CN116803387A - Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗病毒药物技术领域，本发明提供了一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。本发明通过实验证明Vidofludimus可以抑制HEV RNA复制和HEVORF2蛋白的表达，并且对临床利巴韦林治疗失败相关的HEV突变毒株同样具有抗病毒效果。因此Vidofludimus可以为治疗慢性戊型肝炎患者提供一种新的药物和治疗思路，也可以为临床利巴韦林耐药的HEV患者治疗提供新方案。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒药物技术领域，尤其涉及一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。
背景技术
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的一种病毒性肝炎。HEV是造成全球公共卫生负担的重要病原体。根据世界卫生组织统计，全球每年约有2000万人感染HEV，其中约有330万临床病例，最终导致4.4～7万死亡。HEV对人群普遍易感，临床多表现为隐性感染或急性肝炎。但免疫功能低下或器官移植患者感染HEV会造成HEV持续性感染，逐渐发展为慢性戊型肝炎、肝硬化和肝癌等。越来越多的证据也表明其可导致诸如神经***症状等在内的肝外损伤。据报道，孕妇感染HEV可能发展为暴发性肝炎，死亡率高达20％～30％。对于HEV感染，目前还没有公认的治疗疗法。利巴韦林和干扰素-α是治疗戊肝的首选药物。虽然利巴韦林已成功用于慢性HEV感染，但利巴韦林有致畸性，禁用于妊娠患者的治疗，而且现在临床已经出现了利巴韦林耐药的HEV突变株；而且干扰素-α治疗会导致器官移植受者的移植排斥反应。目前尚无针对HEV的直接抗病毒药物，因此寻找更加安全且有效的新型抗HEV药物对于慢性戊型肝炎的治疗具有重大意义。
Vidofludimus是一种有效的二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂，可在不影响淋巴细胞增殖的条件下抑制IL-17的分泌。也是法尼醇X受体(FXR)的新型调节剂，具有口服活性。Vidofludimus作为一种免疫调节剂，可用于研究自身免疫性疾病，目前正在进行治疗类风湿关节炎的临床III期研究。Vidofludimus还可通过靶向FXR用于脂肪肝的研究。但目前并没有Vidofludimus在抗戊型肝炎病毒方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用，为治疗慢性戊型肝炎患者提供一种新的药物和治疗思路，也可以为临床利巴韦林耐药的HEV患者治疗提供新方案。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。
作为优选，所述戊型肝炎由HEV引起。
作为优选，所述HEV为正戊肝病毒属病毒。
作为优选，所述正戊肝病毒属病毒包括正戊肝病毒属A种、B种、C种和D种。
本发明还提供了一种用于治疗戊型肝炎的药物，所述药物包含Vidofludimus。
作为优选，所述药物中Vidofludimus的浓度为0.04～20μmol/L。
作为优选，所述药物中还含有药剂学能接受的辅料和载体。
作为优选，所述辅料和载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种。
作为优选，所述药物的剂型包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂。
本发明提供了一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。本发明通过实验证明Vidofludimus可以抑制HEV RNA复制和HEV ORF2蛋白的表达，并且对临床利巴韦林治疗失败相关的HEV突变毒株同样具有抗病毒效果。因此Vidofludimus可以为治疗慢性戊型肝炎患者提供一种新的药物和治疗思路，也可以为临床利巴韦林耐药的HEV患者治疗提供新方案。
附图说明
图1为Vidofludimus抑制HEV-p6Gluc复制的作用图；
图2为Vidofludimus对细胞安全性的作用图(以CC50为检测指标)；
图3为Vidofludimus抑制HEV RNA复制的作用图；
图4为Vidofludimus抑制HEV ORF2蛋白表达的作用图；
图5为Vidofludimus抑制人肝脏类器官模型HEV RNA复制的作用图；
图6为Vidofludimus抑制不同捐献者肝脏类器官HEV-p6Gluc复制模型HEV复制的作用图。
具体实施方式
本发明提供了一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。
在本发明中，所述Vidofludimus的化学式为：
在本发明中，所述戊型肝炎由HEV引起。
在本发明中，所述HEV为正戊肝病毒属病毒。
在本发明中，所述正戊肝病毒属病毒包括正戊肝病毒属A种、B种、C种和D种。
本发明提供了一种用于治疗戊型肝炎的药物，所述药物包含Vidofludimus。
在本发明中，所述药物中Vidofludimus的浓度优选为0.04～20μmol/L，进一步优选为0.5～15μmol/L，再进一步优选为5～10μmol/L。
在本发明中，所述药物中还含有药剂学能接受的辅料和载体。
在本发明中，所述辅料和载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种。
在本发明中，所述药物的剂型包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的Vidofludimus，Vidofludimus的DMSO溶液。Vidofludimus生产商：Selleck，货号S7262。
下述实施例中“FBS”为胎牛血清。
下述实施例中所用的BTX细胞电穿孔仪为美国BTX公司的ECM630产品。
下述实施例中使用的HEV复制子模型及野生型和突变型全长HEV复制模型的构建方法如下：
含有HEV全长基因组的野生型HEV质粒(Kernow-C1 p6 gt3，GenBank：JQ679013.1)和HEV-p6Gluc复制子质粒(Wenshi Wang et al.,Gastroenterology,VOLUME 151,ISSUE6,P1251-1253；Wenshi Wang et al.,Science Signaling,2017,25；10(476)；Wenshi Wanget al.,Hepatology.2018,67(6):2096-2112)以及携带RdRp突变(Y1320H、G1634R)的HEV基因组质粒(本实验室构建保存)，分别采用限制性内切酶Mlu I进行酶切(按照表1加入酶切反应体系，将样品置于37℃水浴锅内，酶切1h)，纯化回收线性化质粒(在酶切产物中加入5倍体积的BufferPB混合，将混合溶液加到吸附柱中，静置吸附2min后，12000r/min离心1min，向吸附柱中加入500μl BufferPW洗涤，12000r/min离心1min，将吸附柱空转1min后，向吸附柱中间加入30μlBuffer EB，静置2min后，12000r/min离心1min，回收质粒)，利用T7体外转录试剂盒分别转录出病毒RNA(按照表2加入体外转录反应体系，37℃水浴锅中孵育2h，然后加入0.5μL TURBO DNase，去除残余DNA，37℃水浴锅中孵育15min后，加入30μLLiCl，在-20℃放2h沉淀RNA，4℃，12000r/min离心20min，轻轻弃去上清，1mL 70％乙醇洗涤一遍沉淀RNA，4℃，12000r/min离心10min，弃去乙醇，加入30μL DEPC重悬RNA)，通过电穿孔技术在270V、975μF条件下分别将RNA电转进HEK 293T和Huh7细胞中(本实验室保存)(电转前将3×106个HEK 293T、Huh7分别在60mm培养皿中铺板，用含10％FBS的DMEM培养基在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，弃去培养基，1mLPBS洗两遍。用1mL胰酶消化细胞1min，待细胞收缩变圆轻轻弃去胰酶，加入3mL含血清培养基，吹下细胞到15mL离心管中，1000r/min室温离心5min，弃去培养基，再用3mL PBS重悬细胞洗一遍，1000r/min离心5min，弃去PBS，用400μL Opti-MEM重悬细胞，然后将细胞转移到1.5mL无核酶EP中，加入3μg RNA混合后加入到4mm电穿孔杯(BTX)中进行电穿孔实验)，分别构建HEK 293T-HEV-p6Gluc和Huh7-HEV-p6Gluc复制子模型、Huh7-HEV野生型和突变型复制模型。
表1酶切反应体系
| 组分 | 体积 |
| MluI | 2μL |
| 10×Buffer | 5μL |
| 质粒模板 | 5μg |
| ddH2O | 补足 |
| Total volume | 50μL |
表2体外转录反应体系
| 组分 | 体积 |
| 2×T7 NTP | 5μL |
| 线性化质粒模板 | 500ng |
| GTP | 0.5μL |
| 10×buffer | 1μL |
| Enzyme Mix | 1μL |
下述实施例中使用的类器官HEV复制模型的构建方法如下：
将类器官在冷的Advance DMEM/F12培养基中收集。然后，在Opti-MEM中重悬类器官，500g，8℃离心5min，将200μL的Opti-MEM类器官悬浮液与6μg HEV RNA充分混合，加入到4mm的电穿孔杯中，按照以下程序进行电穿孔：电压700V、脉冲长度4ms，用Opti-MEM洗涤3遍以去除残留RNA，将类器官包埋于基质胶中，在37℃、5％CO2的EM中培养。
下述实施例中使用的WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒为KeyGen公司生产的货号为C0036的产品。
下述实施例中使用的高斯荧光素酶检测试剂盒为Beyotime公司生产的货号为RG062M的产品。
下述实施例中使用的First-Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR GreenqPCRMasterMix(2X)为APExBIO公司生产的货号分别为K1072、K1070的产品。
下述实施例中使用的FITC标记山羊抗兔IgG的二级抗体为Jackson公司生产的货号为111-585-003、商品名称为Alexa Flour 594-comjugated Affinipure GoatAnti-RabbitIgG(H+L)的二抗。
实施例1Vidofludimus抑制HEV复制子复制的体外实验
(1)HEV复制子模型细胞的培养
将含有HEV复制子的HEK 293T和Huh7细胞分别在60mm培养皿中进行培养，DMEM高糖培养基(Bio-Channel)+10％FBS(Bio-Channel)，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，待细胞长满后(约3×106个)铺板加药处理。
(2)实验分组和处理
将两种HEV复制子模型细胞分别接种到96孔板中，每孔2×104个细胞，加入10％FBS(Bio-Channel)+DMEM高糖培养基培养液，细胞贴壁24h后，分组加药处理，每组3个复孔，分组如下：
a、实验组：加Vidofludimus处理(培养基中的终浓度为0.2、1、5、10、50μM)72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(3)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，用高斯荧光素酶检测试剂盒检测高斯荧光素酶活性，分析Vidofludimus抑制HEV复制子复制情况。
(4)结果
实验结果如图1所示。由图1可知，Vidofludimus处理后，相比于空白对照组(1％DMSO)，在有效浓度范围内高斯荧光素酶活性降低了，说明Vidofludimus对HEV复制子复制有抑制作用。Mean±SEM；****P<0.0001。
实施例2Vidofludimus对细胞安全性的体外实验
(1)Huh7-HEV复制子模型细胞的培养
复苏已电转HEV复制子RNA的Huh7细胞进行培养，首先从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速将其放入37℃水浴锅中解冻，待细胞解冻后，将细胞转移到3mL完全培养基中(10％FBS+DMEM)，1000r/min离心5min后弃去培养基，加入10％FBS(Bio-Channel)的DMEM高糖培养基(Bio-Channel)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长满后进行传代。细胞传代，首先弃去培养皿内的培养基，用无菌PBS清洗两遍，加入1mL胰酶(Bio-Channel)进行消化，待细胞回缩变圆后弃去胰酶，按照1:4比例加入完全培养基传代。
(2)实验分组和处理
将Huh7-HEV复制子细胞以每孔2×104个细胞接种到96孔板中，细胞贴壁24h后，分组加药处理，每组3个复孔，分组如下：
a、实验组：加Vidofludimus处理(培养基中的终浓度为0.2、1、5、10、50、200μM)72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(3)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，使用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(KeyGen)检测细胞的增殖活性，通过GraphpadPrism 9计算出其半数毒性浓度(Half-maximal Cytotoxicity Concentration,CC50)，分析Vidofludimus对Huh7细胞的安全性。
(4)结果
实验结果如图2所示。由图2可知，Vidofludimus对Huh7细胞的CC50为160μM。
实施例3Vidofludimus抑制野生型HEV RNA复制的体外实验
(1)Huh7-HEV复制模型细胞的培养
复苏已电转野生型HEV RNA的Huh7细胞进行培养，首先从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速将其放入37℃水浴锅中解冻，待细胞解冻后，将细胞转移到3mL完全培养基中(10％FBS+DMEM)，1000r/min离心5min后弃去培养基，加入10％FBS(Bio-Channel)的DMEM高糖培养基(Bio-Channel)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长满后进行传代。细胞传代，首先弃去培养皿内的培养基，用无菌PBS清洗两遍，加入1mL胰酶(Bio-Channel)进行消化，待细胞回缩变圆后弃去胰酶，按照1:4比例加入完全培养基传代。
(2)实验分组和处理
将已电转野生型HEV RNA的Huh7细胞以每孔5×104个细胞接种到24孔板中，细胞贴壁24h后，分组加药处理，每组2个复孔，分组如下：
a、实验组：加Vidofludimus处理(培养基中的终浓度为1、5μM)72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(3)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，利用TRIzol法提取含有野生型HEV的Huh7细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模版(按照表3加入RNA变性体系，65℃加热5min，再按照表4加入反转录体系，轻轻混匀后，按照25℃，2min；45℃，50min；70℃，15min进行反转录)，然后通过qPCR方法分别检测HEV RNA和GAPDH基因的转录水平(按照表5加入qPCR反应体系，反应程序见表6)，引物序列见表7，分析Vidofludimus对HEV RNA复制水平的影响。
表3RNA变性体系
| 成分 | 体积 |
| Random Primers(50μM) | 1μL |
| 10mM dNTP Mixture | 1μL |
| RNA | 1μL |
| RNase-free Water | Up to 10μL |
表4反转录体系
| 成分 | 体积 |
| 上述变性后反应液 | 10μL |
| 5×First-Strand Buffer | 4μL |
| RNase Inhibitor | 1μL |
| Reverse Transcriptase | 1μL |
| RNase-free Water | Up to 20μL |
表5 qPCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 2×SYBR Green qPCR Master Mix | 10μL |
| Forward Primer(10μM) | 0.5μL |
| Reverse Primer(10μM) | 0.5μL |
| cDNA | 4μL |
| RNase-free Water | Up to 20μL |
表6 qPCR反应程序
表7引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 序号 |
| HEV-genome-F | TTGCCTCCGAGTTAGTCATC | SEQ ID NO.1 |
| HEV-genome-R | TGCAAAGCATTACCAGACCG | SEQ ID NO.2 |
| GAPDH-F | GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG | SEQ ID NO.3 |
| GAPDH-R | ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA | SEQ ID NO.4 |
(4)结果
实验结果如图3所示。由图3可知，Vidofludimus处理后，相比于空白对照组(1％DMSO)，Vidofludimus在5μM可以将HEV RNA水平降低到50％左右。Mean±SEM；****P<0.0001。
实施例4Vidofludimus抑制HEV ORF2蛋白表达的体外实验
(1)Huh7-HEV野生型和利巴韦林耐药相关的突变型HEV细胞复制模型的培养
将构建的野生型和突变型HEV复制模型细胞分别在60mm培养皿中，DMEM高糖培养基(Bio-Channel)+10％FBS(Bio-Channel)，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，待细胞长满后铺板加药处理。
(2)实验分组和处理
将野生型和三种突变型(Y1320H、G1634R单突变和双突变)HEV复制模型分别以每孔3×104个细胞接种到48孔板中，细胞贴壁24h后，分组加药处理，每组2个复孔，分组如下：
a、实验组：加Vidofludimus处理(培养基中的终浓度为0.04、0.2、1、5、20μM)72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(3)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，弃去细胞培养上清，利用4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗一次，0.3％TritonX-100对细胞打孔15min。5％脱脂牛奶室温封闭1h后，以兔源抗HEV ORF2蛋白(稀释比例1:3000，本实验室保存，Rabbit)为一抗，4℃孵育过夜，FITC标记山羊抗兔IgG(1:500，Jackson，111-585-003)为二抗，室温孵育1h，PBS洗三次。用Hoechst(1:500，invitrogen，33342)荧光染料染细胞核，然后用倒置荧光显微镜(Olympus)进行拍照，分析红色HEV ORF2蛋白表达水平的影响。并通过Image J对HEV ORF2蛋白阳性率进行分析，计算出其IC50。
(4)结果
实验结果如图4所示。由图4可知，Vidofludimus处理后，相比于空白对照组(1％DMSO)，HEV ORF2蛋白表达降低，其IC50见表8。
表8 Vidofludimus对HEV野生型和突变型的IC50
| p6 | p6_Y1320H | p6_G1634R | p6_Y1320HG1634R | |
| Vidofludimus | 2.32900 | 2.40800 | 2.02300 | 2.23000 |
实施例5Vidofludimus抑制类器官中HEV RNA复制的体外实验
(1)将包埋于基质胶中的类器官HEV复制模型以每孔3×104个细胞接种到24孔板中，高级DMEM/F12培养基(Invitrogen)培养24h后，分组加药处理，分组如下：
a、实验组：加Vidofludimus处理(培养基中的终浓度为25μM)72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(2)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，利用TRIzol法提取类器官HEV RNA定量，分析Vidofludimus对类器官中HEV RNA复制水平的影响。
(3)结果
实验结果如图5所示。由图5可知，Vidofludimus处理后，相比于空白对照组(1％DMSO)，HEV RNA复制降低。
实施例6Vidofludimus抑制不同捐赠者肝脏类器官HEV-p6Gluc复制模型的作用
(1)实验分组和处理
将类器官HEV复制模型分组加药处理，分组如下：
a、实验组：加不同浓度的Vidofludimus进行处理72小时。
b、空白对照组：加与a组实验组1％DMSO处理。
(2)实验方法
将上述2个分组分别处理72h后，收取上清，用高斯荧光素酶检测试剂盒检测高斯荧光素酶活性，分析Vidofludimus在不同捐赠者肝脏类器官中抑制HEV复制子复制情况。
(4)结果
实验结果如图6所示。由图6可知，Vidofludimus处理后，相比于空白对照组(1％DMSO)，HEV复制子***复制显著降低。
由以上实施例可知，本发明提供了一种Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。本发明通过实验证明Vidofludimus可以抑制HEV RNA复制和HEV ORF2蛋白的表达，并且对临床利巴韦林治疗失败相关的HEV突变毒株同样具有抗病毒效果。因此Vidofludimus可以为治疗慢性戊型肝炎患者提供一种新的药物和治疗思路，也可以为临床利巴韦林耐药的HEV患者治疗提供新方案。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.Vidofludimus在制备戊型肝炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述戊型肝炎由HEV引起。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述HEV为正戊肝病毒属病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述正戊肝病毒属病毒包括正戊肝病毒属A种、B种、C种和D种。
5.一种用于治疗戊型肝炎的药物，其特征在于，所述药物包含Vidofludimus。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物中Vidofludimus的浓度为0.04～20μmol/L。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物中还含有药剂学能接受的辅料和载体。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述辅料和载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂。
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