CN116790512A - 一株新型裂解k2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明生物技术领域，尤其涉及一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1于2023年保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2023261，在上述技术方案中，进一步的，所述包含如上所述的肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1的制剂；其中，所述的制剂为喷洒剂或注射剂，该噬菌体不仅对分离于猪场污水的宿主K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌Kp_B具有较好的消杀效果，对另外3株分离于医院的高毒力肺炎克雷伯氏菌也有很强的消杀效果，抗菌谱比较特异，可应用于制备防治高毒力肺炎克雷伯氏菌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)噬菌体(bacteriophage)，Klebsiellabacteriophage vB_KpnP_B1，保藏日期：2023-03-07，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)是重要的***共患病原菌，该菌可引起严重的院内和社区感染，包括肺炎、***、肝脓肿、菌血症、结膜炎和脑膜炎等，是人医临床上常见的条件致病菌之一，也给养殖业造成了不小的经济损失。
随着抗生素在临床和养殖业的无限制使用，肺炎克雷伯菌耐药情况也愈发严峻，尤其是产碳青霉烯酶高毒力菌株(carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiellapneumoniae)的出现，更是让肺炎克雷伯菌的抗生素治疗陷入几乎“无药可用”的境地。病原细菌对抗生素的耐药性日益增强，给人类健康、公共卫生安全和养殖业健康发展带来巨大威胁。肺炎克雷伯杆菌是耐药性最严重的人畜共患机会性致病菌之一，包含K1和K2荚膜型在内的一些肺炎克雷伯杆菌毒力极强，可引起动物和人的多种感染性疾病。这些强耐药与强毒力并存的肺炎克雷伯杆菌菌株引起的感染极难防控，目前缺乏有效的药物和治疗策略。
噬菌体(bacteriophage)作为一类特异性感染细菌的病毒，能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物并引起宿主菌的裂解，是天然的杀菌物质，曾广泛应用于耳喉科、口腔科、眼科、皮肤科、儿科及肺部疾病等的治疗。在全球医疗领域面临日益严峻的细菌耐药性威胁时，噬菌体因其高效的、特异性的杀菌作用在治疗或预防疾病具有极大的潜力。目前，高毒力且具有耐药性的肺炎克雷伯菌已有报道，但关于高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体研究较少，开发新型对高毒力肺炎克雷伯菌具有特异性、强效性防治效果的噬菌体具有十分重要的意义。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供名称一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，旨为高毒力肺炎克雷伯杆菌的感染提供新的治疗方案。
有鉴于此，本发明提供一株新的K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1，所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1于2023年03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2023261。
在上述技术方案中，进一步的，所述包含如上所述的肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的制剂；其中，所述的制剂为喷洒剂或注射剂。
在上述技术方案中，进一步的，所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1在制备防治高毒力肺炎克雷伯杆菌感染的制剂中的应用。
在上述技术方案中，进一步的，所述如上所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1在杀灭养殖环境或医疗环境中的肺炎克雷伯杆菌的应用。采用所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1医疗环境(如地面、器械、墙壁等)和养殖环境(食槽、围栏、饲料、饮水、粪便等)中的多重耐药高毒力肺炎克雷伯杆菌。
本发明的有益效果是：
1.该一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1是一株新发现的噬菌体，该噬菌体不仅对分离于猪场污水的宿主多重耐药高毒力肺炎克雷伯杆菌具有较好的消杀效果，对另外3株分离于医院的多重耐药肺炎克雷伯杆菌也有很强的消杀效果，抗菌谱比较特异，可应用于制备防治高毒力肺炎克雷伯杆菌的药物。
2.该一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1潜伏期短，能快速杀死培养基中的宿主菌，且毒副作用小，安全性高，温度、酸碱耐受范围比较广且具有良好的亲水性，易制成喷洒剂和注射剂，对感染多重耐药肺炎克雷伯杆菌的动物和被多重耐药肺炎克雷伯杆菌污染的环境均有很好的治疗、杀灭作用。
附图说明
图1是本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1噬菌斑；
图2是本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1扫描电镜图；
图3是本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1一步生长曲线；
图4是温度对本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1活性影响；
图5是酸碱度对本申请肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1活性影响；
图6是本发明高毒力肺炎克雷伯杆菌Kp-B的最小致死量；
图7是本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1小鼠治疗效果；
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请的描述中，需要说明的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施，且“第一”、“第二”等所区分的对象通常为一类，并不限定对象的个数，例如第一对象可以是一个，也可以是多个。此外，说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一，字符“/”，一般表示前后关联对象是“或”的关系。
需要说明的是，在本申请的描述中，术语方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
需要说明的是，在本申请中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。此外，需要指出的是，本申请实施方式中的方法和装置的范围不限按示出或讨论的顺序来执行功能，还可包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序来执行功能，例如，可以按不同于所描述的次序来执行所描述的方法，并且还可以添加、省去、或组合各种步骤。另外，参照某些示例所描述的特征可在其他示例中被组合。
实施例1：
实施例涉及的菌株、试剂及培养基：
实验所用宿主菌为一株高毒力肺炎克雷伯杆菌临床株KP-B，于某猪场病猪中分离得到，与本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1同时保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2023261。
LB营养琼脂、LB肉汤、SM缓冲液采购于北京索莱宝科技有限公司；琼脂粉采购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；1mol/L Tr is、NaCl、MgSO4、EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、PBSDNase I、RNase A(TaKaRa)、固体氯化钙、浓HCl等为市售。
实施例2：
肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的分离与制备：
将宿主菌划线接种于1.5％LB琼脂培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mLLB液体培养基中，37℃振荡培养5-6h后作为宿主菌培养物备用。
噬菌体的分离采用污水富集法：在4℃、8000rpm条件下离心10min，目的是除去污水中大颗粒废渣，取上清液，加入CaCl2至终浓度为1mmol/L，作用约15min，然后用0.22μm的孔滤膜过滤。取100mL滤液加入到2x 100ml LB液培养基中，并按1％比例加入对数期生长的肺炎克雷伯菌液，于37℃、180rpm过夜培养后，取适量体积以10000rpm离心10min，取上清液，并通过0.22μm孔径的滤膜过滤去除残留的细菌，收集上清液作为噬菌体原液。将200μl对数生长期宿主菌液加入到5～6ml 0.5％ LB琼脂培养基中，混匀后倒入1.5％LB琼脂平板上，凝固后滴加10μL噬菌体原液，对照组滴加等量的无菌水，待平板干燥后置于37℃培养12h，观察是否出现噬菌斑。若有噬菌斑形成，证明有噬菌体存在。
通过双层琼脂板法纯化噬菌体，用PBS缓冲液以10倍梯度稀释噬菌体原液，并将100μL的噬菌体稀释液200μL对数期宿主细菌混合，作用10min，加入到5～6ml 0.5％ LB琼脂培养基中并充分混合，将其铺在1.5％ LB琼脂平板上，待上层凝固，将其移至37℃的恒温培养箱中过夜培养。挑取单斑继续纯化，直至出现大小均匀的噬菌斑，获得纯化的单一噬菌体。4℃保存，备用。
采用双层平板检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1mL与宿主菌液0.2mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养8h左右，对每个平板进行噬菌斑计数。选取噬菌斑在100-300左右的平板，根据稀释倍数计算得到噬菌体初始浓度即得到噬菌体效价。噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，此噬菌体效价为1.52×1010PFU/ml。
分离得到的噬菌体命名为vB_KpnP_B1，保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年03月07日，保藏号为CCTCC M2023261。
实施例3
噬菌体的扩增和浓缩：
将宿主菌37℃，160rpm振荡培养至对数生长初期。按最佳感染复数加入噬菌体，37℃，160rpm振荡培养至溶液澄清，分别加入DNase I和RNase A至终浓度1μg/mL后放入摇床中振荡培养30min，再加入1％氯仿使细菌破裂。加入NaC l至终浓度为1mo l/L，搅拌混合均匀，至完全溶解后冰浴6h。将裂解液4℃，10000×g离心15min，收集上清。将收集好的上清按10g每100mL的量加入PEG8000，轻缓颠倒使其溶解，禁剧烈，在4℃冰箱中冰浴过夜，使噬菌体颗粒形成沉淀。之后4℃，12000rpm离心15min，弃上清，留沉淀。含沉淀的离心管开盖倒置，使得剩余液体流干。向离心管中加入2mL的SM缓冲液，反复冲洗、溶解噬菌体颗粒，用等体积氯仿抽提2～3次，得到上层水相，再用0.22μm孔径的滤膜过滤入新管即为噬菌体浓缩液。
实施例4：
肺炎克雷伯杆菌噬菌vB_KpnP_B1的透射电镜观察：
吸取一滴实施例2约20μL滴在铜网上，让其静置沉淀15min，吸去多余液体，让其静置沉淀15min，吸去多余液体，加一滴2％磷钨酸溶液，染色5min，后立即除去侧边多余的染色液，在干燥后至透射电镜下观察形态；观察结果如图2所示，电镜观察显示该噬菌体头部呈正二十面体结构，头部直径约为55nm，属于有尾噬菌体目，短尾病毒科。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》，该噬菌体属于短尾病毒科(Breviviridae)。
实施例5：
肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1最佳感染复数的测定(感染复数为感染初期噬菌体的数与宿主菌数的比)：
感染复数(Multiplicity of infection,MOI)是吸附于细菌上的噬菌体数与培养中的细菌数之比。噬菌体与宿主菌结合有最佳感染复数。测定方法如下：将宿主菌培养至对数期，菌落数量约为108CFU/ml，按MOI为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例加入噬菌体，37℃孵育10min，加入10mL LB液体培养基，37℃、160rpm振荡培养6h后，10000rpm离心10min，取上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤，之后用LB液体培养基按10倍梯度稀释，通过双层琼脂平板法进行效价的测定。每次独立试验重复3次。结果如表1所示，肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的最佳感染复数为0.001。
表1肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的最佳感染复数
实施例6：
肺炎克雷伯杆菌噬菌vB_KpnP_B1的噬菌体一步生长曲线的测定：
测定一步生长曲线方法如下：取1mL细菌溶液，浓度1×108CFU/mL，并根据最佳感染复数与噬菌体混合，37℃静置温育，吸附5min，在4℃、5000rpm条件下进行5min离心，弃去上清液，然后加入1.5mL预热至37℃的LB液体培养基重悬，然后在4℃、5000rpm条件下离心5min，弃去上清液，重复此步骤两次，确保将没有吸附的游离噬菌体去除干净，加入到含有10mL 37℃预热的LB液体培养基的离心管中重悬，将上述离心管置于37℃，180rpm的摇床震荡培养，每隔10min取样200μL，4℃、10000rpm进行5min离心，标好序号连续取样100min。利用双层琼脂平板法每10min测定一次噬菌体的效价，以横坐标是感染时间，纵坐标为噬菌体效价绘制一步生长曲线。每次独立试验，重复3次。
结果如图3所示，噬菌体vB_KpnP_B1的效价在感染宿主菌前10min没有明显的变化，之后噬菌体效价迅速增加，40min后趋于稳定，即该噬菌体的潜伏期约为10min，暴发期约为40min，暴发量为152PFU/Cell。
实施例7：
肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的温度耐受实验：
取10个无菌EP管，分别取1mL噬菌体裂解液置于1.5ml EP管中，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃中分别水浴20min、40min、60min,各取100μL采用双层平板法测定噬菌体滴度。以温度为横坐标、以所对应的噬菌体滴度为纵坐标作图，根据噬菌体滴度变化得出噬菌体最适生长温度范围。每次独立试验，重复3次。结果如图4所示，噬菌体vB_KpnP_B1的适宜温度为30-60℃，该噬菌体的适宜温度范围较宽。
实施例8：
肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1的酸碱度耐受实验：
取9mL LB肉汤，分别把其pH值调定到pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11，加入1mL噬菌体裂解液，室温放置2h。采用双层平板法进行噬菌体滴度测定，平行测定3次。以pH为横坐标、以所对应的噬菌体滴度为纵坐标作图，根据噬菌体滴度变化得出噬菌体最适生长pH范围。每次独立试验，重复3次。结果如图5所示，噬菌体vB_KpnP_B1的适宜的pH范围为4-10，该噬菌体的适宜pH范围较宽。
实施例9：
肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1宿主谱分析：
将实施例1备用的噬菌体效价调整为109PFU/ml备用，噬菌体vB_KpnP_B1宿主谱分析。收集了来自本实验室保存的40株不同来源和类别的肺炎克雷伯杆菌，用实施例1的噬菌体进行宿主谱分析，具体操作如下：分别取40株肺炎克雷伯杆菌过夜培养物0.2ml，加入45℃左右的0.7％LB半固体培养基8m l，均匀铺在预先制备好的固体1.5％LB固体培养基上，然后将每个平板平均分成四个区域，其中三个区域取10μl实施例1备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养10h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”。
结果如表2所示：肺炎克雷伯噬菌体vB_KpnP_B1能裂解K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯杆菌，不能裂解K1、K47、K64和K19型肺炎克雷伯杆菌，表明vB_KpnP_B1对K2型肺炎克雷伯杆菌具有特异性的裂解能力。
表2是本发明肺炎克雷伯杆菌噬菌体vB_KpnP_B1裂解谱
(备注：ND未测定；Unk未知)
实施例10：
肺炎克雷伯杆菌KP-B引起小鼠最小致死量的确定：
将36只小鼠随机分为6组(每组6只)，以不同剂量的菌液(2.4×105、2.4×104、2.4×103、2.4×102、2.4×101CFU/只)腹腔注射实验小鼠(6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠)，对照组在小鼠腹腔注射等量无菌PBS，每12小时记录各组小鼠生存情况。根据小鼠7天的死亡情况，得出高致病性肺炎克雷伯杆菌Kp-B的最小致死量。
结果如图6所示，腹腔注射24CFU Kp-B病原菌小鼠7天内存活率为50％，同时感染小鼠表现出严重的临床症状，拒绝采食饮水，被毛炸起、四肢僵硬。腹腔注射2.4×102CFUKp-B病原菌小鼠7天内存活率为40％；腹腔注射2.4×103CFU Kp-B病原菌小鼠7天内存活率为20％；腹腔注射2.4×104CFU Kp-B病原菌小鼠36h内存活率为0；腹腔注射2.4×105CFUKp-B病原菌小鼠24内存活率为0；结论为高毒力肺炎克雷伯杆菌Kp-B引起小鼠最小完全致死量为2.4×104CFU。
噬菌体vB_KpnP_B1的无菌检测试验：取500μl制备的噬菌体vB_KpnP_B1制剂涂布于血平板上，置于37℃恒温培养，72h后观察血平板是否有病原微生物生长，以判断噬菌体制剂中是否存在病原微生物污染。噬菌体vB_KpnP_B1制剂在血平板上培养72h，无病原微生物生长，无菌检查合格可以进行下一步实验。
实施例11：
噬菌体vB_KpnP_B1的体内安全性试验：
取6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠12只，随机分为两组，每组6只。实验组每只小鼠腹腔注射1mL浓度为1010PFU/mL的噬菌体vB_KpnP_B1制剂，对照组每只小鼠腹腔注射等体积无菌PBS。喂养两组小鼠一周，观察有无临床变化。之后，处死小鼠，剖检小鼠并观察内脏、消化道及黏膜情况。结果显示，经过对两组小鼠连续一周的观察，小鼠精神状态良好，日常行为无异常；脱颈处死小鼠，解剖检查各组织器官均无异常。提示噬菌体vB_KpnP_B1安全性良好，对小鼠没有毒副作用。
实施例12：
不同剂量噬菌体对小鼠存活率的影响：
具体实验方案如下：取6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠30只，随机分为5组，每组6只。噬菌体治疗组为在小鼠腹腔注射攻菌2×MLD肺炎克雷伯菌KP-B(2.4×104CFU/小鼠)1小时后，分别腹腔注射1.52×103PFU/小鼠，1.52×104PFU/小鼠，1.52×105PFU/小鼠剂量的噬菌体进行治疗；阴性对照组为攻菌和治疗时均使用无菌PBS替代；阳性对照组为腹腔注射攻菌后使用等量无菌PBS治疗。每12小时记录各组小鼠死亡情况。
vB_KpnP_B1治疗后结果如图7所示，攻菌2×MLD(2.4×104CFU/小鼠)高致病性Kp-B后，未治疗小鼠在36小时内全部死亡。与对照组相比，噬菌体治疗组显著提高了小鼠的存活率，仅1.52×104PFU剂量的噬菌体就能使小鼠7天内存活率提高至60％，1.52×105PFU剂量的噬菌体对小鼠的保护率最高，小鼠7天内存活率高达100％，表明该噬菌体具有良好的治疗效果，很大程度上提高了小鼠的存活率。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (4)
1.一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，包括肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1，其特征在于：所述所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1于2023年保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2023261。
2.根据权利要求1所述的一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1为制剂。
3.根据权利要求1所述的一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1在制备防治多重耐药肺炎克雷伯氏菌感染的制剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的一株新型裂解K2荚膜型高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体及其应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_B1在杀灭养殖环境或医疗环境中的肺炎克雷伯氏菌的应用。
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