CN116785274A - 大狼毒中具有强抗皮肤癌和抗炎活性的二萜化合物的制备方法和应用 - Google Patents
大狼毒中具有强抗皮肤癌和抗炎活性的二萜化合物的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种大狼毒中具有强抗癌和抗炎活性的二萜化合物的制备方法和应用，所述二萜化合物具有式1、2和3的结构式：。所述二萜化合物的应用为在制备抗癌药物或抗炎药物中的应用；所述三个二萜化合物的制备方法是以大狼毒全草为原料，用化学溶剂提取、萃取，经过正相柱色谱分离，然后制备HPLC分离获得。本发明首次从大狼毒全草中分离得到ingenol‑20‑dodecanoate、ingenol‑20‑palmitate和ingenol‑20‑pentadecanoate三个二萜化合物。本制备方法简单，纯化度高，产率高；所述三个二萜化合物具有很强的抗皮肤癌、抗结肠癌和抗炎活性，为此类二萜化合物类物质的提取以及药用研究提供了基础及新思路。
Description
技术领域
本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及大狼毒中三种具有强抗皮肤癌和抗炎活性的二萜化合物的制备方法和应用。
背景技术
据世界卫生组织的报道，癌症是世界第二大致死疾病，每年都造成大量的人口死亡。到目前为止，很多抗癌药物的药效不能让人满意，我们仍然缺乏高效、无明显毒副作用的抗癌药物，而天然药物的抗癌活性研究却显现了广阔的运用前景。因此，开发活性更佳、治疗效果更好的癌症治疗药物是研究人员亟需解决的问题。
L-NMMA（L-单甲基精氨酸）是一种非特异的NOS抑制剂，能阻止关体内 NOS的合成，间接抑制NO的产生，从而抑制炎症，因此，研究抗NO产生的化合物对于开发抗炎药物具有重要的意义。
本发明旨在提供一种从大狼毒中分离得到的具有抗皮肤癌和抗炎活性的二萜化合物。
发明内容
本发明的第一目的是提供大狼毒中三种二萜化合物的应用，本发明的第二目的是提供所述三种二萜化合物的制备方法。
本发明的第一目的是这样实现的，一种二萜化合物或含有该二萜化合物的药物组合物在制备抗癌药物或抗炎药物中的应用，所述二萜化合物具有式1、式2和式3所示的结构：
。所述二萜化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1) 有机溶剂加热超声提取：将大狼毒全草晒干，粉碎至30-90目，在55℃-60℃下用第一有机溶剂浸泡后超声提取5-7次，每次60-80分钟，合并提取液，浓缩后得到浸膏a；
(2) 有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量2-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3-4次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到浸膏b；
(3) 正相色谱法分离：将所述浸膏b 用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，经薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似组分得到5个组分A-E。其中组分A主要由石油醚/乙酸乙酯1:0制备，B主要由石油醚/乙酸乙酯9:1和7:1制备，C主要由石油醚/乙酸乙酯4:1制备，D主要由石油醚/乙酸乙酯2:1制备，E由石油醚/乙酸乙酯1:1和0:1制备；
(4) 制备HPLC纯化：将组分B经制备HPLC分离纯化，即得化合物1、化合物2和化合物3。
本发明的有益效果为：
本发明首次从大狼毒中分离得到三种具有抗癌和抗炎活性的二萜化合物，即ingenol-20-dodecanoate、ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate，为这三个二萜化合物的制备提供了新的制备途径，本制备方法操作简单，获得的二萜ingenol-20-dodecanoate、ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate纯度均高达98%-99%；另外，本发明首次发现ingenol-20-dodecanoate、ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate具有很好的抗皮肤癌、抗结肠癌和抗炎活性，通过抗癌活性筛选，ingenol-20-dodecanoate、ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate对人类黑色素瘤细胞系A2058有很强的细胞毒活性，IC50值分别为2.13、2.82和2.11μΜ，均强于抗癌药顺铂；ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate对人结肠癌细胞系SW480 的IC50值分别14.73和14.41μΜ，强于抗癌药顺铂；在抗炎活性实验中，这三个二萜的活性分别为4.72、4.51和4.21μΜ，均强于NOS抑制剂L-单甲基精氨酸。这三个二萜可作为抗皮肤癌和抗炎药物的先导性化合物的研发，在抗癌和抗炎药物研究领域开发有很好的应用前景，也为此类二萜化合物类物质的提取以及药用研究提供了基础及新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物1的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例1中化合物1的DEPT谱图；
图3为本发明实施例1中化合物1的MS谱图；
图4为本发明实施例1中化合物2的1H NMR谱图；
图5为本发明实施例1中化合物2的DEPT谱图；
图6为本发明实施例1中化合物2的MS谱图；
图7为本发明实施例1中化合物3的1H NMR谱图；
图8为本发明实施例1中化合物3的DEPT谱图；
图9为本发明实施例1中化合物3的MS谱图；
图10为本发明二萜化合物的结构式。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明一种二萜化合物或含有该二萜化合物的药物组合物在制备抗癌药物或抗炎药物中的应用，所述二萜化合物具有式1、式2和式3所示的结构：
。
所述抗癌药物为用于治疗皮肤癌的药物。
所述抗癌药物为用于治疗结肠癌的药物。
所述药物剂型为片剂、胶囊剂、口服液、***片、 颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
本发明还提供了所述二萜化合物的制备方法，具体按以下步骤实现：
(1) 有机溶剂加热超声提取：将大狼毒全草晒干，粉碎至30-90目，在55℃-60℃下用第一有机溶剂浸泡后超声提取5-7次，每次60-80分钟，合并提取液，浓缩后得到浸膏a；
(2) 有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量2-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3-4次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到浸膏b；
(3) 正相色谱法分离：将所述浸膏b 用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，经薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似组分得到5个组分A-E。其中组分A主要由石油醚/乙酸乙酯1:0制备，B主要由石油醚/乙酸乙酯9:1和7:1制备，C主要由石油醚/乙酸乙酯4:1制备，D主要由石油醚/乙酸乙酯2:1制备，E由石油醚/乙酸乙酯1:1和0:1制备；
(4) 制备HPLC纯化：将组分B经制备HPLC分离纯化，即得化合物1、化合物2和化合物3。
所述步骤1中，第一有机溶剂为85%-99%的乙醇或85%-99%的甲醇。
所述步骤2中，第二有机溶剂为85%-99%的二氯甲烷或85%-99%的乙酸乙酯。
所述步骤6中，所述制备HPLC采用的流动相是45%-98%的甲醇/水溶液或34%-85%的乙腈/水溶液，制备柱是30×250 mm，5μm的月旭 Ultimate XB-C18，DAD检测器波长为204nm、210 nm、254 nm和306 nm，流速为15-40 mL/min，进样量为0.5 -3.0 mL。
所述步骤3中，硅胶柱的装柱方法如下：将浸膏b用85%-99%的二氯甲烷搅拌均匀，加入样品量1-3倍量的80-100目的硅胶晾干，用样品量12-69倍的100-200目的硅胶安装色谱柱
本发明所述的大狼毒属大戟属植物大狼毒（拉丁名：Euphorbia jolkinii），不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将产自云南省昆明市梁王山的大狼毒全草（Euphorbia jolkinii）2.3 Kg晒干后粉碎到60目，用92%的工业乙醇在60℃下超声提取6次，每次70分钟，浓缩乙醇溶液得到浸膏0.2 Kg。
把浸膏倒入分液漏斗，加水0.4 L，搅拌均匀后加入0.4 L二氯甲烷，震荡，然后充分静置，等待水和有机溶剂分层后抽出二氯甲烷，反复该过程3次，合并二氯甲烷萃取溶液，减压蒸馏后得到大狼毒浸膏0.1 Kg。把180 mL二氯甲烷加入浸膏后溶解浸膏，再加入0.3Kg的硅胶（80-100目）搅拌均匀，在室温下干燥。称取5 Kg硅胶（100-200目）安装硅胶柱色谱，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到A-E一共5个组分。其中组分A主要由石油醚/乙酸乙酯1:0制备，B主要由石油醚/乙酸乙酯9:1和7:1制备，C主要由石油醚/乙酸乙酯4:1制备，D主要由石油醚/乙酸乙酯2:1制备，E由石油醚/乙酸乙酯1:1和0:1制备。取组分B（30 g）用制备高效液相色谱分离纯化组分，制备色谱柱参数：30×250 mm，5μm的月旭 Ultimate XB-C18，DAD检测器波长为204 nm、210 nm、254nm和306 nm，流速为15-40 mL/min，进样量为0.5 -3.0 mL。化合物1-3均从组分B中分离得到，其中化合物1是采用91%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为9.7min时所对应的洗脱液，蒸干后得到199.0 mg 纯度为99%的ingenol-20-dodecanoate；化合物2是采用91%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为30.4min时所对应的洗脱液，蒸干后得到373.0 mg纯度为99%的ingenol-20-palmitate；化合物3是采用91%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为21.5 min时所对应的洗脱液，蒸干后得到231.0 mg纯度为99%的ingenol-20-pentadecanoate。
化合物1: ingenol-20-dodecanoate，无色透明油状液体，根据NMR（图1和图2）和MS（图3）数据推断其分子式为C32H50O6。1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ H: 5.92 (d,J= 1.5 Hz,H-1); 4.42 (d,J= 5.5 Hz, H-3); 3.65 (d,J= 10.6 Hz, H-5); 6.07 (d,J= 3.7 Hz,H-7); 4.07 (dd,J= 3.8, 11.7 Hz, H-8); 2.32 (m, H-11); 2.25 (m, H-12a); 1.74(s, H-12b); 0.70 (dd,J= 8.5, 14.9 Hz, H-13); 0.94 (m, H-14); 1.06 (s, CH3 -16); 1.11 (s, CH3 -17); 0.97 (d,J= 6.9 Hz, CH3 -18); 1.84 (d,J= 1.1 Hz, CH3 -19);4.70 (d,J= 12.9 Hz, H-20a); 4.53 (d,J= 12.9 Hz, H-20b); 2.30 (t,J= 6.5 Hz, H-2′); 1.26-1.60 (m, H2-3′-H2-11′); 0.88 (t,J=6.8 Hz, H3-12′)。13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ C: 129.7 (C-1), 138.9 (C-2), 80.4 (C-3), 84.3 (C-4), 73.8 (C-5), 136.8(C-6), 127.9 (C-7), 44.1 (C-8), 207.0(C-9), 72.6 (C-10), 39.7 (C-11), 31.0(C-12), 23.2 (C-13), 23.0 (C-14), 23.9 (C-15), 28.5 (C-16), 15.5 (C-17), 17.4(C-18), 15.4 (C-19), 66.3 (C-20), 174.3(C-1′), 34.4 (C-2′), 24.9 (C-3′),29.1-29.7 (C-4′-C-9′),31.9 (C-10′), 22.7 (C-11′), 14.1 (C-12′)。
化合物2: ingenol-20-palmitate，无色透明油状液体，ESI-MSm/z585（[M-H]-），根据NMR（图4和图5）和MS（图6）数据推断其分子式为C36H58O6，1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ H6.05 (d,J= 3.9 Hz, H-7), 5.90 (s, H-1), 4.69 (d,J= 12.9 Hz, Ha-20), 4.54 (d,J= 12.9 Hz, Hb-20), 4.08 (dd, J= 3.3, 11.5 Hz, H-8), 3.64 (d,J= 11.0 Hz, H-5),1.83 (s, CH3 -19), 1.25 (m, CH2 -3′-CH2 -15′), 1.10 (s, CH3 -17), 1.06 (s, CH3 -16),0.95 (d,J= 6.9 Hz, CH3 -18), 0.88 (t,J= 6.7 Hz, CH3 -16′), 0.70 (dd,J= 8.2, 15.0Hz, H-13)。13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ C207.5 (C-9), 174.5 (C-1′), 17.4 (C-18),139.0 (C-2), 136.8 (C-6), 129.2 (C-1), 127.4 (C-7), 84.2 (C-4), 80.1 (C-3),73.8 (C-5), 72.6 (C-10), 14.1 (C-16′), 66.3 (C-20),44.0 (C-8), 39.5 (C-11),34.3 (C-2′), 31.9 (C-14′), 30.9 (C-12), 23.8 (C-15), 29.7 (C-6′, C-7′, C-8′,C-9′, C-10′, C-11′, C-12′, C-13′), 28.5 (C-16),15.4 (C-19), 29.5 (C-5′, C-14′), 29.3 (C-4′), 24.9 (C-3′), 23.2 (C-13), 22.9 (C-14), 22.7 (C-15′), 15.5(C-17)。
化合物3: ingenol-20-pentadecanoate，无色透明油状液体，无色透明油状液体，ESI-MSm/z1139（[2M+Na]+）（图9）结合其核磁共振谱图（图7和图8）得出分子式为C34H54O6。1HNMR (400 MHz, CDCl3):δ H6.05 (d,J= 4.2 Hz, H-7), 5.90 (s, H-1), 4.69 (d,J= 12.9Hz, Ha-20), 4.54 (d,J= 12.9 Hz, Hb-20), 4.08 (dd,J= 3.7, 11.7 Hz, H-8), 3.64(d,J= 10.9 Hz, H-5), 1.83 (s, CH3 -19), 1.26 (m, CH2 -3′-CH2 -13′), 1.10 (s, CH3 -17), 1.06 (s, CH3 -16), 0.96 (d,J= 7.0 Hz, CH3 -18), 0.88 (t,J= 6.8 Hz, CH3 -16′), 0.70 (dd,J= 8.3, 14.9 Hz, H-13)。13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ C207.3 (C-9),174.4 (C-1′), 139.0 (C-2), 136.7 (C-6), 129.3 (C-1), 127.6 (C-7), 84.2 (C-4),80.2 (C-3), 73.8 (C-5), 72.6 (C-10), 66.3 (C-20), 44.0 (C-8), 39.6(C-11),34.3 (C-2′), 31.9 (C-14′), 30.9 (C-12), 29.7 (C-6′, C-7′, C-8′), 29.6 (C-9′,C-10′, C-11′), 29.5 (C-5′, C-12′), 29.3 (C-4′), 28.5 (C-16), 24.9 (C-3′),23.9(C-15), 23.1 (C-13), 22.9 (C-14), 22.7 (C-13′), 17.4 (C-18), 15.5 (C-17),15.4 (C-19), 14.1 (C-14′)。。
实施例2
将产自云南省昆明市寻甸的大狼毒全草（Euphorbia jolkinii）3 Kg晒干，粉碎至80目，用90%的工业甲醇在60℃下超声提取7次，每次80分钟，浓缩甲醇溶液得到浸膏0.25Kg。
把浸膏倒入分液漏斗，加水0.6 L，搅拌均匀后加入0.6 L二氯甲烷，震荡，然后充分静置，等待水和有机溶剂分层后抽出二氯甲烷，反复该过程3次，合并二氯甲烷萃取溶液，减压蒸馏后得到大狼毒浸膏0.12 Kg。把190mL二氯甲烷加入浸膏后溶解浸膏，再加入0.3Kg的硅胶（80-100目）搅拌均匀，在室温下干燥。称取6 Kg硅胶（100-200目）安装硅胶柱色谱，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到A-E一共5个组分。其中组分A主要由石油醚/乙酸乙酯1:0制备，B主要由石油醚/乙酸乙酯9:1和7:1制备，C主要由石油醚/乙酸乙酯4:1制备，D主要由石油醚/乙酸乙酯2:1制备，E由石油醚/乙酸乙酯1:1和0:1制备。取组分B（38 g）用制备高效液相色谱分离纯化组分，制备色谱柱参数：30×250 mm，5μm的月旭 Ultimate XB-C18，DAD检测器波长为204 nm、210 nm、254nm和306 nm，流速为15-40 mL/min，进样量为0.5 -3.0 mL。化合物1-3均从组分B中分离得到，其中，化合物1是采用93%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为8.6min时所对应的洗脱液，蒸干后得到203 mg 纯度为99%的ingenol-20-dodecanoate；化合物2是采用93%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为27.5 min时所对应的洗脱液，蒸干后得到381.0 mg纯度为99%的ingenol-20-palmitate；化合物3是采用93%甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为18.9min时所对应的洗脱液，蒸干后得到248.0 mg纯度为99%的ingenol-20-pentadecanoate。
实验例1
将实施例1制备的ingenol-20-dodecanoate、ingenol-20-palmitate和ingenol-20-pentadecanoate使用MTS法进行体外抗癌活性检测，MTS法检测细胞活性原理：MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜（Formazan）化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm 处进行测定。通常，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
1、实验方法
(1)培养和接种细胞：
接种的肿瘤细胞为人类黑色素瘤细胞系A2058和人结肠癌细胞系SW480。细胞由中国科学院昆明植物研究所天然药物活性筛选中心提供。
用含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基配置培养液，把A2058和SW480细胞置于培养液中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。当细胞长满培养皿底部之后去除培养液，用少量的PBS（磷酸盐缓冲液）洗去残留的培养基，加入少量0.25%的胰蛋白酶消化3分钟，加入对应的培养基终止消化，去除上清液，更换培养液，重悬均有后取对数生长期的细胞用于实验。
以每孔3000~15000个细胞把上述2种细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，细胞提前12~24小时接种培养。
(2)加入待测化合物溶液：化合物1-3分别用DMSO溶解，以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度筛选活性，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔（MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液），继续孵育2~4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
(3)显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞HL-60弃100μL培养上清液，每孔加20μl的MTS溶液；设3个空白复孔（MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液），继续孵育2~4小时，使反应充分进行。
(4)比色：选择492 nm波长，多功能酶标仪（MULTISKAN FC）读取各孔光吸收值，以抗癌药物顺铂（DDP）为阳性对照化合物，用两点法（Reed and Muench法）计算化合物的IC50值。
2、实验结果：
实验结果（表1）表明，化合物1-3对A2058细胞系均有很强的细胞毒活性，均强于抗癌药顺铂，所有化合物的活性为顺铂的5倍以上；化合物2和3对SW480的活性均强于顺铂，约为顺铂活性的1.7倍。由此可知，化合物1-3是具有很强抗癌活性的化合物, 在抗皮肤癌和抗结肠癌等药物研究领域开发有很好的应用前景。
表1 三种二萜化合物对肿瘤细胞的IC50
实验例2 抗炎活性检测
1、实验方法：
(1)培养细胞：
把RAW 264.7 细胞用含 10% FBS的 RPMI-1640 培养基培育，加入青霉素（终浓度为 100 U/mL）和链霉素（终浓度为 100μg/mL），在37℃的温度下，含有5% 浓度的CO2的培养箱中培养。当细胞融合到90%时，去除培养基，加入2 mL的 PBS洗涤细胞2次，去除 PBS后再加入 2 mL 的 0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA 混合消化液，在显微镜下观察约，当细胞变圆后迅速加入 2 mL 完全培养基终止消化，在4℃的温度下用离心机以转速 800 r/min的转速离心5 min，去除上清液后收集细胞，用培养基重新悬浮细胞，分瓶培养，隔天后换液。
(2)化合物1、2和3处理RAW264.7细胞：
将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞接种至96孔板，浓度为2×104个细胞/孔，用1μg/mL LPS进行诱导刺激，把从实施例1中得到的三个二萜化合物配制为浓度分别为50μΜ、25μΜ、12.5μΜ、6.25μΜ、3.13μΜ、1.56μΜ、0.78μΜ的溶液分别处理RAW264.7细胞，设置不含药物组和L-NMMA阳性药物组做对照。细胞过夜培养后取培养基检测NO生成，在570 nm处测定吸光值。IC50按Reed＆Muench法计算。
2、实验结果：
抗炎活性研究表明（表2）。化合物1、2和3均有很强的抗炎活性，且强于阳性对照L-NMMA，均为L-NMMA活性的7.5倍以上。
表2 三种二萜化合物抗炎活性结果
从表2可知，ingenol-20-dodecanoate (1)、ingenol-20-palmitate (2)和ingenol-20-pentadecanoate (3)对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞具有很强的抗炎活性（抑制NO生成活性），它们的活性均强于阳性对照L-NMMA，在抗炎药物研究领域有很好的应用前景。
Claims (9)
1.一种二萜化合物或含有该二萜化合物的药物组合物在制备抗癌药物或抗炎药物中的应用，其特征在于，所述二萜化合物具有式1、式2和式3所示的结构：
。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗癌药物为用于治疗皮肤癌的药物。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗癌药物为用于治疗结肠癌的药物。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、口服液、***片、 颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
5.权利要求1所述二萜化合物的制备方法，其特征在于，具体按以下步骤实现：
(1) 有机溶剂加热超声提取：将大狼毒全草晒干，粉碎至30-90目，在55℃-60℃下用第一有机溶剂浸泡后超声提取5-7次，每次60-80分钟，合并提取液，浓缩后得到浸膏a；
(2) 有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量2-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3-4次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到浸膏b；
(3) 正相色谱法分离：将所述浸膏b 用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱得到组分A-E；
(4) 制备HPLC纯化：将组分B经制备HPLC分离纯化，即得化合物1、化合物2和化合物3。
6.根据权利要求5所述两种三萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，第一有机溶剂为85%-99%的乙醇或85%-99%的甲醇。
7.根据权利要求5所述三种二萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，第二有机溶剂为85%-99%的二氯甲烷或85%-99%的乙酸乙酯。
8.根据权利要求5所述三种二萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，所述制备HPLC采用的流动相是45%-98%的甲醇/水溶液或34%-85%的乙腈/水溶液，制备柱是30×250 mm，5 μm的月旭 Ultimate XB-C18，DAD检测器波长为204 nm、210 nm、254 nm和306 nm，流速为15-40 mL/min，进样量为0.5 -3.0 mL。
9.根据权利要求5所述三种二萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，硅胶柱的装柱方法如下：将浸膏b用85%-99%的二氯甲烷搅拌均匀，加入样品量1-3倍量的80-100目的硅胶晾干，用样品量12-69倍的100-200目的硅胶安装色谱柱。
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| CN202310751122.3A CN116785274A (zh) | 2023-06-25 | 2023-06-25 | 大狼毒中具有强抗皮肤癌和抗炎活性的二萜化合物的制备方法和应用 |
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2023
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