CN116716401A - 生物标志物polq在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用,属于生物检测技术领域,本发明包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估;所述生物样本取自胶质瘤组织,通过生物信息学和实验验证表明POLQ对于诊断肺癌患者预后有着较好的敏感性,且对胶质瘤细胞的恶性生物学行为有重要促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用。
背景技术
胶质瘤是起源于胶质细胞或前体细胞的神经肿瘤,其发病率约占原发性中枢***肿瘤的 30%,在原发恶性脑肿瘤中则约占 75%,因此被认为是最常见的中枢神经***恶性肿瘤。根据肿瘤的病理学特征可将胶质瘤分为I-IV级,I级患者在接受手术后可达痊愈而IV患者五年生存率仅为5%。因此,早期诊断和治疗对于胶质瘤患者至关重要;
生物体在生命活动过程中容易受到来自不同因素的 DNA 损害,包括环境因素与内部因素,环境因素如阳光中的紫外线成分、电离辐射和许多基因毒性化学物质,会导致DNA 结构的改变,如果不修复,可能会导致突变,增加癌症风险。而POLQ的编码产物DNA 聚合酶在生物体内承担着重要的功能包括跨损伤合成(TLS),DNA 双键断修复 (DSB)等任务。近期研究发现POLQ在多种肿瘤组织内出现表达升高的情况,并且介导和参与肿瘤发生和发展中的多种生物学进程。而通过POLQ基因表达量的判断及其表达的干预,能对肿瘤的发现和发展提供新的诊断和治疗方案。然而,目前尚无POLQ在胶质瘤方面的研究。
发明内容
有鉴于此,本发明提供生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用,通过生物信息学和实验验证表明POLQ对于诊断肺癌患者预后有着较好的敏感性,且对胶质瘤细胞的恶性生物学行为有重要促进作用。
生物标志物POLQ在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用,包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估;所述生物样本取自胶质瘤组织。
进一步的,其中所述生物标志物POLQ在NCBI的Gene ID为10721。
进一步的,包括检测所述生物标志物POLQ的DNA含量的试剂。
进一步的,所述试剂为特异性识别POLQ基因的探针。
进一步的,包括检测所述生物标志物POLQ的mRNA含量的试剂。
进一步的,所述试剂为特异性扩增POLQ基因的引物,所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物POLQ表达水平的试剂。
进一步的,包括检测所述生物标志物POLQ的蛋白质含量的试剂。
进一步的,所述试剂为特异性结合POLQ基因编码的蛋白的结合剂。
进一步的,所述胶质瘤为脑胶质瘤。
进一步的,与对照组的生物样本相比,所述生物标志物POLQ在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。
综上所述,本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果:
本发明通过生物信息学数据分析证实在胶质瘤患者的肿瘤组织中,POLQ基因的表达水平显著高于正常。随后利用生物信息学数据,通过生存分析和ROC曲线发现POLQ的表达水平增高对胶质瘤患者总生存期的不利影响,通过单因素和多因素回归分析发现POLQ是胶质瘤患者的独立预后危险因素。进一步的细胞生物学实验证实POLQ表达降低可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。总之,本发明的生物标志物能够有效的判断患者的预后情况。
附图说明
图1为本发明GEO数据分析工具确定POLQ在胶质瘤患者组织中的表达差异结果图;
图2为本发明基于TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库的POLQ生存分析图;
图3为本发明基于TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库的POLQ 预后ROC曲线图;
图4为本发明基于多个数据库单因素和多因素分析确定POLQ是胶质瘤患的独立预后危险因素组合图,其中A:基于TCGA胶质瘤患者的单因素分析;B:基于TCGA胶质瘤患者的多因素分析;C:基于CGGA胶质瘤患者芯片数据的单因素分析;D:基于CGGA胶质瘤患者芯片数据的多因素分析;E:基于CGGA胶质瘤患者测序数据的单因素分析;F: 基于CGGA胶质瘤患者测序数据的多因素分析;
图5为本发明敲减POLQ抑制胶质瘤细胞增殖和迁移能力的示意图,其中A:CCK8实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响;B:克隆形成实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响;C:免疫荧光实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响;D:细胞划痕实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞迁移能力的影响;E:Transwell实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞迁移能力的影响。*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例的附图1-4,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一、以下实施例一至实施例四是通过生物信息学对POLQ标志物的验证。
生物信息学数据来源:GEO、TCGA和CGGA公开数据库;
实施例一
本实施例为明确POLQ在胶质瘤患者中的表达差异。
从上述数据库中获取34个胶质瘤患者和13例正常脑组织样本的基因表达数据及相应的临床数据,两组数据的合集为GSE50161数据集,通过含有34个胶质瘤样本和13例正常脑组织样本的GSE50161数据集,使用R语言的limma包进行差异分析,使用单因素方差分析的方法对数据进行统计学分析;确定POLQ在胶质瘤患者组织中的表达差异,得出其表达差异和预后。
结果表明在胶质瘤的组织中相比于正常组织,log2FC绝对值大于1即POLQ表达量在胶质瘤中的表达量超过正常组织两倍(一般认为log2FC绝对值大于1即表达相差两倍以上有意义),且p<0.05具有统计学差异。
如图1所示,表明POLQ在正常组中表达水平低于肿瘤组。
实施例二
本实施例为明确POLQ对胶质瘤患者预后的影响。
利用多个公共肿瘤数据库的胶质瘤数据中的1668例患者进行预后分析,包括TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据。
首先通过上述三个数据库中,每个库中获取一组,共获取三组胶质瘤患者的转录组数据和临床信息,进行生存分析;
如图2所示,结果发现POLQ在肿瘤中表达量越高,患者可能的生存期就越短,且具有统计学意义。
实施例三
本实施例为明确POLQ对胶质瘤患者预后的诊断价值进行了ROC分析。
通过TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库,每个库中获取一组,共获取三组胶质瘤患者的转录组数据和临床信息,进行ROC分析;
如图3所示,结果显示在一年、三年、五年三个时间点,POLQ的曲线下面积几乎均大于0.7,也就意味着POLQ对胶质瘤患者的预后具有较好的诊断价值。
实施例四
本实施例为明确POLQ是否能作为胶质瘤患者的独立诊断预后因素。
利用TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库患者的临床信息,进行了单因素分析和多因素分析,如图4所示,发现POLQ是三组胶质瘤患者的不良预后独立的一个因素。
二、以下实施例五至实施例九是通过实验对POLQ标志物的验证。
实验细胞及培养基:胶质瘤细胞LN229,培养基:GIBICO DMEM高糖,血清:GIBICO南美胎牛血清。
敲除手段:小干扰RNA(siRNA),有时称为短干扰RNA或沉默RNA,是一类双链RNA分子,它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA,从而防止翻译。
在以下实施例当中,我们使用POLQ-siRNA敲减POLQ在胶质瘤细胞LN229中的表达水平,从细胞生物学水平证实POLQ对胶质瘤发生和发展的作用。
细胞培养:
日常细胞培养的步骤为:从37℃恒温孵箱中取出前述细胞系,置于已经经过至少30分钟紫外消毒的超净台中,用1ml移液枪吸出直径6cm细胞培养皿中残存的培养基,并用无菌PBS 1ml清洗两到三次随后弃去PBS,用5ml移液枪加入4-5ml新的含10%血清的对应培养基,然后放入37℃恒温孵箱继续培养。
细胞转染:
(1)将细胞接种于细胞培养6孔板中;转染时细胞密度约为40%。
(2)按照试剂说明书制备20pmol/μL siRNA。
(3)准备两个EP管,分别标记为siRNA和siMate;
(4)对于6孔板,向标有siRNA的EP中加入94ul的无血清培养基,并分别加入对应的siRNA稀释液6ul;向标有siMate的管子里添加93.5μl无血清培养液和6.5μl的转染试剂;室温静置5分钟。
(5)将siMate管中的混合试剂转移至siRNA管中,并使用移液器轻轻吹打混匀,室温静置15-20分钟,制成完全转染体系。
(6)弃掉6孔板中原有的培养液,使用PBS轻柔浸洗,重复2-3遍后,每孔加入1.8mL无血清培养液。
(7)6孔板中每孔加200μl 转染体系液体;随即转入培养箱。
(8)4h后向各孔中加入等体积含有血清的培养基,12-24h换成完全培养基。
实施例五
CCK8实验:
(1)将转染后的LN229细胞种到96孔板;1000个细胞/孔。
(2)将96孔板转至细胞培养箱中培养。
(3)分别在0h、12h、24h、48h、72h和96h时,弃掉原培养基,向每个孔中加入90μL无血清培养基,再加入10μL CCK8溶液(Solarbio,China),在37℃下继续培养4小时。
(4)终止培养,在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值。
(5)结果如图5A所示,敲减 POLQ后229 细胞的增殖能力显著下降
实施例六
克隆形成实验
(1)将转染过的LN229细胞接种于6孔板中,每孔细胞数量控制在200个左右。
(2)将6孔板转细胞培养孵箱中进行培养10天。
(3)10天后向6孔板中加入4%多聚甲醛固定细胞集落30分钟。
(4)吸去多聚甲醛并加入1%结晶紫染色5分钟。
(5)弃掉结晶紫溶液并漂洗。
(6)观察集落并拍照,ImageJ计数。
(7)结果如图5B所示,敲减 POLQ 后229 细胞的单细胞克隆形成能力显著下降。
实施例七
免疫荧光实验
(1)当转染后的LN229细胞密度在培养瓶的85%左右时,用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打,使之成单细胞悬液,计数。
(2)12孔板放细胞爬片,合适的细胞密度接种细胞。
(3)3、24小时或者48小时后,根据细胞生长速度快慢,观察判断细胞密度,约90%时进行细胞免疫荧光。
(4)弃掉原培养基,PBS溶液轻柔浸洗5分钟,重复3次。
(5)向孔内加入4%多聚甲醛1ml,室温固定细胞20分钟。
(6)弃掉多聚甲醛,PBS溶液轻柔浸洗5分钟,重复3次。
(7)孔内加入0.5%曲拉通打孔半小时。
(8)弃除曲拉通,PBS洗5分钟,洗3次。
(9)用10%的与二抗同源的山羊血清封闭细胞爬片2小时。
(10)弃掉封闭液,向每孔添加根据说明书配制的一抗,放进湿盒,在4℃冰箱中反应一晚上。
(11)吸去一抗,PBS溶液轻柔浸洗5分钟,重复3次。
(12)向孔内加入根据说明书配制的二抗,在黑暗环境下室温反应1小时。
(13)吸去二抗,PBS溶液轻柔浸洗5分钟,重复3次。
(14)向玻片上滴加DAPI;避光孵育5-10min。
(15)用PBS溶液洗去DAPI,每次5分钟,洗3次。
(16)取出爬片后用吸水纸吸干爬片上的液体,然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,最后在荧光显微镜下观察并采集图像,注意选择抗体对应的激发光源。
(17)结果如图5C所示,敲减 POLQ 后229 细胞的增殖能力显著下降。
实施例八
细胞划痕实验
(1)将消化重悬转染后的LN229细胞接种于6孔板中培养。
(2)当细胞密度为90%-100%时,使用200μl的无菌枪头在培养板中用力“一”字划开;PBS洗去漂起细胞,重复三次后0h照相。
(3)添加部分不含血清的普通培养基,放进细胞培养箱中。
(4)24h和48h后弃培养液,PBS清洗后镜下照相。
(5)结果如图5D所示,敲减 POLQ 后229 细胞的迁移能力显著下降。
实施例九
Transwell迁移实验
(1)24孔板内提前放置Transwell小室,24孔板加入500μL的无血清培养基。
(2)各组LN229细胞培养密度达到80%后进行消化,制备无血清细胞悬液。
(3)每个小室加入3.0x105个细胞,缓慢接种至Transwell小室的上室中。
(4)每个下室中加入含20%胎牛血清的完全培养基,不要产生气泡。
(5)在细胞培养箱中继续培养24 h后,去除完全培养基,加入PBS溶液清洗3次。
再向每孔中加入500μL的4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,加入PBS溶液清洗3次,风干聚碳酸脂膜。
(6)再向每孔中加入500μL的0.5%结晶紫溶液进行染色1h,加入PBS溶液清洗。
(7)室温干燥后放置在显微镜下,随机选取五个视野进行观察并拍摄。
(8)结果如图5E所示,敲减 POLQ 后229 细胞的迁移能力显著下降。
本发明通过生物信息学数据分析证实在胶质瘤患者的肿瘤组织中,POLQ基因的表达水平显著高于正常。
随后利用生物信息学数据,通过生存分析和ROC曲线发现POLQ的表达水平增高对胶质瘤患者总生存期的不利影响,通过单因素和多因素回归分析发现POLQ是胶质瘤患者的独立预后危险因素。
进一步的细胞生物学实验证明POLQ表达降低可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。
总之,本发明的生物标志物能够有效的判断患者的预后情况。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.生物标志物POLQ在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用,包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估;所述生物样本取自胶质瘤组织。
2.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,其中所述生物标志物POLQ在NCBI的Gene ID为10721。
3.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,包括检测所述生物标志物POLQ的DNA含量的试剂。
4.如权利要求3所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,所述试剂为特异性识别POLQ基因的探针。
5.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,包括检测所述生物标志物POLQ的mRNA含量的试剂。
6.如权利要求5所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,所述试剂为特异性扩增POLQ基因的引物,所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物POLQ表达水平的试剂。
7.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,包括检测所述生物标志物POLQ的蛋白质含量的试剂。
8.如权利要求7所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,所述试剂为特异性结合POLQ基因编码的蛋白的结合剂。
9.如权利要求1~8所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,所述胶质瘤为脑胶质瘤。
10.如权利要求9所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用,与对照组的生物样本相比,所述生物标志物POLQ在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。
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