CN116836890B - 一株链霉菌菌株、菌株挥发物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种链霉菌菌株，其为黄麻链霉菌菌株（Streptomyces corchorusii）CG‑G2，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：63681。本发明还提供了所述链霉菌菌株的发酵液及其发酵产生的菌株挥发物。本发明的链霉菌菌株及其发酵产生的菌株挥发物具有广谱抑菌活性，对草莓炭疽菌、枇杷炭疽菌、橡胶叶斑病菌、胶孢炭疽菌、香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、小麦赤霉病菌等具有良好的拮抗作用，抑菌率均达到了44.81%以上，尤其是对草莓炭疽菌、枇杷炭疽病菌、橡胶叶斑病菌、胶孢炭疽菌、香蕉炭疽病菌，抑菌率都达到了70%以上，是炭疽病害防治的潜在生物制剂，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种链霉菌菌株、菌株挥发物及其应用。。
背景技术
草莓(Fragaria × ananassa)因其美味的味道和营养价值而成为世界上最受欢迎的浆果之一(Shen et al., 2019)。然而，典型的非跃变型水果在生长和收获后贮藏期间容易因真菌病原体感染而腐烂(Feliziani et al.， 2016)。由炭疽病造成的采收后的损失可达80% (Marian et al.， 2020)。育种抗性品种控制炭疽病效率低下(Alijani et al.，2019)。 草莓炭疽病菌分为3种，分别为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidespenz,)、尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum Simmonds)、草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae Brooks.)。目前，使用杀菌剂仍是控制采后炭疽病的主要策略(Miller-Butler et al.， 2018)。杀菌剂的广泛和过度使用导致耐药病原菌的出现和环境污染。因此，寻找一种更安全、更有效的防治草莓炭疽病的药剂具有重要意义。
有益的微生物制剂被认为是一种环境友好的选择，用于生物控制不同采后水果的植物病原体(Feliziani et al., 2016)。以前的报道显示了一些对水果采后病害有效的生物防治剂，包括对酸豆和牛油果上具有拮抗作用的深褐芽孢杆菌(Guardado-Valdivia etal., 2018)，类黄假单胞菌对桃褐腐病菌的抑制作用(Aiello et a l., 2019)，隐球菌对抗梨扩展青霉（Zhao et al., 2020）以及链霉菌属对抗辣椒果实炭疽病病原菌及葡萄灰霉病菌(Boukaew et al., 2018; Kim et al., 2020)。随着对采后病害管理的需求，有必要分离和鉴定新的功能和高效的生物防治剂。
近年来，内生放线菌在植物病原菌的生物防治中引起了广泛的关注 (Qi et al.,2019)。以往的研究表明，放线菌是包括草莓在内的不同作物内生细菌群落中的优势类群之一 (Cardinale et al., 2015; Li et al., 2020a)。其中，放线菌属链霉菌已被应用于不同水果采后病害的防治(Kim et al., 2020; Li et al., 2020a)。链霉菌还能产生具有抗真菌和抗菌活性的重要次生代谢产物 (Qi et al., 2019; Wei et al., 2020;Rajivgandhi et al., 2018; Martins et al., 2019)。链霉菌MBFA-172和MBFA-227显著抑制草莓炭疽病的发病 (Marian et al., 2020)。因此，链霉菌可能是一种潜在的植物病原生物防治剂。虽然已经从不同的植物组织和土壤中获得了一些拮抗链霉菌，但获得高效的生物防治链霉菌菌株是非常重要的 (Shi et al., 2018)。链霉菌可以产生许多次级代谢物与其他病菌进行竞争（廖敏，2016）。因此，对不同生态***内生微生物群落进行生物勘探的研究越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种链霉菌菌株、菌株挥发物及其应用，该菌剂及其发酵产生的菌株挥发物具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。
本发明的第一个方面是提供一种链霉菌菌株，命名为黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii ）CG-G2，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：63681。
本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述链霉菌菌株的发酵液。
本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述链霉菌菌株发酵产生的菌株挥发物。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌菌株、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三个方面所述的菌株挥发物在拮抗草莓炭疽菌、和/或枇杷炭疽病菌、和/或橡胶叶斑病菌、和/或胶孢炭疽菌、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌中的应用。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌菌株、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三个方面所述的菌株挥发物在防治草莓炭疽菌、和/或枇杷炭疽病菌、和/或橡胶叶斑病菌、和/或胶孢炭疽菌、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌所致病害中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌菌株、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三个方面所述的菌株挥发物在延缓草莓果实腐烂中的应用。
其中，草莓果实腐烂是由胶孢炭疽病菌所致。
本发明的第七个方面是提供一种制剂，含有本发明第一个方面所述的链霉菌菌株、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三个方面所述的菌株挥发物。
本发明的链霉菌菌株及其发酵产生的菌株挥发物具有广谱抑菌活性，对草莓炭疽菌、枇杷炭疽病菌、橡胶叶斑病菌、胶孢炭疽菌、香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、小麦赤霉病菌等具有良好的拮抗作用，抑菌率均达到了44.81%以上，尤其是对草莓炭疽菌、枇杷炭疽菌、橡胶叶斑病菌、胶孢炭疽菌、香蕉炭疽病菌，抑菌率都达到了70%以上，是炭疽病害防治的潜在生物制剂，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。
图1为分离获得的70株菌。
图2为初筛及复筛结果。
图3为电镜观察下菌株G2的形态特征结果。
图4为菌株G2***发育树。
图5为G2菌体及挥发物对8种病原真菌的抑菌活性结果。
图6为菌株G2挥发物对草莓果实防治效果的检测结果。
图7为菌株G2及挥发物对胶孢炭疽菌菌丝生长的抑制结果。
图8为菌株G2挥发物对胶孢炭疽菌菌丝形态的影响。
图9为菌株G2挥发物对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响。
图10 为菌株G2挥发物对胶孢炭疽菌孢子形态的检测结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提供了一种链霉菌菌株，所述链霉菌命名为黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii ）CG-G2（下文中又称为：菌株G2），在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：63681，保藏日期为2023年07月25日，保藏地址在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所。
1实验材料
1.1样品采集
根际土壤样品采自海南省儋州市那大镇中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所科研试验基地。共采集样品18份，分别放入无菌封口袋中混匀、封口、编号，装入冰盒内保存后，送至实验室进行根际土壤放线菌的分离。
1.2 供试培养基
本试验所需主要供试培养基包括分离培养基（Zhang et al., 2006）、形态学观察培养基（Shirling and Gottlieb, 1966）和生理生化特性培养基（徐丽华，2007），见表1-3。
表1 分离培养基及其配方
| 培养基Media | 成分Compositions（g/L） |
| 淀粉酪素琼脂培养基（SCA） | 可溶性淀粉 10 g，干酪素 0.3 g，KNO3 2 g，NaCl 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO3 0.02 g，FeSO4 0.01 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂18 g，pH 7.2-7.4。 |
| 高氏一号培养基（Gause’sno. 1） | 可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，KNO3 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2-7.4。 |
| 分离培养基抑制剂 | 50 mg/L 放线菌酮+ 50 mg/L 制霉菌素+ 20 mg/L 萘啶酮+ 50 mg/L 重铬酸钾。 |
| 预培养液 | N-Z-Amine 0.2 g/L，K2Cr2O7 0.05g/L，制霉菌素 50 mg/mL，pH 7.0 磷酸盐缓冲液。 |
表2 培养特征观察培养基及其配方
| 培养基Media | 成分Compositions（g/L） |
| 酵母膏麦芽膏培养基（ISP2或YE） | 酵母膏4 g，麦芽膏10 g，葡萄糖4 g，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH 7.3。 |
| 燕麦片琼脂培养基（ISP3） | 燕麦片20 g（加1000 mL水煮20 min，过滤并补足1000 mL），微量盐溶液1mL，琼脂20 g，pH 7.2。 |
| 无机盐淀粉琼脂培养基（ISP4） | 可溶性淀粉10 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，NaCl 1 g，(NH4)2SO4 2 g，CaCO3 2 g，微量盐溶液1 mL，蒸馏水 1000 mL，琼脂20 g，pH 7.0-7.4。 |
| 甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5） | 天门冬酰胺1 g，甘油10 g，K2HPO4 1 g，微量盐溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH 7.0-7.4。 |
| 蛋白胨-酵母浸膏琼脂培养基（ISP6） | 蛋白胨15 g，示蛋白胨5 g，柠檬酸铁铵0.5 g，K2HPO4 1 g，硫代硫酸钠0.08g，酵母膏1 g，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH 7.0-7.4。 |
| 酪氨酸琼脂培养基（ISP7） | 甘油15 g，酪氨酸0.5 g，天门冬酰胺1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，微量盐溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH 7.2-7.4。 |
| 高氏一号培养基（Gause’sno. 1） | 可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，KNO3 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2-7.4。 |
| 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） | 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17-20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。 |
表3 生理生化特征观察所需培养基
| 培养基Media | 成分Compositions（g/L） |
| 硝酸盐还原培养基 | MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，KNO3 1 g，蔗糖20 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。 |
| 酯酶培养基 | 蛋白胨1 g，NaCl 5 g，CaCl2·7H2O 0.1 g，琼脂9 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4。 |
| 氮源利用基础培养基 | D-葡萄糖 10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.1 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。不同氮源按照0.5%加入。 |
| 氮源利用基础培养基 | D-葡萄糖10 g，MgSO4•7H2O 5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，K2HPO4 0.1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2。 |
| 硫化氢产生培养基 | 蛋白胨10 g，柠檬酸铁0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2。 |
1.3 菌种的保存
1）斜面保藏法：将放线菌菌株接种于YE斜面培养基，待其长满斜面后放入4℃冰箱低温保藏，保藏期为1-3个月。
（2）甘油悬液保藏法：对于气生菌丝发达、产孢旺盛的放线菌菌株，将20% 甘油添加到长满放线菌的斜面培养基上，用接种环将生长在面表层的气生菌丝和孢子刮下制成悬液。对于不产气生菌丝或较弱、基内菌丝产孢的放线菌菌株，需要用菌丝体液体培养基培养以获得菌丝，离心收集菌丝体后添加20%甘油制成悬液。此方法保藏于冰箱-20℃时保藏期为1年，保藏于-80℃时保藏期可达3年以上。
1.4实验器材
（1）试剂盒
表4主要生化试剂及来源
| 试剂名称Name of the reagent | 生产厂家Manufacturer |
| 细菌基因组DNA快速提取试剂盒 | 北京百泰克生物技术有限公司 |
| 2×TaqPCR MasterMix | 博迈德生物公司 |
| DNA marker | 北京康为世纪生物科技有限公司 |
| 琼脂糖 | Promega Co. Ltd |
（2）仪器设备
表5仪器与设备
| 名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 生化培养箱 | SHP-450 | 上海精宏仪器制造有限公司 |
| 超净工作台 | SW-CF-1F | 苏州苏洁淨化设洛有限公司 |
| 电恒温鼓风干燥箱 | DHG-9140A | 上海一恒科学仪器有限公司 |
| 电子分析天平 | AL204 | 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 |
| pH计 | Delta 320 | Mettler-Toledo Instruments |
| 冷藏冷冻冰箱 | BCD-539WT | 海尔有限公司 |
| 恒温摇床 | ZWYR-D2403 | 上海智城公司 |
| 高压蒸汽灭菌锅 | HVE-2510 | HIRAYAMA，Japan |
| 恒温水浴锅 | 9112 | PolyScience，USA |
| 台式冷冻离心机 | Centrifuge 5417R | Eppendorf，Germany |
| PCR扩增仪 | T1Thermocycle | Biometra，Germany |
| 水平电泳仪 | DYY-8C | 北京市六一仪器厂 |
| 漩涡振荡器 | HMQL-VORTEX-5 | 江苏海门市其林贝尔仪器制造商有限公司 |
1.5 供试病原菌
胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides（ATCC 58222）用于抗真菌活性放线菌的筛选及抑菌活性测定。
枇杷炭疽病菌Colletotrichum acutatum（ATCC 56815）、橡胶叶斑病菌 Corynespora cassiicola （ATCC 16429）、草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae（ATCC58718）、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides（ATCC 58222）、香蕉枯萎病菌4号生理小种F. oxysporum f. sp. cubense Race 4（ATCC 76255）、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum sp. Cucumebrium（ACCC 30220）、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae（ATCC96167）和小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe（ATCC MYA-4620）用于抗菌谱的测定。
1.6 数据分析软件
本试验的数据使用SPSS Version 22进行样本间方差分析、多重比较等差异显著性分析（P<0.05）。
2实验方法与结果
2.1土壤放线菌的分离
土样自然风干，分别研磨过筛，称取3 g土壤溶于27 mL的无菌水中，55℃水浴加热20 min后再于28℃，180 r/min摇床震荡培养30 min，获得土壤悬浮液。采用连续稀释法分离放线菌（Williams and Davies 1965），吸取100 μL土壤悬浮液，加入含有900 μL无菌水的离心管中，充分混匀，依次重复此步骤，配制成10-1、10-2和10-3的土壤悬液，分别吸取 0.1mL 的悬液涂布至分离培养基上，28℃倒置培养7-10 d，每个梯度设3个重复，挑取不同的单菌落并釆用划线法在YE培养基上进行反复纯化。
使用淀粉酪素琼脂培养基（SCA）共分离到40株放线菌，编号为S1-S40，使用高氏一号培养基（Gause’s no. 1）共分离到30株放线菌，编号为G1-G30，如图1所示。
2.2 拮抗放线菌的初筛
以胶孢炭疽菌C. gloeosporioides（ATCC 58222）为靶标菌，采用平板对峙培养法（Sadeghian et al., 2016）对分离得到的放线菌进行活性筛选。配制PDA培养基平板，将C. gloeosporioides菌饼（Φ=5 mm）接于每个 PDA 平板的中间，并以平板中央为中心画“十”，将分离得到的放线菌接种于距离平板中央2.5 cm 的“十”字的四条边上，于28℃的培养箱中孵育7 d，同时设置对照。按照下列公式计算菌丝生长的抑制率（Chen et al., 2018a）。
结果显示，有18株放线菌具有初筛活性，菌丝生长抑制率为35%-82%，其中，编号为G2的菌株活性最好，菌丝生长抑制率达到82.35%，如图2A和表6所示。
表6 18株菌株的活性
| Strain | Mycelial Inhibition （%） | Strain | Mycelial Inhibition (%) |
| S2 | 49.02 ± 5.16 | S37 | 69.12 ± 2.94 |
| S7 | 71.57 ± 2.25 | S39 | 70.10 ± 0.85 |
| S13 | 60.29 ± 2.94 | S40 | 35.78 ± 2.25 |
| S20 | 46.57 ± 2.25 | G2 | 82.35 ± 1.47 |
| S24 | 68.14 ± 3.06 | G10 | 44.61 ± 4.49 |
| S27 | 57.84 ± 3.70 | G13 | 54.90 ± 3.70 |
| S29 | 52.94 ± 1.47 | G14 | 50.00 ± 5.30 |
| S30 | 49.51 ± 0.85 | G18 | 43.14 ± 5.16 |
| S35 | 68.14 ± 1.70 | G23 | 46.57 ± 3.06 |
2.3 拮抗放线菌的复筛
将初筛中具有抑菌活性的菌株，划线于YE培养基上，于28℃的培养箱中孵育2 d。将C. gloeosporioides菌饼（Φ=5 mm）接于PDA 平板的中间，再将其与上述生长2天的各菌株对扣，两平板用封口膜封住，与空YE培养皿对扣的平板作为对照。于28℃的培养箱中继续孵育7 d。按照上述公式计算菌丝生长的抑制率。
结果显示，具有初筛活性18株放线菌中，气体具有活性的只有11株，菌丝生长抑制率为41%-87%。与初筛活性一致，编号为G2的菌株气体活性最好，菌丝生长抑制率达到87.16%, 如图2B和表7所示。
表7 11株菌株的活性
| Strain | Mycelial Inhibition（%） |
| S7 | 65.20 ± 6.95 |
| S13 | 55.88 ± 2.94 |
| S20 | 75.00 ± 3.89 |
| S24 | 60.29 ± 2.94 |
| S27 | 74.02 ± 4.49 |
| S35 | 65.69 ± 6.12 |
| S37 | 57.35 ± 3.89 |
| S40 | 62.75 ± 6.63 |
| G2 | 87.16 ± 2.38 |
| G18 | 40.69 ± 2.25 |
| G23 | 53.43 ± 5.57 |
2.4 拮抗菌株的分类鉴定
拮抗菌株的初步鉴定主要通过扫描电镜观察形态特征、生理生化鉴定和***发育树构建等方法进行初步鉴定。
2.4.1扫描电镜观察形态特征
将拮抗放线菌接种于高氏一号培养基上，培养7-10 d后，用无菌手术刀小心切取边长为1 cm的正方形菌块，将菌块浸没在含有2.5%戊二醛溶液的离心管中，于4°C 固定过夜。磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0，PBS）漂洗样品3次后，使用梯度乙醇（30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，v/v）对漂洗后的样品依次进行脱水，每次15 min，最后用醋酸异戊酯进行置换。置换后的样品放置在无菌超净工作台自然风干，再进行镀金。处理好的样品使用扫描电子显微镜（Sigma 500/VP，蔡司，德国）观察菌株的菌丝和孢子链等形态特征。结果见图3，菌株G2在Gause’s no. 1培养基上产生浅黄色基内菌丝和气生菌丝，菌丝规则且饱满，在菌丝顶端产生白色、圆形孢子。
2.4.2生理生化特征鉴定
参照《常见细菌***鉴定手册》和《放线菌***学》对放线菌的生理生化特性进行鉴定，其中包括：碳源利用实验，氮源利用实验，酶学特征实验，代谢产物实验等。
（1）碳、氮源利用实验
将待测菌株接种到含有不同碳源、氮源的培养基中，28℃培养7-14 d后观察其生长情况，设阴性对照。结果见表8，试验中涉及的13种碳源和8种氮源均可被菌株G2利用。
（2）硫化氢产生实验
部分菌种可以分解含硫的有机物产生硫化氢。将菌种接种在硫化氢培养基上，28℃培养14 d后，如果培养基呈现黑色，说明有硫化氢的产生为阳性，如果培养基不变色，则为阴性。结果见表8，菌株G2不具有硫化氢产生能力。
（3）酶学特性的测定
①酯酶（吐温20、吐温40、吐温80）实验：
将菌株接种于脲酶培养基上，在28℃条件下培养4 d后，观察培养基是否变色。测试供试菌株产生尿素酶的能力，培养基变桃红色为阳性，不变色则为阴性。
②硝酸盐还原
待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置28℃下培养7、14 d，以不接菌的培养基为对照。在试管中分别加入少许培养了7 d、14 d的培养液，滴加一滴A液和B液，对照同样滴加。当溶液变成粉红、玫瑰红、橙色或棕色等，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现时滴加1或2滴二苯胺试剂，若呈蓝色，则还原作用为阴性；若不为蓝色，则仍按阳性对待。
结果显示，菌株G2具有多种酶学活性，可使硝酸盐还原，可产生酯酶。
表8 菌株G2的生理生化特征
| Characteristic | Characteristic | ||
| Biochemical test | Carbon-source utilizationutilizationutilization | ||
| Nitrate reduction | - | L-arabinose | + |
| H2S production | - | Cellose | + |
| Tween 20 | + | D-fructose | ++ |
| Tween 40 | + | D-galactose | + |
| Tween 80 | + | D-glucose | +++ |
| Spore ornamentation | rounded | D-ribose | + |
| Nitrogen-sourceutilization | Xylan | + | |
| Ammonium Sulfate | +++ | D-trehalose | + |
| L-Methionine | ++ | D-xylose | + |
| L-proline | +++ | Melezitose | ++ |
| Valine | +++ | Inositol | + |
| L-Cysteine | +++ | Raffinose | ++ |
| Dextrin | + | L-rhamnose | + |
| Ammonium chloride | +++ | ||
| Tyrosine | +++ |
+:结果为阳性;－:结果为阴性
2.4.3分子生物学鉴定
（1）放线菌基因组总DNA的提取
采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒（DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国）进行总DNA的提取。
（2）16S rDNA的测序及分析
以放线菌基因组为模板，采用放线菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，（上游引物：5’-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物为：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）（Wang etal 2013）。具体反应体系见表9，反应程序见表10。
表9 PCR 扩增体系
| 反应体系 | 体积 |
| 模板DNA | 1 μL |
| 2xTaqPCR MasterMix | 12.5 μL |
| 上游引物 | 0.5 μL |
| 下游引物 | 0.5 μL |
| ddH2O | 10.5 μL |
| 总体积 | 25 μL |
表10 PCR扩增程序
（3）PCR产物的电泳检测
配置一块1% 的琼脂糖凝胶，将胶放入含1×TAE电泳缓冲液的电泳槽，PCR产物5 μL点样（同时点样DNA分子Marker），150 V电压下运行25 min，电泳结束后在254 nm紫外灯下观察结果，PCR产物的回收按照BioTeke公司的胶回收试剂盒说明书进行。
（4）***进化树的构建
将菌株G2的PCR 产物送到上海生工进行16S rDNA基因测序， 将所测得的基因序列使用BLAST软件进行序列对比，同时通过GenBank和EzBioCloud数据库中查找相似的16SrDNA基因序列，选取同源性较高的菌株进行多重比较分析，最后使用MEGA 7.0，采用邻接法（Neighbor-Joining）进行***发育树的构建（Tamura et al., 2011）。
结果见图4，菌株G2为链霉菌属（Streptomyces），与标准菌株Streptomyces corchorusii DSM 40340 (KQ948396)显示最高的同源性，且在***发育树中形成一个独立、稳定的大分支，分支自展值为84%，亲缘关系最近。结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，可以判断菌G2为Streptomyces属。
2.5 平板对峙培养法和对扣法测定菌株G2及其挥发物广谱抑菌活性抗研究
配制PDA培养基平板，用打孔器取下培养5d、长势良好的8种病原菌菌饼 (Φ=5mm)，置于PDA平板中央，以平板中央为中心画“十”，在 “十”字4条边上距中心2.5 cm处，接种供试菌株，以只接种病原菌作为对照，28℃倒置培养5-7 d后，按照上述公式（1）计算菌丝生长的抑制率（Chen et al., 2018a）。
对于挥发物活性测定，将G2划线于YE培养基上，于28℃的培养箱中孵育2 d。然后，再将8种病原菌菌饼（Φ=5 mm）接于PDA 平板的中间，再将其与生长2天的菌株G2对扣，两平板用封口膜封住，与空YE培养皿对扣的平板作为对照。于28℃的培养箱中继续孵育7 d。按照上述公式计算菌丝生长的抑制率。
结果如图5所示。结果表明，菌株G2和挥发物对供试真菌的菌丝生长抑制率分别为44.81 -87.23%（图5A）和52.14 - 95.74%（图5B）。其中，菌株G2及其挥发物对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides抑菌活性最好，抑菌率分别为87.23%和 95.74%（图5A）。除了对香蕉枯萎病四号生理小种，菌株G2挥发物对供试真菌的菌丝生长抑制率均高于菌株G2，且病原菌种类不同，抑制率不同。
2.6 菌株G2挥发物对草莓果实腐烂的控制作用
菌株G2划线于YE平板上（Φ=18 mm），于28℃的培养箱中孵育2 d后备用。草莓（Fragaria × ananassa Duch. var. Zhang Ji）购买自海南省海口市超市，选取果实成熟度和大小均匀、无物理损伤和病原感染的果实。水果用2%次氯酸钠消毒2分钟后，用自来水冲洗干净，风干备用。然后在所有果实的赤道附近用灭菌针头均匀制造一个深2毫米，直径1毫米的伤口，每个伤口处接种20 μL病原菌（C. gloeosporioides）孢子悬液(1.0×106 CFUmL-1)。在空气中干燥后，将果实放置于玻璃培养皿中（Φ=18 mm），每皿7个草莓果实。然后将孵育2 d的G2菌株与其对扣，同时设置对照，每个试验设3个重复。所有果实在20±1◦C和90-95%的相对湿度下储存。在贮藏过程中，每天观察CK处理的伤口感染情况。当腐烂的果实数达到90%以上时(接种病原体后15天)，记录所有治疗中的感染伤口情况。发病率由下列公式计算：
。
同时用无菌手术刀小心切取用无菌手术刀小心切取伤口附近边长为1 cm的正方形菌块，将菌块浸没在含有2.5% 戊二醛溶液的离心管中，于4°C 固定过夜，再使用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0，PBS）漂洗3次固定好的样品，接着使用梯度乙醇（30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，v/v）对漂洗后的样品依次进行脱水，每次15 min。最后用醋酸异戊酯进行置换。置换后的样品放置在无菌超净工作台自然风干，再进行镀金。处理好的样品使用扫描电子显微镜（Sigma 500/VP，蔡司，德国）观察C. gloeosporioides病菌菌丝的变化。
结果如图6所示，与对照组相比，菌株G2挥发物显著降低了草莓果实15d 时的病害严重程度，发病率由90.48%降到了9.52%（图6A-B）。扫描电镜结果也显示，对照组果实伤口处病原菌菌丝生长茂盛，菌丝相互缠绕且表面光滑；而对照组中菌丝稀疏且菌丝表面粗糙（图6C）。
2.7 菌株G2挥发物对C. gloeosporioides菌丝生长的抑制作用
为了证明G2挥发物的拮抗活性，如前所述，在两个密封的培养皿(直径90 mm)中进行了挥发物对Colletotrichum gloeosporioides菌丝体的抑菌活性试验。首先，将G2划线于YE培养基上，于28℃的培养箱中孵育2 d。然后，再将病原菌菌饼（Φ=5 mm）接于PDA 平板的中间，再将其与生长2天的菌株G2对扣，两平板用封口膜封住，与空YE培养皿对扣的平板作为对照。于28℃的培养箱中继续孵育7 d。按照上述公式计算菌丝生长的抑制率。并用无菌手术刀取处理组和对照组菌丝边缘，于光学显微镜下观察菌丝的变化，所有试验重复3次。
结果如图7所示。菌株G2及其挥发物均对C. gloeosporioides菌丝有显著的抑制作用（图7A）。同时，图7B显示，挥发物处理后的菌丝浓密而短小，菌落边缘分支较多，而对照平板上的菌丝则表现为长直且稀疏状态。
2.8 菌株G2挥发物对C. gloeosporioides菌丝形态的影响
将靶标病原菌C. gloeosporioides菌饼与在YE上生长两天的G2菌株与其对扣，28℃培养4 d后，用无菌手术刀小心切取边长为1 cm的正方形菌块，将菌块浸没在含有2.5%戊二醛溶液的离心管中，于4°C 固定过夜，再使用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0，PBS）漂洗3次固定好的样品，接着使用梯度乙醇（30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，v/v）对漂洗后的样品依次进行脱水，每次15 min。最后用醋酸异戊酯进行置换。置换后的样品放置在无菌超净工作台自然风干，再进行镀金。处理好的样品使用扫描电子显微镜（Sigma 500/VP，蔡司，德国）观察C. gloeosporioides病菌菌丝的变化。
结果如图8所示，挥发物对C. gloeosporioides菌丝微观结构上有较大的影响。对照组菌丝体较长且互相交错生长，健康饱满， 菌丝表面光滑平整，处理组菌丝体变形，表面粗糙，扭曲和凹陷，局部发生不规则缢缩等现象。
用菌株G2挥发物处理C. gloeosporioides孢子悬浮液后，测定其孢子萌发情况。将1 mL的C. gloeosporioides孢子悬浮液（106 CFU/mL）置于直径为35 mm的一次性培养皿中，然后将在YE上生长两天的G2菌株与其对扣，空YE板作为对照。将平板于28°C、相对湿度80%的培养室内孵育12-24 h，每个处理3次重复。待对照孢子萌发率大于90%以上时，在电子显微镜(mag=200× lens)下观察孢子萌发，结果见图9。结果表明，菌株G2挥发物对C. gloeosporioides孢子萌发具有显著的抑制作用（P＜0 .05）。
2.10 菌株G2挥发物对C. gloeosporioides分生孢子形态的影响
制备C. gloeosporioides孢子悬浮液（1×106 CFU/mL）。将1 mL的C. gloeosporioides孢子悬浮液（106 CFU/mL）置于直径为35 mm的一次性培养皿中，然后将在YE上生长两天的G2菌株与其对扣，空YE板作为对照。将平板于28°C、相对湿度80%的培养室内孵育24 h。取10 μL混合液于载玻片上，载玻片用2.5%戊二醛4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。
结果如图10所示，挥发物对C. gloeosporioides分生孢子微观结构上有较大的影响，在放大倍数为5000倍时，对照组（a）病原菌孢子健康饱满，表面平整光滑，处理组（b、c、d）病原菌孢子出现凹陷、褶皱、粗糙、不平整的现象。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种链霉菌，其特征在于，命名为黄麻链霉菌菌株（Streptomyces corchorusii ）CG-G2，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为GDMCC No：63681。
2.含有权利要求1所述的链霉菌菌株的发酵液。
3.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在拮抗草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae、枇杷炭疽病菌Colletotrichum acutatum、橡胶叶斑病菌Corynespora cassiicola、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、香蕉枯萎病菌4号生理小种F. oxysporum f. sp. cubense Race 4、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumsp. Cucumebrium、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae和/或小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe中的应用。
4.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在防治草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae、枇杷炭疽病菌Colletotrichum acutatum、橡胶叶斑病菌Corynespora cassiicola、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、香蕉枯萎病菌4号生理小种F. oxysporum f. sp. cubense Race 4、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumsp. Cucumebrium、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae和/或小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe所致病害中的应用。
5.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在延缓草莓果实腐烂中的应用。
6.一种制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液。
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| 黄麻链霉菌NF0919菌株对草莓枯萎病的生防活性初探;陈宏州 等;《江西农业学报》;第26卷(第11期);第54-57页 * |
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