CN116769667B - 一种特基拉芽孢杆菌k3-11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特基拉芽孢杆菌K3‑11及其应用。所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3‑11已于2023年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：63276。利用K3‑11菌株或其发酵液对于对茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌病原菌具有良好的拮抗效果，用于防控所述病原菌引起植物病害，防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防控技术领域，具体地，涉及一种特基拉芽孢杆菌K3-11及其应用。
背景技术
青枯病是一种由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的毁灭性土传病害。可侵染50多科450余种植物并导致毁灭性枯萎，发病植物茎叶萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上分布最广、危害最严重的十大植物病原细菌之一。至今尚没有有效的化学农药和其他防治办法。因此青枯病被称为植物的“癌症”。植物青枯菌是桑树、番茄、茄子、马铃薯、花生、烟草、辣椒、生姜、草莓、香蕉以及一些贵重药材和花卉植物许多植物生产的重要限制因素，世界各地均有分布。青枯病菌是一个复杂的群体，有明显的生理分化，不同地区和不同寄主来源的菌株，在寄主范围、致病力、生化型、血清型等细菌学特性上差异很大。我国具有微生物资源优势，利用细菌病毒防治植物青枯病害有着美好的前景。
桑树青枯病(Mulberry bacterial wilt)是三大桑树细菌性病害之一，该病发病快、蔓延迅速，严重影响了桑的产量和质量，对浙江及华南各省(区)蚕桑生产造成了严重损失。桑青枯病是青枯病原细菌侵染桑根系木质部导管，影响水分运输，致使叶片失水、桑树死亡的一种维管束病害。该病来势猛、蔓延快，是一种对桑树具有毁灭性的土传植物检疫性病害，可引起新种桑或成林桑当年死亡。
青枯病目前主要采用化学药剂达到缓和病害的目的，化学农药具有见效快的优势，对病情可快速得到缓解，但大规模使用使土壤环境恶化，病原的耐药性增强，不能根本上解决问题，所以寻找一种更有效、长久、安全的防治方法迫在眉睫。且田间植物往往感染多种病原菌，病情复杂，目前的生防菌所能拮抗的病原菌种类较少，难以实现对多种植物病害的防治，不能有效恢复植物的正常生长。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种防治多种病原菌的特基拉芽孢杆菌K3-11及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11和/或其发酵产物。
本发明的第二个目的是提供所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11的应用。
本发明的第三个目的是提供一种生防制剂。
本发明的第四个目的是提供所述生防制剂在防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述生防制剂在抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种的方法。
本发明的第七个目的是提供一种抑制茄科劳尔氏菌、水稻基细菌性腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11和/或其发酵产物，所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11已于2023年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址： 广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏号为GDMCC No：63276。
本发明请求保护所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11在以下中的任意一项或几种中的应用：
防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种；
制备防控桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种的制剂；
抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种；
制备抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种的制剂。
进一步地，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
基于此，本发明请求保护一种生防制剂，所述生防制剂中包含所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11和/或其发酵产物。
进一步地，本发明还请求保护所述的生防制剂在防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病中任意一种或几种中的应用。
进一步地，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
进一步地，本发明还请求保护所述的生防制剂在抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种中的应用。
本发明还提供一种防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种的方法，用所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)K3-11和/或其发酵产物进行防治。
进一步地，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
本发明还提供一种抑制茄科劳尔氏菌、水稻基细菌性腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种的方法，用所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11和/或其发酵产物进行抑制。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明分离鉴定出了对多种植物青枯病的病原具有良好的拮抗和防控效果的拮抗菌——特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11。利用K3-11菌株或其发酵液对于对茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌病原菌具有良好的拮抗效果，用于防控所述病原菌引起植物病害，防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病，安全有效，能够避免化学农药带来的土壤环境恶化，病原的耐药性增强等各种问题，为植物病害的生物防治奠定了基础，有很好的应用前景，值得大力推广。
附图说明
图1为K-11菌株发酵液对茄科劳尔氏菌的抑菌作用图。其中A为广西象州分离的桑树青枯病病原菌茄科劳尔氏菌菌株；B为番茄青枯病病原茄科劳尔氏菌菌株A；C为番茄青枯病病原茄科劳尔氏菌菌株B。图中a为：无菌LB肉汤；b、c、d为：K3-11菌株发酵液。
图2为K3-11菌株在NA培养基平板上的菌落形态特征图。其中A为生长1d的菌落；B为生长3d的菌落；C为生长5d的菌落；D为生长7d的菌落。
图3为K3-11菌株的革兰氏染色结果图。其中A为革兰氏染色下的菌体观察，B为革兰氏染色下的芽孢观察。
图4为K3-11菌株的扫描电镜观察结果。其中A为K3-11菌株的扫描电镜(49991×)结果图，B为K3-11菌株的扫描电镜(80011×)结果图。
图5为基于16SrRNA基因构建的K3-11菌株的***进化树。
图6为K3-11菌株对茄科劳尔氏菌导致的桑树青枯病的生物防治实验。其中A为对照组，B为生物防治组。
图7为K-11菌株发酵液对其他菌株的拮抗效果。其中A为茄子青枯病病原菌茄科劳尔氏菌；B为水稻细菌性基腐病菌；C为桑树枯萎病病原菌菠萝泛菌。图中a为：无菌LB肉汤；b、c、d为：K3-11菌株发酵液。
图8为K-11菌株发酵液对其他菌株的拮抗效果。其中A为克雷伯氏菌A；B为另一株克雷伯氏菌B；C为阴沟肠杆菌。图中a为：无菌LB肉汤；b、c、d为：K3-11菌株发酵液。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
样本采集：于广东省广州市华南农业大学桑树园采集不发病桑树根际土壤，带回实验室4℃保存备用。
主要试剂：细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂、蛋白酶K等试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
主要培养基：LB培养基(NA)、生理生化培养基、LB肉汤均购于广东环凯微生物科技有限公司。
实施例1桑树根际土壤拮抗菌的分离
一、实验方法
1、桑树根际土壤细菌的分离纯化
取新采集的桑树根际土壤，称取10g根际土壤样本，加入90mL无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分震荡30min，即制成桑树根际土壤的母液菌悬液(基础液)。用无菌移液器分别吸取0.1mL上述母液菌悬液，加入到0.9mL的无菌水中，如此进行系列稀释，分别得到10、101、102、103、104、105和106稀释度的菌悬液。用移液器分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先准备好的LB培养基平板上，分别用无菌玻璃涂布棒将不同稀释度的菌悬液均匀的涂布于LB培养基平板表面，每个稀释度重复涂板3次。用封口膜封好后置于37℃培养箱培养，待培养基上面长出单个菌落后，即得已纯化的单菌落。
2、菌株发酵液的制备
挑取上述已纯化的单菌落在LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇床振荡培养3d，得菌株发酵液，所述发酵液中含有菌株。
3、拮抗菌菌株的筛选
以广西象州分离的桑树青枯病病原菌茄科劳尔氏菌为指示菌，采用琼脂扩散法测试抑菌活性。将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养至D600约0.5时，得指示菌菌液。将指示菌菌液加入约50℃的无菌LB琼脂培养基内，指示菌菌液与培养基的体积比为1：50，混匀后即得含指示菌的培养基，分装，各培养皿分装20mL含指示菌的培养基。待含指示菌的培养基凝固后，使用打孔器在培养皿中均匀地打上6mm小孔，移取50μL菌株发酵液，加到已打好的小孔中，无菌的LB肉汤作为空白对照，每个平板各做3个重复。加样完成后，放置于37℃的培养箱内培养，24h后检测是否有抑菌圈，并测量其直径大小。筛选得到一株对茄科劳尔氏菌有抑制效果的拮抗菌。
4、拮抗菌对其他茄科劳尔氏菌的拮抗实验
按照步骤3的琼脂扩散法测试分离的拮抗菌对另外2株番茄青枯病病原菌茄科劳尔式菌(A和B)的作用。
二、实验结果
本发明通过筛选得到了一株对指示菌桑树青枯病病原菌茄科劳尔氏菌有抑制效果的拮抗菌，进一步地，该菌株对广西象州分离的桑树青枯病病原菌茄科劳尔式菌以及2株番茄青枯病病原菌茄科劳尔式菌都有拮抗作用，将该拮抗菌菌株命名为K3-11，其拮抗作用见表1。表明K3-11菌株发酵液适用于桑树青枯病和番茄青枯病的防治。
表1 K3-11菌株拮抗作用
注：每组数据为三组重复的平均值及标准误差，不同字母表示组间显差异。
K3-11菌株对广西象州分离的桑源茄科劳尔氏菌菌株(图1中A)、2株番茄青枯病病原菌茄科劳尔式菌(图1中B和C)都表现出抑菌作用。
实施例2K3-11菌株的鉴定
一、实验方法
将实施例1的K3-11菌株接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基，28℃培养7d，观察记录菌落形态、生长状况等。革兰氏染色、形态观察及生化试验等相关理化参数的测定参照《常见细菌***鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》。
对K3-11菌株进行16SrRNA基因测序，将得到的16SrRNA基因与从NCBI上下载目标物种近缘物种的16SrRNA基因序列采用Mega11软件进行多序列比对，比对后的序列再用邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建***发育树，Bootstrap值设置为1000。
二、实验结果
如图2中A～D所示，K3-11菌株在NA培养基平板上生长良好，生长第3d的平均直径为5mm～8mm，菌落呈黄白色，表明粗糙，大小不一，边缘不整齐。
生理性状测定结果如表2所示。K3-11菌株能利用葡萄糖、蔗糖和***糖，能还原硝酸盐。
表2 K3-11菌株的生理生化特征
如图3中A所示，为K3-11菌株革兰氏染色下的菌体观察；如图3中B所示，为K3-11菌株革兰氏染色下的芽孢观察。表明K3-11菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌。
如图4中A和图4中B所示，电镜观察K3-11菌株为杆状菌，两端钝圆，大小2000nm～3000nm×200nm～500nm，表面光滑。
如图5所示，16SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，以K3-11菌株的16SrRNA基因构建***发育树，结果显示K3-11与特基拉芽孢杆菌BE-1A的遗传进化距离最近，序列相似性为99.04％，K3-11菌株与特基拉芽孢杆菌处于同一***发育树进化枝，因此将K3-11菌株鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，将该菌株命名为：特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11，并于2023年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCC No：63276，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3 K3-11菌株的盆栽防治实验
一、实验方法
盆栽试验所用土壤为德国K牌大汉泥炭土，主要成分为白泥炭，商家检测无虫卵、无杂菌、无草种、无重金属也无化学肥料，pH为5.5～6.0；桑树品种选用感病品种“桂桑6”。
将实施例1中使用的广西象山分离的桑树青枯病病原茄科劳尔氏菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜，即得桑树青枯病病原茄科劳尔氏菌菌液，稀释后得到浓度为108CFU/mL的茄科劳尔氏菌菌液待用。
取12株长势相同的桑苗平均分为A、B两组，先进行伤根处理后，A组施加清水作为空白对照组，B组施加实施例1和2筛选鉴定的K3-11菌株的发酵液作为处理组(制备方法见实施例1)，浓度为108CFU/mL，施加100mL。
上述清水和发酵液处理的桑苗，置于人工气候箱培养3d后，施加10mL浓度为108CFU/mL的茄科劳尔氏菌菌液进行回接实验，随后A组继续施加清水作为空白对照组，B组继续施加K3-11菌株的发酵液作为处理组，每组设置6个重复。继续培养7d后，统计患病植株的数量。
二、实验结果
如图6中A所示，在A组出现明显的青枯现象(100％)，如图6中B所示，B组桑树均长势正常，显示K3-11菌株通过抑制茄科劳尔氏菌，防治青枯病害发生，显示本发明分离得到的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)K3-11施用于桑树植株上，也具有很好的防控效果，防治由茄科劳尔氏菌导致的桑青枯病。
实施例4 K3-11菌株对其他菌株的拮抗效果
一、实验方法
按照实施例1的方法，用琼脂扩散法检测K3-11菌株对其他菌株的拮抗活性。供试菌株分别为茄子青枯病病原菌茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌、桑枯萎病病原菌菠萝泛菌、2株克雷伯氏菌(A和B)和阴沟肠杆菌。
二、实验结果
如图7所示，K3-11菌株对茄子青枯病病原菌茄科劳尔氏菌菌株(图7中A)、水稻细菌性基腐病菌(图7中B)、桑树枯萎病病原菠萝泛菌(图7中C)都有拮抗效果，表明K3-11菌株发酵液适用于茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病的防治。如图8所示，K3-11菌株对克雷伯氏菌(图8中A和图8中B)和阴沟肠杆菌(图8中C)没有拮抗效果，抑菌圈情况见表3。
表3 K3-11菌株对其他菌株的拮抗作用
注：每组数据为三组重复的平均值及标准误差，不同字母表示组间显差异。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11已于2023年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：63276。
2.权利要求1中所述特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11在以下中的任意一项或几种中的应用：
防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种；
制备防控桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种的制剂；
抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种；
制备抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
4.一种生防制剂，其特征在于，所述生防制剂中包含权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11和/或其发酵产物。
5.权利要求4所述的生防制剂在防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病和桑树枯萎病中任意一种或几种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
7.权利要求4所述的生防制剂在抑制茄科劳尔氏菌、水稻细菌性基腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种中的应用。
8.一种防治桑树青枯病、番茄青枯病、茄子青枯病、水稻细菌性基腐病、桑树枯萎病中任意一种或几种的方法，其特征在于，用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11和/或其发酵产物进行防治。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述桑树青枯病、番茄青枯病或茄子青枯病由茄科劳尔氏菌引起，所述水稻细菌性基腐病由水稻细菌性基腐病菌引起，所诉桑树枯萎病由菠萝泛菌引起。
10.一种抑制茄科劳尔氏菌、水稻基细菌性腐病菌和菠萝泛菌中任意一种或几种的方法，其特征在于，用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）K3-11和/或其发酵产物进行抑制。
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