CN116751270A - 提高植物耐盐性的方法及其所用蛋白质与相关生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高植物耐盐性的方法及其所用蛋白质与相关生物材料。本发明提高植物耐盐性的方法，包括如下步骤：增强受体植物中蛋白质RIP1的表达，得到耐盐性高于所述受体植物的目的植物。导入RIP1基因的拟南芥突变体的盐胁迫实验证明，增强RIP1基因的表达，能提高耐盐性，可耐受浓度高达450mM的NaCl盐胁迫。因此，通过合理利用RIP1基因可以调控耐盐性，有助于盐碱地资源的有效利用。

Description

提高植物耐盐性的方法及其所用蛋白质与相关生物材料
技术领域
本发明涉及生物技术领域中提高植物耐盐性的方法及其所用蛋白质与相关生物材料。
背景技术
盐胁迫是植物生长和产量的主要限制性因素之一，可引起植物体内一系列的生理和代谢反应，从而造成植物减产甚至死亡。土壤盐渍化造成的耕地资源破坏、农业生产损失，已成为世界性的生态问题。由于大多数植物尤其是农作物对盐胁迫敏感，因此土壤盐渍化已经成为限制全球农业生产力的重要因素。而实践证明，改良盐渍土是一项复杂、难度大、用时长的工作，故揭示植物应对盐胁迫的机制，并据此提高植物的耐盐能力，已经成为促进农业生产的重要基础。
植物耐盐的复杂性使得利用传统育种的方法来提高作物耐盐能力十分困难，近几年的研究表明，植物的耐盐性复杂并涉及细胞适应的多重机制以及多种代谢途径，植物要达到离子平衡，必须要进行三方面相互联系的调节，首先必须防止植物受到毒害，其次植物在逆境下要重建一个平衡的体内环境，最后生长必须可以恢复。因而使用生物技术方法从遗传上设计耐盐作物成为当前农业领域的研究热点。
已有许多与植物耐盐相关的基因被克隆研究，包括编码各种有机溶质合成酶的基因：如参与脯氨酸合成的P5cs基因、与甜菜碱合成有关的基因、与甘露醇合成有关的基因；LEA蛋白基因；具有抗氧化胁迫作用的过氧化酶基因等，但大多需要与其它多个耐盐基因共同作用才可能获得较为理想的耐盐效果。需要从不同种类的植物中有目的地克隆其它不影响植物正常生长的耐盐基因，以期获得具有良好耐盐性的作物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗盐碱能力。
为了解决以上技术问题，本发明的目的是提供了一种通过蛋白质RIP1提高植物耐盐性的方法，包括如下步骤：增强受体植物中蛋白质RIP1的表达，得到耐盐性高于所述受体植物的目的植物；所述蛋白质RIP1是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:2的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性、来源于高粱且具有相同活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述方法中，序列表中的SEQ ID No:2由126个氨基酸残基组成。
上述方法中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述方法中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述方法中，所述增强RIP1蛋白质的表达通过将编码所述蛋白质的核酸分子导入受体植物中实现。
上述方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述的核酸分子可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition)。
上述方法中，所述受体植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为高粱、玉米、水稻或小麦；所述双子叶植物可为拟南芥、大豆或棉花。
本发明还保护上述蛋白质RIP1。
本发明还保护和上述蛋白质RIP1相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码蛋白质RIP1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下b1)-b4)中任一所示的核酸分子：
b1)编码链的编码序列是序列表中SEQ ID NO:1的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中SEQ ID NO:1的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码RIP1蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)-b3)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码RIP1蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中的SEQ ID NO:1由381个核苷酸组成，编码序列表中的SEQ ID NO:2所示的蛋白质。
所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
上述生物材料中，B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒(RIP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RIP1的核酸分子，该核酸分子可包括启动RIP1基因转录的启动子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒(CAMV)的组成型启动子35S；泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。
上述生物材料中，B2)所述的含有所述核酸分子的表达盒还可包括终止RIP1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述RIP1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白质基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因和萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
本发明还保护上述方法在耐盐植物育种中的应用。
本发明还保护上述蛋白质、上述生物材料在耐盐植物育种中的应用或提高植物耐盐性中的应用。
本发明还保护细胞系在耐盐植物育种中的应用或提高植物耐盐性中的应用，所述细胞系为含有所述蛋白质RIP1的核酸分子的转基因植物细胞系。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为高粱、玉米、水稻或小麦；所述双子叶植物可为拟南芥、大豆或棉花。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为提高植物的耐盐性。本发明所提供的植物试剂含有上述蛋白质RIP1和/或上述生物材料。
本发明还提供上述的植物试剂在植物耐盐种植中的应用。
导入RIP1基因的拟南芥突变体的盐胁迫实验证明，增强RIP1基因的表达，能提高耐盐性，可耐受浓度高达450mM的NaCl盐胁迫。因此，通过合理利用RIP1基因可以调控耐盐性，有助于盐碱地资源的有效利用。
附图说明
图1为本发明实施例1中盐胁迫下的高粱组织总RNA电泳图。
图2为本发明实施例1中盐胁迫下高粱cDNA文库片段的重组表达载体SQKJ-Sb构建流程图。
图3为本发明实施例1中盐胁迫下高粱文库质粒中cDNA***片段的PCR扩增后的电泳图。
图4为本发明实施例2中盐胁迫下高粱文库质粒转化拟南芥的转基因阳性苗。
图5为本发明实施例3中盐胁迫下转入RIP1基因的拟南芥植株在文库筛选时的耐盐效果图。
图6为本发明实施例4中盐胁迫下转入RIP1基因的拟南芥植株在初步验证时的耐盐效果图。
图7为本发明实施例4中盐胁迫下转入RIP1基因的拟南芥植株在再次验证时的耐盐效果图。
图8为本发明实施例5中转基因拟南芥植株中外源***片段的PCR扩增后的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1载体与菌株
下述实施例中载体pCAMBIA2300-35S-OCS记载于非专利文献“咸洋等，pCAMBIO2300-betA-BADH双价植物表达载体的构件，中国农学通报，2009，25(09)：47-50.”，公众可以从湖州松泉农业科技有限公司获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中载体SQKJ是在载体pCAMBIA2300-35S-OCS骨架上改造而成，用限制性内切酶XhoⅠ分别酶切载体pCAMBIA2300-35S-OCS和载体pCAMBIA3301(VT1386，优宝生物)，并用载体pCAMBIA3301上的Bar基因片段替换载体pCAMBIA2300-35S-OCS上的NPTⅡ基因片段，构建成新的SQKJ载体。
下述实施例中大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞(货号BTN90504)为百奥莱博公司产品。
下述实施例中农杆菌GV3101感受态细胞(货号Waryong GT707)为北京华越洋生物公司产品。
2植物品系
下述实施例中，高粱品种BTx623记载于非专利文献“Paterson AH,Bowers JE,Bruggmann R,Dubchak I,Grimwood J,Gundlach H,Haberer G,Hellsten U,Mitros T,Poliakov A,Schmutz J,Spannagl M,Tang H,Wang X,Wicker T,Bharti AK,Chapman J,Feltus FA,Gowik U,Grigoriev IV,Lyons E,Maher CA,Martis M,Narechania A,OtillarRP,Penning BW,Salamov AA,Wang Y,Zhang L,Carpita NC,Freeling M,Gingle AR,HashCT,Keller B,Klein P,Kresovich S,McCann MC,Ming R,Peterson DG,Mehboob-ur-Rahman,Ware D,Westhoff P,Mayer KF,Messing J,Rokhsar DS.The Sorghum bicolorgenome and the diversification of grasses.Nature.2009Jan29；457(7229):551-6.doi:10.1038/nature07723.PMID:19189423.”，公众可以从湖州松泉农业科技有限公司获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0亚型，简称野生型拟南芥Col-0，载于非专利文献“Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，LeeM，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses and flowering timethrough FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004，36:167-171”，公众可以从湖州松泉农业科技有限公司获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
3、培养基和平板
下述实施例中LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，用NaOH调pH至7.5。
下述实施例中含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体平板为以含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基制备的平板，所述含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基配方为：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5。
下述实施例中含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基的配方为：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH调pH至7.5。
下述实施例中含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的LB固体平板为以含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基制备的平板，所述含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基的配方为：利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1、高粱全长cDNA文库的构建
取盐处理(高粱通过木村培养液进行水培，木村培养液配方参考Ishikawa etal.BMC Plant Biology 2011,11:172，正常培养三周后，放入350mM NaCl的盐水中水培3h，6h，12h，24h后取样混合提取)过的高粱品种BTx623组织制备其总RNA，总RNA完整性如图1所示，总RNA在260nm/280nm的比值在1.8-2.0之间，纯度较高。然后经过mRNA的分离、脱磷酸基团、脱帽、连接CAP Tag处理后，由纯化的mRNA合成cDNA第一链，进而合成双链DNA，双链DNA经酶切后通过琼脂糖凝胶电泳进行片段的大小分级，按下述片段大小分别割胶回收：2-12kb，1-2kb，0.5-1kb，<0.5kb。
用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ分别酶切割胶回收后的上述片段和表达载体SQKJ，将酶切过的上述基因片段插到表达载体SQKJ的多克隆位点内，利用本领域技术人员所熟知的酶切方法构建载体，构建成重组表达载体SQKJ-Sb混合物，其构建流程如图2所示(图2中，Kanamycin(R)：卡那霉素基因；prCaMV35s：花椰菜病毒启动子(SEQ ID No:3)；Sorghumbicolor：高粱文库基因；OCS：终止子(SEQ ID No:4)；Bar：草铵膦抗性基因(SEQ ID No:5)。
然后将所述重组表达载体SQKJ-Sb混合物用电击方法转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，其电击条件为：50μL大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞、1μL文库质粒DNA(重组表达载体SQKJ-Sb混合物)，在预设程序Ec2(2.5kV，6.0ms)下电击转化后，37℃在LB液体培养基中振荡培养1小时(200rpm转速下摇床摇动)，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体平板上生长过夜。挑取白色克隆，对转化后的重组大肠杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定：
引物1：5′-ccaaccacgtcttcaaagca-3′(如SEQ ID No:6所示)；
引物2：5′-tcatgcgatcataggcgtct-3′(如SEQ ID No:7所示)。
电泳检测cDNA***片段的大小，计算重组克隆子比例，同时进行cDNA5’末端测序，分析文库中全长cDNA的比例。获得的高粱文库的库容量为2×106，文库重组率为96.1％，全长率为95.2％，如图3所示。
实施例2、高粱全长cDNA文库的拟南芥转化
1、全长cDNA文库质粒的提取
刮取实施例1中所有高粱文库菌斑，在500mL含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中于温度37℃条件下培养30min。分小管碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μL冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入200μL新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％ SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒5次，混合，置冰上3-5min；加入150μL冰冷的溶液III(3M醋酸钾，5M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，取适量上清，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；每小管加入50μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用，得到全长cDNA文库质粒。
2、全长cDNA文库质粒农杆菌转化
将步骤1构建好的全长cDNA文库质粒用电击法转化到农杆菌GV3101中，其转化条件为：取1μL全长cDNA文库质粒与50μL农杆菌GV3101感受态细胞混匀，冰上静置5min后转移到预冷的电击杯中，在预设程序Ec2(2.5kV，6.0ms)下电击转化，将转化后的农杆菌GV3101接种于LB液体培养基中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养1小时，涂于含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的LB固体平板上直至长出阳性单克隆。挑取白色克隆，对转化后的重组农杆菌同样用由所述引物1(如SEQ ID No:6所示)和所述引物2(如SEQ ID No:7所示)组成的引物对进行PCR鉴定，并电泳检测cDNA***片段的大小。
3、全长cDNA文库质粒的拟南芥转化
将野生型拟南芥种子悬浮于0.1％(w/v)琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4℃下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。用蛭石混合马粪土并用水灌溉至土壤湿润，使土壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖4天。使种子萌发并在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m2秒的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下培养。开始用霍格兰营养液灌溉植物，接着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。
刮取所有步骤2得到的重组农杆菌菌斑，使用花浸泡法转化拟南芥。浸泡转化后约4周收获种子。
4、转文库基因拟南芥的阳性率检测
经过含有全长cDNA文库质粒的重组农杆菌侵染后的拟南芥种子(T0代种子)中含有大量转基因种子，需通过抗性筛选确定转基因比例，即转基因拟南芥阳性率。经过草铵膦抗性筛选，具有草铵膦抗性的转基因苗能正常生长，不具有草铵膦抗性的野生型苗死亡，统计转基因苗数目，计算阳性率。转基因拟南芥阳性率基本上在2％左右(如图4所示)。
实施例3、高粱全长cDNA文库的拟南芥筛选
为了快速有效地筛选全长cDNA文库里的抗盐拟南芥植株，将实施例2中的T0代拟南芥种子萌发后先在幼苗期进行一次草铵膦抗性筛选，再在抽苔前进行一次盐处理，以期在T0代找到抗盐基因。具体步骤如下：
为了更有效地利用温室和苗盆资源，预计每个苗盆中留存100-150株转基因植株，根据上述拟南芥阳性率在2％左右，计算一盆拟南芥需播种T0代种子5000-7500颗。
将T0代拟南芥种子悬浮于0.1％琼脂糖溶液中并在4℃下保存2天。用蛭石混合马粪土并用水灌溉至土壤湿润，使土壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖4天。使种子萌发并在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m2秒的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下培养。当拟南芥生长到7天时，用稀释比例为1:400的保试达(拜尔公司)溶液进行叶面喷施，使非转基因拟南芥死亡(即进行一次草铵膦抗性筛选)。
待剩下的转基因拟南芥生长到12-14天时，先浇水至饱和，然后停止浇水；待生长到18-20天时开始进行含水量测定，当含水量降到25-45％时对转基因拟南芥进行盐处理，即用浓度为350mM的NaCl浇灌一次。当盐处理7-10天后，目测大部分转基因拟南芥死亡时观测(即进行一次耐盐筛选)。
结果如图5所示，显示转入RIP1基因的拟南芥植株仍然存活，表明其具有一定的耐盐性，将转入RIP1基因的拟南芥转移到正常土壤中生长、收种，得到T1种子(RIP1-T1种子)。
将转入RIP1基因的拟南芥植株转基因所用重组农杆菌记为GV3101/SQKJ-RIP1，该重组菌通过将重组质粒SQKJ-RIP1导入农杆菌GV3101中得到，SQKJ-RIP1为将SQKJ的KpnⅠ和BamHⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID NO:1所示的RIP1基因并保持载体的其他序列不变得到的重组载体，SQKJ-RIP1能表达序列表中SEQ ID NO:2所示的RIP1蛋白质。
实施例4、耐盐基因验证
1、转基因拟南芥耐盐效果的初步验证
将实施例3收获的转入RIP1基因的拟南芥植株的T1种子(RIP1-T1种子)在室温干燥7天，理论上T1代种子中含有3/4的转基因阳性种子，1/4的转基因阴性种子。将所述RIP1-T1种子和野生型种子(CK)悬浮于0.1％琼脂糖溶液并在4℃下保存2天后，播种在同一28cm×55cm的苗盆中，每份材料播种14株，种子萌发后在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m2秒的长日照条件下培养。生长一周后，用稀释比例为1:400的保试达(拜尔公司)溶液进行叶面喷施，使非转基因拟南芥死亡。待剩下的转基因拟南芥生长两周后浇水至饱和，然后停止浇水。停止浇水5天后开始进行含水量测定，当土壤含水量在35％左右时，用浓度为350mM的NaCl水溶液浇灌进行盐处理，盐处理8-10天后观察转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株的T1代植株的表型(如图6所示)。
图6的结果表明：在经过350mM的NaCl水溶液处理后，野生型拟南芥植株大部分发白死亡，而转入RIP1基因的拟南芥植株的T1代植株能正常地抽苔、开花、结实。与野生型拟南芥植株相比，转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株的T1植株的耐盐能力得到明显提高。
采集RUB1-T1植株上自交得到的成熟籽粒即为RIP1-T2种子。
2、耐盐基因的再次验证
为了进一步确定转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株的耐盐程度，分别取各3份所述RIP1-T2种子和野生型种子，每份14株，将所述6份种子按照步骤1中的方法播种在3个苗盆中，每个苗盆包含1份所述RIP1-T2种子和1份野生型种子。待拟南芥生长两周后浇水至饱和，然后停止浇水。停止浇水5天后开始进行含水量测定，当含水量在35％左右时，分别用浓度为250mM、350mM、450mM的NaCl水溶液浇灌，盐处理8-10天后观察转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株的T2代植株的表型(如图7所示)。
图7的结果表明：在经过250mM，350mM和450mM的NaCl水溶液处理后，野生型拟南芥植株大部分发白死亡，而转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株的T2植株均能正常地抽苔、开花、结实。上述结果进一步表明转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株和野生型拟南芥植株相比具有很强的盐胁迫耐受性。
实施例5、耐盐基因序列的获得
利用CTAB法，对验证过具有盐胁迫耐受性的转入RIP1基因(编号为100057)的拟南芥植株进行基因组DNA的提取，作为模版DNA。
用由所述引物1和所述引物2组成的引物对及下述PCR扩增体系从模版DNA中扩增RIP1基因：
PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后进入下列循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min，冷却至室温。
所获得的PCR扩增产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳，分离到长度约为1200bp的目的片段，如图8所示。然后对回收并纯化的PCR产物进行测序并分析，通过测序结果分析获得RIP1基因的核苷酸序列(381个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示，其编码的RIP1蛋白质的氨基酸序列(126个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示。
综上所述，本发明首次从高粱中分离了与耐盐性反应相关的蛋白质RIP1，所述蛋白质特别是对盐胁迫具有耐受性，所述转入编码耐盐蛋白质RIP1的基因的转基因植物可以耐受浓度高达450mM的盐胁迫，其将会对改良、开发利用盐碱地资源、缓解土地压力、增加后备耕地储备、保障粮食安全具有重要意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
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Claims (10)

1.提高植物耐盐性的方法，其特征在于，包括如下步骤：增强受体植物中蛋白质RIP1的表达，得到耐盐性高于所述受体植物的目的植物；所述蛋白质RIP1是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:2的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性、来源于高粱且具有相同活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
3.权利要求1中所述的蛋白质RIP1。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求3所述蛋白质RIP1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下b1)-b4)中任一所示的核酸分子：
b1)编码链的编码序列是序列表中SEQ ID NO:1的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中SEQ ID NO:1的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码RIP1蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)-b3)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码RIP1蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
6.权利要求1-2任一所述的方法在耐盐植物育种中的应用。
7.权利要求3所述的蛋白质RIP1在耐盐植物育种中的应用或提高植物耐盐性中的应用。
8.权利要求4或5所述的生物材料在耐盐植物育种中的应用或提高植物耐盐性中的应用。
9.细胞系在耐盐植物育种中的应用或提高植物耐盐性中的应用，其特征在于，所述细胞系为含有编码权利要求3所述蛋白质RIP1的核酸分子的转基因植物细胞系。
10.根据权利要求6-9任一所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
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