CN116790623B

CN116790623B - 一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN116790623B
Application number: CN202310839373.7A
Authority: CN
Inventors: 王忠妮; 李鲁华; 陈豆豆; 孟征; 雷月; 唐会会; 朱速松
Original assignee: Guizhou rice research institute
Current assignee: Guizhou rice research institute
Priority date: 2023-07-10
Filing date: 2023-07-10
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2043-07-10
Also published as: CN116790623A

Abstract

一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2及其编码的蛋白和应用。还提供了OsROXY2的突变形式及其编码的蛋白和应用。本申请利用该基因及其突变形式对水稻花器官发育进行调控，对深入研究水稻生殖器官发育的分子机制具有重要的理论及实际意义。

Description

一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2及其编码的蛋白和应用

技术领域

本文涉及植物基因工程技术，尤指一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2及其编码的蛋白和应用，以及OsROXY2突变形式及其编码的蛋白和应用。

背景技术

水稻不仅是单子叶植物的模式植物，也是重要的粮食作物。水稻是世界上近一半人口的主食，其花不仅是繁殖器官，也是籽粒形成的基础。水稻花的正常发育直接影响稻谷产量和稻米品质，因此水稻花发育的研究一直是水稻遗传育种工作者关注的重点。研究水稻花发育不仅具有重要的理论意义，而且对水稻产量和品质遗传育种具有重要的指导意义。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本申请提供了一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的应用，其中，所述基因OsROXY2由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，所述基因OsROXY2应用于水稻的花器官发育调节。

本申请还提供了一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的质粒、植物表达载体、宿主细胞应用于水稻的花器官发育调节，所述OsROXY2由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。

本申请还提供了一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2编码的蛋白的应用，其中，所述蛋白如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，所述蛋白应用于水稻的花器官发育调节。

本申请还提供了一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的突变形式，所述突变形式的花器官表型相比于野生型具有以下特征：

雄蕊部分缺失。

在一些示例性实施方式中，所述突变形式的基因序列与OsROXY2基因序列SEQ IDNO:1相比，具有取代、***和缺失中的一种或多种。在一些示例性实施方式中，所述突变形式具有SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列。

在一些示例性实施方式中，所述突变形式具有SEQ ID NO:4中示出的氨基酸序列。

本申请提供了上述突变形式的质粒、植物表达载体、宿主细胞以及由其获得的蛋白在水稻的花器官发育调控中的应用。

本申请提供了上述突变形式编码的蛋白的应用，其中，所述蛋白如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成，所述蛋白应用于水稻的花器官发育调节。

SEQ ID NO:1序列如下：

ATGCAGTACGGAGCGGCGGCCGAGCAGGCGTGGTACATGCCGGCG

GCGGCGCCGGCACCGATGGTGGAGAGCGCGGTGGCGCGGGTGGAGCG

GCTGGCGTCGGAGAGCGCGGTGGTGGTGTTCAGCGTGAGCAGCTGCTG

CATGTGCCACGCCGTGAAGCGCCTCTTCTGCGGCATGGGGGTGCACCC

GACGGTGCACGAGCTGGACCTCGACCCGCGCGGCCGCGAGCTGGAGCG

CGCCCTGGCGCGCCTCGTCGGGTACGGCGGCCCCGCCGCCGCGTCGCC

GCCCGTCGTCCCCGTCGTCTTCATCGGCGGCAAGCTCGTCGGCGCCATG

GACCGCGTCATGGCCGCGCACATCAACGGCTCCCTCGTCCCCCTCCTCA

AGGAGGCCGGCGCGCTCTGGCTCTAG

SEQ ID NO:2序列如下

MQYGAAAEQAWYMPAAAPAPMVESAVARVERLASESAVVVFSVSSCCMCHAVKRLFCGMGVHPTVHELDLDPRGRELERALARLVGYGGPAAASPPVVPVVFIGGKLVGAMDRVMAAHINGSLVPLLKEAGALWL

SEQ ID NO:3序列如下

ATGCAGTACGGAGCGGCGGCCGAGCAGGCGTGGTACATGCCGGCGGCGGCGCCGGCACCGATGGTGGAGAGCGCGGTGGCGCGGGTGGAGCGGCTGGCGTCGGAGAGCGCGGTGGTGGTGTTCAGCGTGAGCAGCTGCTGCATGTGCCACGCCGTGAAGCGCCTCTTCTGCGGCATGGGGGTGCACCCGACGGTGCACGAGCTGGACCTCGACCCGCGCGGCCGCTAGCTGGAGCGCGCCCTGGCGCGCCTCGTCGGGTACGGCGGCCCCGCCGCCGCGTCGCCGCCCGTCGTCCCCGTCGTCTTCATCGGCGGCAAGCTCGTCGGCGCCATGGACCGCGTCATGGCCGCGCACATCAACGGCTCCCTCGTCCCCCTCCTCAAGGAGGCCGGCGCGCTCTGGCTCTAG(黑体斜体加下划线的序列为突变序列，即，在突变体中，由野生型的G突变为T，密码子GAG变为TAG，编码的氨基酸由E(谷氨酸)变为终止密码子)

SEQ ID NO:4序列如下

MQYGAAAEQAWYMPAAAPAPMVESAVARVERLASESAVVVFSVSSCCMCHAVKRLFCGMGVHPTVHELDLDPRGR

本申请利用水稻花器官发育调控基因OsROXY2的突变形式、构建的突变体以及进行遗传互补验证研究水稻花器官发育调控，对于深入研究水稻生殖器官发育的分子机制具有重要的理论及实际意义。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1示出了野生型水稻与雄蕊数目减少突变体sl的表型特性。野生型水稻的小花由一对内外稃、两枚浆片、六枚雄蕊和一枚雌蕊组成(图1中的A)，突变体sl所有小花中的雄蕊数目均减少(图1中的B-D)，且缺失的雄蕊多位于内稃侧(图1中的E)。此外，部分小花的雌蕊缺失(图1中的C-D)；内外稃形态异常，与野生型内外稃相比(图1中的F)具体表现为外稃弯曲，内稃凹陷变小(图1中的G-I)。

图2示出了野生型与sl突变体中花器官相关表型统计。

图3为野生型小花与sl突变体小花的扫描电镜图片。

图4示出了sl突变体的图位克隆。

图5示出了遗传互补材料的表型。

图6A至图6C示出了敲除材料roxy2的基因型鉴定及表型。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

目前主要存在三类调控双子叶植物花器官数目的作用机制：1)花器官决定的ABCE模型(第一类)，该途径中的花器官决定基因通过调控每轮花器官的特征决定，进而调控花器官数目；2)CLAVATA-WUSCHEL途径(第二类)，该途径中的基因通过调控分生组织中干细胞的维持与分化，控制花序及花分生组织的大小，进而影响花器官的数目；3)其他类途径(第三类)，该途径中的基因，通过调控花器官原基的起始，进而调控花器官的数目。水稻中前两类花器官数目调控机理的功能研究已经取得了很好的研究基础。然而，通过影响(或调控)花器官原基的起始进而调控花器官数目(第三类)的分子网络解析缓慢，亟需开展创新性的研究，以期更全面的揭示水稻花器官数目的调控机制。

拟南芥中研究发现Atroxy1突变体中花瓣数由4减少为2.5，且部分花瓣形态异常。进一步研究发现AtROXY1调控花瓣原基的起始及花瓣的形态发生。此外，AtROXY1还具有抑制C类基因AGAMOUS(AG)在外两轮花器官表达的功能(Xing et al.,2005)。AtROXY1属于CC型谷氧还蛋白(GRX)家族，该家族参与了器官发育、胁迫响应、激素及氮元素信号传导等生物学过程。拟南芥中有21个CC型GRXs，分别被命名为AtROXY1-AtROXY21(Li et al.,2009)，水稻中共有17个CC型GRXs(Xing et al.,2006)，与拟南芥中的研究进展相比，目前对水稻中CC型GRXs的功能研究还很少。

Wang等(2009)研究发现水稻中的OsROXY1和OsROXY2是拟南芥AtROXY1的同源蛋白，二者的表达模式与AtROXY1类似，且均可恢复Atroxy1突变体的表型，因此认为拟南芥和水稻中的ROXYs在花发育方面的功能保守。在拟南芥中过表达OsROXY1或OsROXY2后，转基因株系表现出H₂O₂的积累量增加及对坏死性病原体Botrytis cinerea超敏感的表型，表明二者可能通过影响细胞的氧化还原状态参与植物对病原菌的抗病性反应(Wang et al.,2009)。然而，迄今为止这两个基因在水稻中的生物学功能仍不清楚。

本申请涉及一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2及其编码的蛋白和应用。还提供了OsROXY2的突变形式及其编码的蛋白和应用。

所述基因OsROXY2具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还涉及含上述一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的质粒、植物表达载体、宿主细胞。

所述的含有一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的质粒、植物表达载体、宿主细胞应用于水稻的花器官发育调节。

本发明又涉及一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2编码的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。

本发明基因的获得及其功能验证步骤如下：

OsROXY2基因定位：为了分离基因，本发明首先由突变体sl与水稻品种广陆矮四杂交，构建F₂代定位群体，采用图位克隆定位候选基因。

候选突变位点验证：利用RiceNet网站找到候选基因的信息，在候选位点两侧设计一对特异性测序引物，分别对纯合野生型和突变体的DNA进行PCR扩增，将产物送测序并比对，确定候选基因。

OsROXY2基因的功能分析：通过遗传转化，将包含完整的OsROXY2基因的片段转到突变体sl中进行功能互补试验，获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻。

本发明基于早期发现的一个由未知单隐性核基因控制的水稻花器官发育突变体sl。

与野生型水稻品种C418相比，突变体sl所有小花中的雄蕊数目均减少(图图1中的B-D)，且缺失的雄蕊多位于内稃侧(图1中的E)。此外，我们还发现部分小花的雌蕊缺失(图1中的C-D)；内外稃形态异常，与野生型内外稃相比(图1中的F)具体表现为外稃弯曲，内稃凹陷变小(图1中的G-I)。

另外，本申请对该稳定遗传的雄蕊数目减少突变体sl的图位克隆发现，SL基因编码CC型GRX OsROXY2。表型观察发现突变体sl中所有小花的雄蕊数目均减少，部分小花雌蕊缺失、内外稃形态异常。该表型明显不同于拟南芥roxy1花瓣减少的表型，表明水稻中OsROXY2在调控花器官发育方面的功能与其同源基因AtROXY1不同。因此，有必要对OsROXY2在水稻花器官(雄蕊)数目调控中的功能及作用机制开展***深入的研究。

以下结合具体实施例对本发明作进一步地说明。

实施例1：水稻花器官发育调控基因OsROXY2的获得

突变体sl的表型观察及分析

在水稻品种C418中获得了一个稳定遗传的雄蕊数目减少突变体sl。野生型水稻的小花由一对内外稃、两枚浆片、六枚雄蕊和一枚雌蕊组成(图1中的A)，突变体sl所有小花中的雄蕊数目均减少(图1中的B-D)，且缺失的雄蕊多位于内稃侧(图1中的E)。此外，我们还发现部分小花的雌蕊缺失(图1中的C-D)；内外稃形态异常，与野生型内外稃相比(图1中的F)具体表现为外稃弯曲，内稃凹陷变小(图1中的G-I)。

在图1中：(A)野生型水稻小花含6枚雄蕊，1枚雌蕊；(B)sl突变体小花中含5枚雄蕊，1枚雌蕊；(C)sl突变体小花中含4枚雄蕊，雌蕊缺失；(D)sl突变体小花中含3枚雄蕊，雌蕊缺失；(E)野生型(左)与sl突变体(右)的花图式，野生型内、外稃侧各有3枚雄蕊，sl突变体内稃侧雄蕊减少；(F)野生型水稻的内外稃；(G)-(I)sl突变体的内外稃有不同程度的弯曲。

注：在图1中的A-D中，上部顶角向下的三角指示雄蕊，中部顶角向下的三角指示雌蕊，下部顶角向上的三角指示缺失的雌蕊。Bars＝2mm。

为了深入了解sl中花器官的异常情况，对异常花器官(雌雄蕊及内外稃)进行统计分析。sl中雄蕊数为2-5，其中超过半数小花中的雄蕊数为3(A)；超过90％的小花雌蕊缺失(B)；接近半数小花的内外稃形态异常(C)。

在图2中：(A)雄蕊数目统计；(B)雌蕊数目统计；(C)sl突变体内外稃形态统计。

扫描电镜观察sl突变体中花器官原基的起始情况

为了进一步研究sl突变体中雄蕊数目减少的原因，我们对sl突变体与野生型发育早期的小花进行了扫描电镜观察。野生型水稻小花中产生内外稃原基、6枚雄蕊原基和雌蕊原基(图3中的A)。在sl突变体中，外稃、内稃原基正常起始，内稃侧雄蕊原基数目减少(图3中的B-D)，表明sl突变体中雄蕊数目减少的表型是由于雄蕊原基起始异常造成的。

在图3中：(A)野生型小花的雄蕊原基起始正常；(B-D)sl小花不同发育时期的雄蕊原基。

注：三角指示雄蕊原基，字母l代表外稃原基，p代表内稃原基。bar为25μm。

实施例2：突变位点及靶基因的确定

SL的图位克隆

sl突变体为水稻品种C418的自然突变体。以突变体sl为母本与水稻品种广陆矮四杂交，F₁植株表型与野生型C418表型一致，F₂植株中出现目标性状分离，突变体与野生型的比例接近1:3(37:110)，表明该表型为单基因控制的隐性突变。利用在双亲间具有多态性的InDel标记，对F₂中突变体表型的单株进行遗传分析，将SL定位于第2号染色体AP005522-23210和AP004086-113中间的16.5Mbp-17.5Mb区间。利用SSR分子标记进行精细定位，根据重组交换率将SL定位于第2号染色体RM13210和AP004086-113中间的0.7Mb之间，该区间约有100个基因(图4中的A)。

利用RiceNet网站预测位于目标区间可能影响花器官数目的候选基因(表1)。对这些候选基因进行测序，发现Os02g0512400(OsROXY2)外显子226-228位置的GAG突变为TAG导致终止密码子提前(图4中的B)。

在图4中：(A)SL的图位克隆；(B)OsROXY2的基因结构及位点突变情况。

表1候选基因列表

实施例3：遗传互补验证：OsROXY2可以恢复sl的表型

为了确定sl突变体的表型是由OsROXY2突变所致，进行了遗传互补验证。将OsROXY2的编码区及起始密码子上游1.5kb的片段连入pCAMBIA1301，构建互补载体，转化sl突变体，获得转基因材料。表型观察发现，转化空载体不能恢复sl的表型(图5中的A、B)；转化互补载体后，sl的表型恢复正常(图5中的C、D)，表明OsROXY2可以恢复sl的表型，从而确定sl突变体雄蕊数目减少的表型是由OsROXY2突变造成的。

在图5中：(A)转空载的小花内稃凹陷；(B)转空载的小花中雄蕊4枚，雌蕊缺失；(C)遗传互补材料的内外稃正常；(D)遗传互补材料的雌雄蕊数目正常。

注：图5中的(B)与(D)中箭头指示雄蕊，图5中的(B)的三角指示缺失的雌蕊，图5中的(D)的三角指示正常雌蕊。

OsROXY2的敲除材料的表型与sl类似

为了进一步确定sl突变体的表型是由OsROXY2突变所致，利用CRISPR-cas9技术获得了OsROXY2的敲除材料roxy2。测序后发现，OsROXY2的基因序列第41位***了一个A(图6A)，导致移码突变。表型观察发现，敲除材料roxy2中雄蕊数目减少为3-5枚，部分材料的雌蕊缺失(图6C)。该结果近一步确定sl突变体雄蕊数目减少的表型是由OsROXY2突变造成的。

在图6A-图6C中：(图6A)测序结果表明敲除材料中OsROXY2的DNA序列中***一个A；(图6B)对照材料中雄蕊6枚，雌蕊1枚；(图6C)敲除材料roxy2中雄蕊数目减少为3-5枚，部分材料的雌蕊缺失。

注：上部顶角向下的三角指示雄蕊，下部顶角向上三角指示缺失的雌蕊，下部顶角向下三角指示正常雌蕊。Bar为2mm。

综上，通过对突变体sl、遗传互补材料及敲除材料的表型观察，可以确定水稻中的OsROXY2基因具有与使雌蕊、雄蕊数目减少相关的功能。该功能可以应用于智能去雄分子育种，加快不育系的育种进程。

Claims

1. 一种水稻花器官发育调控基因OsROXY2的突变形式，其中，所述突变形式编码的蛋白由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成；并且所述突变形式的花器官表型相比于野生型具有以下特征：

雄蕊部分缺失。

2. 根据权利要求1所述的突变形式，其中，所述突变形式具有SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列。

3. 根据权利要求2所述的突变形式，其中，所述突变形式的核苷酸序列与OsROXY2基因序列SEQ ID NO:1相比，具有取代、***和缺失中的一种或多种。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变形式的质粒、植物表达载体、宿主细胞以及由其获得的蛋白在水稻的花器官发育调控中的应用。

5. 根据权利要求1至3中任一项所述的突变形式编码的蛋白的应用，其中，所述蛋白由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成，所述蛋白应用于水稻的花器官发育调节。