTGGGAAGAGCCAACAACCATCGGTCCGAAGTTCAAGTTCTTCTGCTGGCACACCTTATGGGACTATGGTTAGCTCAGAATTTGATATGGGTCAGGAATATTGGGAAGAACAGCCCGGTTCTCTCCTCAGCGAATATGCTCACTTCAGTGGGAATTATTTGGCTGAATGCGCTCCTCCTGTTAGCGCTGCATCAACTGATATCTTTCCGCTCCCCAAGATTTCTCCTGCAGAAAGCCCTTCAATGGGCTCTGGCGAGCAGGCGTTAGAGCCTAAACATGAGTCAGCAGCTTCACGTACGTCATCTTGGAAACTTGAGGCATGA
ZmCCoAOMT1基因ID：Zm00001d036293
ZmDnaJ基因ID:Zm00001d013111
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1.miRNA159的靶基因预测
为了研究miR159a(UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG)在玉米中的调控机制，通过在线预测网站(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/)进行分析，选取得分小于等于2.5的结果(表1)。经查阅文献，结合转录组数据，确定预测结果中的两个MYB家族基因，Zm00001d043131(ZmMYB138)和Zm00001d012544(ZmMYB74)，为miR159a的靶基因。在转录组数据表中找到预测到的靶基因，并将结果绘制成热图(图1)，数据表明ZmMYB138和ZmMYB74在病毒侵染玉米后，特别是在复合侵染中大幅上调表达。
表1网站预测miR159a靶标，得分≤2.5的靶基因
实施例2 ZmMYB138和ZmMYB74突变体促进MCMV侵染
在MEILAM database公司购买了Ds转座子***玉米自交系B73的突变体—Ds4-MYB74突变体zmmyb74、Ds6-MYB138突变体zmmyb138玉米。为了检测突变体玉米中***的Ds转座子丢失情况，以未进行任何处理的玉米B73为对照，将所有突变体播种在24℃/16h(光照阶段)、22℃/8h(黑暗阶段)的人工气候室，于第8d取样，提取突变体玉米基因组DNA，分别使用引物组合zmmyb74-F/R+Ds3’BPrimer，zmmyb138-F/R+Ds5’BPrimer对突变体进行扩增，扩增引物序列如表2所示。扩增程序如下：98℃30s；98℃15s，58℃15s，72℃10s，35个循环；72℃10min，4℃保存，检测突变体玉米Ds转座子***情况，如图2所示，野生玉米在270bp位置出现条带，而zmmyb138突变体玉米在500bp的位置出现条带，zmmyb74突变体玉米在520bp的位置出现条带，说明突变体玉米Ds转座子***成功。接着进行突变体玉米抗性实验，以未进行任何处理的B73为对照，进行MCMV病毒的接种，使用摩擦接毒的方式对玉米接毒，在玉米二叶期接毒，接种部位为第一片真叶，从叶片根部到叶尖整叶摩擦30～40次。在病毒接种第6-8d记录病情指数(表3)，在病毒接种第9d拍照取样(图3)，根据病情指数表和MCMV症状图显示，突变体zmmyb138玉米对MCMV表现出更感，病症更重的现象；突变zmmyb74和zmmyb138对MCMV表现出感病，症状有轻微的加重。
表2扩增引物
Zmmyb74-F AAACTACTGGAACACACGA SEQ ID NO.4
Zmmyb74-R AGATAACCAAAACCTAAAG SEQ ID NO.5
zmmyb138-F TCTCTCTCGCCTTTACCCG SEQ ID NO.6
zmmyb138-R CTCCCCCTCGCTCTTCACC SEQ ID NO.7
Ds5’BPrimer ATACGATAACGGTCGGTACGG SEQ ID NO.8
Ds3’BPrimer AACGGTAGAGGTATTTTACCGACC SEQ ID NO.9
表3 MCMV侵染ZmMYB138和ZmMYB74突变体后病情指数调查表
根据病情指数表选取了zmmyb138和zmmyb74的不同植株做后续实验，每种突变体选择1～2个症状轻和重的植株，以未进行任何处理的B73为对照，提取植物总RNA，反转录出cDNA，进行RT-qPCR以检测突变体中zmmyb138和zmmyb74基因的表达量变化以及MCMV的表达量变化。RT-qPCR的引物如表4所示，与反应体系、反应程序系表5、表6所示：
表4 RT-qPCR引物
引物名称 引物序列
qZmMYB138-F TGATCTTCTATCTGGGAACAGC SEQ ID NO.10
qZmMYB138-R GCATCGCTCAATGCAGGAAG SEQ ID NO.11
qZmMYB74-F TTCATTTGCCAGGGCGTACT SEQ ID NO.12
qZmMYB74-R TCTCGCCACCGTTCAAATCA SEQ ID NO.13
表5 RT-qPCR反应体系
组份 体积
RT-qPCR酶 10μL
正向引物 0.45μL
反向引物 0.45μL
模板cDNA 2μL
ddH2O 7.1μL
表6 RT-qPCR反应程序
反应结束后，根据仪器测得的各反应的CT值，使用ΔΔCT法计算目标基因/病毒基因组的相对表达量。
RT-qPCR定量检测结果如图4和图5所示，由图4中A可以看出，在突变体zmmyb138-1-3中，ZmMYB138表达量下调了约0.8倍，在zmmyb138-2-1中，下调了约0.4倍，在zmmyb138-2-6中下调了约0.5倍，在zmmyb138-2-7中下调了约0.6倍，这表明zmmyb138突变体对基因ZmMYB138的沉默效果显著；由图4中B可以看出，在突变体zmmyb138-1-3中，MCMV表达量上调了约6倍，在zmmyb138-2-1中，上调了约3倍，在zmmyb138-2-6中上调了约5倍，在zmmyb138-2-7中上调了约5倍，实验证明下调ZmMYB138的表达能够促进病毒MCMV的侵染。
由图5中A可以看出，在zmmyb74-3中，基因ZmMYB74表达量下调了约0.6倍，在zmmyb74-8中，下调了约0.6倍，这表明zmmyb74突变体对基因ZmMYB74的沉默效果显著；由图5中B可以看出，在突变体zmmyb74-3中，MCMV表达量上调了约5倍，在zmmyb74-8中，上调了约5倍，证明下调ZmMYB74的表达也能够促进病毒MCMV的侵染。
选取了定量结果显著的突变体zmmyb138-2-6和zmmyb74-3进行Western Blot实验，检测MCMV CP蛋白的表达量变化，具体步骤如下：
(1)蛋白样品制备
组织中总蛋白的提取。将植物组织在研钵或研磨仪中破碎，全程在液氮中进行。加500～600uL蛋白裂解液，在裂解液中加入PMSF(100mM)，PMSF的作用是防止蛋白酶降解提取的蛋白，使PMSF终浓度为1mM。加入裂解液后在震荡涡旋仪上震荡混匀，放置于4℃匀浆器中进行匀浆，放置约1～1.5h，待裂解充分后置于冰上。在4℃离心机中离心，在转速12000r/min下离心5min，取上清液分装于1.5ml离心管中并置于-20℃保存。
(2)蛋白含量的测定
参照碧云天BCA蛋白浓度测定的说明书。
(3)Western Blot
上样样品的制备，取提取好的蛋白液50～100uL，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，吹打混匀，放置于98℃金属浴中，静置5～7min，这时蛋白已经变性，可以用于蛋白跑胶。
根据上海雅酶生物医药科技有限公司提供的PAGE凝胶快速制备试剂盒配置方法配置PAGE胶。约30minPAGE胶将凝固，在电泳槽中加入配制好的电泳缓冲液，将PAGE胶放置其中，用电泳缓冲液加满两块PAGE胶的中间区域，随后将样品和marker依次加入到PAGA胶的上样孔中，加样前将上样孔中的气泡吹打干净，在150V电压下进行电泳，约50min后，上样缓冲液中的溴酚蓝染料跑到PAGE胶边界，停止电泳。
将两块PAGE胶中的一块进行考马斯亮蓝(CDD)染色，将跑完电泳的凝胶放置于配置好的考马斯亮蓝染色液中，确保染液完全覆盖凝胶，并放置于摇床上，在摇床上染色直到可以看见清晰的蛋白条带，后使用清水浸泡PAGE胶，使背景褪色方便观察拍照，用热水褪色更快，约1～2d后取出拍照作为上样对照。
将两块PAGE胶中的一块进行转膜，提前配置好转膜液，将湿转仪夹子，海绵垫，滤纸在转膜液中浸泡，剪取大小合适的PVDF膜，使用无水甲醇浸泡1～2min(时间不能太长)，将PAGE凝胶浸润在转膜液中5min。取出湿转仪夹子，从负极到正极依次放入海绵垫、浸湿滤纸、凝胶、PVDF膜、浸湿滤纸、海绵垫，用滚轴小心赶出PVDF膜和凝胶之间的气泡，60V转膜90min，转膜完成后在PVDF膜上可以清晰地看到marker、溴酚蓝染料和部分蛋白。
下一步是封闭，将上述完成转膜的PVDF膜放入配置好的封闭液中，要保证封闭液能完全浸没PVDF膜，将其放置于摇床上封闭1.5h。
再接着进行一抗孵育，封闭结束后，在同样的封闭液中稀释单克隆抗体，MCMV的一抗需稀释20000倍使用，要保证一抗能完全浸没PVDF膜，将其放置于摇床上，室温孵育2h。一抗孵育结束后，使用TBST缓冲液清洗PVDF膜5min，重复3次。
再接着进行二抗孵育，将清洗完的PVDF膜放置于使用TBST稀释2000倍的二抗中，将其放置于摇床上，室温下孵育1h。二抗孵育结束后，使用TBST缓冲液清洗PVDF膜5min，重复3次。
最后进行显色拍照，将PVDF膜用吸水纸吸去多余水分，加入适量CDP-Star显色液(A液和B液等比例混合)，用显色液完全涂抹PVDF膜多次，通过化学发光成像***显色至条带清晰。
Western Blot结果如图6所示，图6显示的结果与RT-qPCR定量结果一致，MCMV表达量呈上调表达，突变体zmmyb138-2-6和zmmyb74-3都促进了病毒MCMV的侵染。突变体zmmyb138和zmmyb74均表现出对MCMV更加敏感，症状加重且提前，证明ZmMYB138和ZmMYB74在玉米中的抗病基因。
实施例3沉默ZmMYBs促进MCMV侵染
选择MYB的保守区域以ZmMYB138的CDS为模板，设计了基于ZmMYB138的220bp长度MYB的多基因沉默片段，并送华大公司将其成功***到载体的KpnI和XbaI两个酶切位点。将公司送回的CMVVIGS载体进行测序和PCR检测，PCR检测结果如图7所示，在500bp左右出现大小合适条带，测序和PCR检测结果表明载体构建成功。
将公司构建好的CMVVIGS载体质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆进行菌落PCR，菌落PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆提取大肠质粒进行农杆菌转化，然后用农杆菌浸润烟草，取浸润含有CMV VIGS的本生烟叶片，研磨后得研磨液，针刺接种玉米。
具体操作步骤如下；
1.大肠杆菌转化
(1)大肠杆菌LB培养基配制方法：取5g胰蛋白胨(Tryptone)，2.5g酵母提取物(Yeast extract)，5gNaCl固体，加入400mL去离子水溶解，定容至500mL(固体培养基中每150mL加入2.25g琼脂粉)，分装后，121℃30min高压灭菌。
(2)将DH5α或Trans T1等感受态细胞从-80℃拿出，放置于冰中等待融化，待菌块融化后，加入公司构建好的CMV载体质粒，轻弹感受态离心管底来混匀，放置于冰中，静置30min。
(3)将上一步的混合液放置于42℃的金属浴或水浴锅中，热激40～50sec，热激后将离心管迅速放回冰上，静置2min，应避免晃动离心管。
(4)向上一步的混合液中加入650μL不加任何抗生素的LB液体培养基，混匀后放置于恒温振荡培养箱，于37℃，200r/min振荡复苏60min。
(5)振荡复苏结束后，在常温高速离心机中，于转速5000r/min下离心1min收集菌体，在超净工作台中倒上清，留取约100μL上清轻轻吹打重悬沉淀菌块，并均匀涂布到含卡纳抗生素的LB固体培养基上，涂布到全部涂干为止。
(6)将涂干的平板倒置放于37℃恒温培养箱中培养12～16h，转化后会长出阳性克隆单斑。
2.菌落PCR
挑取大肠杆菌转化后的阳性克隆单斑于LB液体培养基中，在37℃恒温振荡培养箱中培养6～8h，待菌液变浑后进行菌落PCR，PCR反应体系如表7：
表7菌落PCR体系
菌落PCR反应程序如表8所示：
表8菌落PCR反应程序
菌落PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
3.琼脂糖凝胶电泳
(1)根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的TAE电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入一定量的琼脂糖粉，以1×琼脂糖凝胶为例，在150mL ddH2O中加入3mL 50×TAE，然后称取1.5g琼脂糖加入其中。
(2)在微波炉中加热溶解琼脂糖，在微波炉内反复沸腾4～6次，这样琼脂糖才能完全融化。
(3)使溶液冷却至50℃～60℃左右，在此时按每30mL溶液加入1μL的比例加入DNA核酸染料，并充分混匀。
(4)将琼脂糖溶液倒入制胶槽具中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3～5mm之间。将胶放置在常温下，等待约30min后凝固。
(5)将凝固后的琼脂糖凝胶放置于水平电泳仪中，用移液枪吸取约6μL样品，小心地加入琼脂糖凝胶的胶孔中。
(6)点完样品后，合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在200V，电流在300mA进行跑胶。约20min后停止电泳，此时能看见条带位置。在凝胶成像仪中观察并拍照。
4.大肠质粒提取
大肠质粒提取参考生工质粒提取试剂盒说明书。
5.农杆菌转化
(1)将-80℃保存的C58C1感受态放置于冰中融化。
(2)按每100μL感受态细胞加入1μgCMV载体质粒，轻轻混匀，放置于冰中，静置10min。
(3)将上一步的混合液放置于液氮中，静置5min。
(4)将上一步的混合液放置于冰中，静置5min。
(5)在上一步的混合液中加入800μL液体LB，放置于恒温振荡培养箱，于28℃，200r/min振荡复苏2～3h。
(6)振荡复苏结束后，在常温高速离心机中，于转速5000r/min下离心1min收集菌体，在超净工作台中倒上清，留取约100μL上清轻轻吹打重悬沉淀菌块，并均匀涂布到含卡纳抗生素和利福平抗生素的LB固体培养基上，涂布到全部涂干为止，转化后会长出阳性克隆单斑。
6.农杆菌浸润烟草
(1)挑取阳性克隆单斑于1mL含卡纳和利福平的液体LB中，放置于恒温振荡培养箱中，于28℃，200r/min振荡复苏24h，待菌液变浑后吸取100μL加入到10mL含卡纳和利福平抗生素的液体LB中。
(2)待10mL菌液变混后在常温高速离心机中，于转速4000r/min下离心10min，倒掉上清，留下菌体沉淀。
(2)配制农杆菌用浸润缓冲液，称取0.8132gMgCl2，0.7810gMES盐，0.0157g乙酰丁香酮溶于400mL蒸馏水中。
(3)用10mL浸润缓冲液悬浮菌体沉淀，放置于恒温培养箱，于28℃复苏4～6h。
(4)在常温高速离心机中，于转速4000r/min离心10min收集菌体沉淀，用适当浓度浸润缓冲液悬浮沉淀来调节菌悬液OD值，CMV菌悬液OD值在0.5左右。
(5)将CMV菌悬液与等体积的携带有CMV ZMBJ-2的菌悬液混匀后，用无针头的1mL注射器将携带病毒载体的菌悬液注射到本生烟叶片的下表皮，将整片叶注满。
(6)浸润后的本生烟置于光照培养箱中，光照24℃，16h，黑暗22℃，8h，培养3～4d后取样用于后续实验。
7.针刺接种玉米
(1)将浸润含有CMVVIGS的本生烟取样，取接种叶片，按照每1g烟草加入700μL的比例加入0.01M的PBS磷酸盐接种缓冲液，在灭完菌并预冷的研钵中放入叶片，加入PBS磷酸盐接种缓冲液和少许金刚砂，研磨至匀浆，用去头的枪头转移研磨液至2mL离心管中，放置于冰中备用。
(2)每种处理挑选大小一致且种胚扁平的玉米种子60～70粒，放置于去离子水中，浸泡约40min，将泡好的种子放置于湿润的吸水纸上，每粒玉米滴加15μL研磨液于玉米种胚凹陷处，针刺接种，操作时避免用力过猛将种胚扎死。
(3)标记好不同处理，加水保湿并用保鲜膜密封，放置于恒温培养箱中，于25℃黑暗条件下培养，出芽后种于实验用土中，于光照培养箱中培养，光照20℃、16h，黑暗18℃、8h。
将正确的载体接种玉米后第3d挑战接种MCMV(在VIGS的基础上进行二次接毒)，在MCMV接毒第8d拍照取样，结果如图8所示，从图8中可以看出，CMV VIGS沉默MYB后，MCMV症状均有所加重。
利用实施例2中的RT-qPCR体系定量检测ZmMYB138、ZmMYB74基因表达量变化Western Blot检测MCMV病毒表达量变化，以CMV VIGS GFP为对照。结果如图9所示，从图9中可以看出，在玉米中沉默MYB并接种MCMV后ZmMYB138表达量下调了约0.5倍(A)，ZmMYB74下调约0.5倍(B)，MCMV表达量上调约5倍(C)。
Western Blot检测结果如图10所示，由图10可以看出，MCMVCP蛋白的表达量变化与RT-qPCR定量结果一致，MCMV表达量呈上调表达。实验结果表明沉默MYB对病毒MCMV侵染具有促进作用。
实施例4ZmMYB138调控ZmCCoAOMT1、ZmDnaJ参与抗病毒
为了验证ZmMYB138、ZmMYB74和可能调控的ZmCCoAOMT1、ZmDnaJ之间的关系，通过RT-qPCR检测突变体和CMVVIGS MYB中二者的表达量变化，RT-qPCR结果如图11、图12所示。从图中可以看出，在myb138突变体中ZmCCoAOMT1下调了约0.4～0.5倍(图11)，ZmDnaJ下调了约0.3～0.4倍(图12)，在myb74突变体中ZmCCoAOMT1下调了约0.2～0.4倍，ZmDnaJ下调了约0.2倍；而在CMVVIGS MYB并接种MCMV中ZmCCoAOMT1下调了约0.4倍，ZmDnaJ下调了约0.4倍。综上所述，在MYB家族基因被沉默后ZmMYB138和ZmMYB74表达量也随之下调。并且在突变体和CMV沉默载体中ZmCCoAOMT1和ZmDnaJ的表达量变化趋势与ZmMYB138和ZmMYB74表达量变化趋势基本一致，表明ZmMYB138调控ZmCCoAOMT1、ZmDnaJ参与抗病毒。
实施例5沉默ZmCCoAOMT1后植物更感病
在网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上找到ZmCCoAOMT1的序列，用其CDS序列设计了CMV VIGS载体，并送华大公司构建，将公司构建好的载体进行PCR检测，检测结果如图13所示，显示载体构建成功。RT-qPCR定量检测结果如图14所示，由图14可以看出，在CMVVIGSZmCCoAOMT1后接种MCMV，ZmCCoAOMT1表达量下调了约0.4倍，MCMV表达量上调了约3倍。Western blot实验结果如图15所示，由图15可以看出，CMVVIGS ZmCCoAOMT1后接种MCMV，MCMV CP蛋白呈上调表达。综上所述，CMV VIGS ZmCCoAOMT1具有稳定的沉默效果，沉默效率可达40％，ZmCCoAOMT1被沉默后MCMV病毒含量增加，因此ZmCCoAOMT1是玉米中抗MCMV的基因，过表达ZmCCoAOMT1能够增强玉米对MCMV的抗性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.miR159a在抗玉米褪绿斑驳病毒侵染中的应用。
2.ZmMYB138或ZmMYB74基因在调控玉米对玉米褪绿斑驳病毒抗性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在玉米中过表达ZmMYB138或ZmMYB74基因能够提高玉米对玉米褪绿斑驳病毒的抗性。
4.一种提高玉米对玉米褪绿斑驳病毒抗性的生物材料，其特征在于，所述生物材料为含有ZmMYB138、ZmMYB74或ZmCCoAOMT1基因过表达载体的生物材料，所述生物材料包括表达盒、表达载体、工程菌、宿主细胞。
5.权利要求4所述生物材料在制备抗玉米褪绿斑驳病毒的转基因玉米以及玉米种质资源改良中的应用。
6.过表达ZmCCoAOMT1基因或ZmDnaJ基因在提高玉米对玉米褪绿斑驳抗性中的应用。
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