CN113774147A - m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，属于生物医学技术领域。本发明通过m6A RNA甲基化测序，以及对m6A RNA甲基化位点进行可视化分析，发现本发明展示的衰老细胞和年轻细胞的m6A RNA甲基化基序既有保守共有序列，又有其特异序列。这些特征可用于区分并鉴定不同程度衰老的细胞，也可用于鉴定外界不同应激诱发的细胞衰老的程度，可解决目前在衰老领域诊断标志物的欠缺问题，为细胞衰老及年龄相关疾患的早期诊断和早期预防提供参考依据。

Description

m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用。

背景技术

细胞衰老是器官和机体衰老的重要基础。衰老是机体各组织、器官功能随年龄增长而呈现退行性变化的过程，会降低机体维持动态平衡的能力，增加患病和死亡的机会，亦是很多年龄相关疾病的危险因素，如高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化及神经退行性疾病等，清除衰老细胞可以有效缓解人体衰老及其相关疾病。细胞衰老是体内外因素共同作用的结果，如环境污染、遗传因素及个人行为等等。氧化还原信号在细胞生命周期中发挥重要作用，与维持生理稳态有关，但体内氧化还原不平衡导致活性氧增多或清除减少，会使细胞内生物分子功能受损，从而导致细胞功能受损和细胞衰老。

细胞衰老是细胞的一种重要结局，也是预防肿瘤发生的有效屏障，能够阻止细胞重新进入细胞周期，避免细胞的恶性转化，防止细胞受到不必要损害的一种防御机制，但同时细胞衰老也是许多年龄相关疾病发生的内在原因。根据机体和细胞的不同情况调节细胞的结局能够很好延缓寿命，提高健康寿命年，这也是目前科研人员正在积极探索的问题。

表观遗传修饰参与调控细胞和机体衰老的进程，在不改变DNA序列的前提下通过调节转录后水平而引起表型或基因表达的改变，在衰老的发生发展的演变过程中发挥着重要的作用。RNA甲基化是表观遗传学的重要新机制之一，其中mRNA的N6-甲基腺苷(m6A)的RNA甲基化是较为常见的一种修饰方式。

m6A RNA甲基化参与RNA生命周期的各个阶段。有研究表明，m6A修饰能调节细胞和机体早衰，调节m6A修饰的RNA甲基转移酶METTL3的下调能减少m6A修饰，敲除METTL3基因后人间质干细胞出现过早衰老表现，主要机制是由于METTL3调节MIS12 mRNA的m6A修饰，阻止人间质干细胞加速衰老。近年来，RNA甲基化修饰的表观遗传改变研究，为鉴定衰老细胞提供了更为精确的评价方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用。

进一步地，所述的m6A RNA甲基化基序包括如下三组基序：

A组：用于鉴定年轻细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：CUGGA，GUGGA，UUGGA，AGCAG，AGCAC，CUUCCU，CUACCU；

B组：用于鉴定复制性衰老细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：AGAGCA，AGAGCG，GCAGC，ACAGC，UCAGC，UGGAA，UGGAC；

C组：用于鉴定早衰细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：GGAGGA，GGUGGA，CGAGGA，CGUGGA，GAGAUCG，AAGAUCG，CAGCAGC，CAGCACC，GAAGA，CAAGA，CUGUA，AUGUA。

进一步地，所述细胞衰老诊断试剂盒是通过分析细胞中m6ARNA甲基化图谱，从而诊断细胞衰老情况，即，

1)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有A组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为年轻细胞；

2)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有B组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为复制性衰老细胞；

3)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有C组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为早衰细胞。

进一步地，所述的年轻细胞的定义为：群体倍增水平PDL小于或等于其寿命的50％的细胞；

所述的复制性衰老细胞的定义为：群体倍增水平PDL大于或等于其寿命的90％的细胞；

所述的早衰细胞为年轻细胞应激诱导的衰老细胞，应激因素包括但不限于氧化应激。

其中，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

进一步地，所述的细胞衰老情况通过以下步骤诊断：

(1)提取待测细胞总RNA；

(2)RNA甲基化免疫共沉淀法(MeRIP)富集m6A RNA甲基化片段，洗脱，纯化，得到待测样品；

(3)取待测样品进行m6A RNA甲基化测序，获得m6ARNA甲基化图谱，根据图谱所显示的m6A RNA甲基化基序类型，诊断细胞衰老情况。

进一步地，所述的衰老诊断试剂盒中含有RNA提取试剂，m6A RNA甲基化片段富集试剂，以及m6A RNA甲基化测序和分析试剂中的一种或多种组合。

所述细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞；优选为人胚肺成纤维细胞。

本发明相较于现有技术具有如下的优点和有益效果：

本发明利用人胚肺成纤维细胞作为细胞衰老的模型。人胚肺成纤维细胞对外源H₂O₂的抵抗力低于子宫内膜干细胞和真皮成纤维细胞，更容易受氧化应激影响，并且其衰老特征的形成过程已经明确定义。因此，人胚肺成纤维细胞为研究衰老相关的潜在机制和标志物提供了有用的实验模型。

本发明基于人胚肺成纤维细胞建立了复制性衰老模型及过氧化氢诱导的早衰模型。所述模型是评价细胞早衰和细胞复制性衰老有力的工具。细胞内尤其是线粒体内ROS(活性氧)的含量是评价细胞衰老的新的方法。本发明发现人胚肺成纤维细胞早衰和复制性衰老中，细胞内总的ROS的含量均高于年轻细胞组。随着代龄的增加，线粒体内mtROS的含量也逐渐增加。利用各组细胞内总ROS(活性氧)和线粒体内ROS的含量，可以明确区分细胞早衰和复制性衰老。

在此基础上，本发明通过m6A RNA甲基化测序，以及对m6A RNA甲基化位点进行可视化分析，发现本发明展示的衰老细胞和年轻细胞的m6A RNA甲基化基序既有保守序列，又有特有序列。这些特征可用于区分并鉴定不同程度衰老的细胞，也可用于鉴定外界氧化刺激诱发的细胞衰老的程度，可解决目前在衰老领域诊断标志物的欠缺问题，为细胞衰老及年龄相关疾患的早期诊断和早期预防提供参考依据。

附图说明

图1为细胞形态学观察及β-半乳糖苷酶染色鉴定结果图；其中，A为光学显微镜下各组细胞形态学变化，200×，标尺：100μm；B为光学显微镜下SA-β-半乳糖苷酶染色结果，200×，标尺：100μm；C为SA-β-半乳糖苷酶染色的蓝染比例，均值±标准差，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001，ns为差异无统计学意义(P>0.05)，与22PDL或49PDL比较。

图2为年轻细胞和衰老细胞内活性氧含量变化情况图；其中，A为细胞内总ROS含量(酶标仪检测荧光强度后用蛋白含量进行相对定量)；为B线粒体内ROS含量(流式细胞仪检测荧光强度)；均数±标准差，n＝3，***P<0.0001，**P<0.01,*P<0.05，ns差异无统计学意义(P>0.05)，与22PDL或49PDL相比。

图3为年轻细胞和衰老细胞的m6A RNA甲基化Motif基序图；其中，A为三组间共同的Motif基序；B为各组分别的特异性Motif基序。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

下述实施例中所用的细胞为人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1，来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

实施例1

(1)细胞培养

细胞置于温度37℃、相对湿度95％及CO₂体积分数为5％的细胞培养箱中无菌培养。培养液为L-DMEM低糖培养基。当细胞融合度达到90％时，按实际需要进行细胞传代(1：2，1：3或1：4)，并进行细胞计数。群体倍增水平(population doubling levels，PDL)的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中n为继代培养细胞最终的PDL，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

(2)早衰细胞模型和复制性衰老细胞模型

早衰细胞模型：利用年轻细胞组22PDL进行H₂O₂染毒，将相同数目的22PDL接种至细胞培养瓶中(1:3传代)，待细胞增长至其50％融合度时，使用终浓度400μmol/LH₂O₂染毒4d，每天固定时间染毒一次，每次染毒2h。连续染毒4d获得细胞早衰起始组(prematuresenescence initiation group，PSi)；连续染毒4d后，换不染毒的L-DMEM低糖培养基继续培养7d后获得细胞早衰持续组(premature senescence persistence group，PSp)。

复制性衰老细胞模型：正常人胚肺成纤维细胞在体外连续传代培养至52PDL时，细胞停止增殖，呈现深度的复制性衰老状态。根据体外细胞培养年龄的定义：当培养细胞PDL小于或等于其寿命的50％时，获得年轻细胞；大于或等于90％时，获得衰老细胞；介于50％～90％之间时，获得中年细胞。本实验人胚肺成纤维细胞复制性衰老模型中，细胞分组为年轻细胞组22PDL，中年细胞组35PDL，复制性衰老细胞组49PDL(参考文献“张文娟,纪卫东,杨淋清,等.细胞衰老过程中P53表观遗传学修饰[J].毒理学杂志,2009,23(1):1-4.”)。

(3)衰老细胞表型鉴定

利用β-半乳糖苷酶染色实验观察并验证细胞的衰老状态。操作步骤如下：

1)吸除6孔板中培养细胞的细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；

2)吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min；

3)吸除PBS，每孔加入1mL染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A 10μL+β-半乳糖苷酶染色液B10μL+β-半乳糖苷酶染色液C 930μL+X-Gal溶液50μL)；

4)用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，置于37℃无二氧化碳培养箱中孵育过夜；

5)在普通光学显微镜下观察细胞衰老情况。每组细胞选取显微镜下三处不同的视野观察，计算每个视野中细胞总数和蓝染细胞数，最后计算蓝染细胞数占细胞总数的比率。

(4)细胞内ROS含量测定

使用Reactive Oxygen Species(ROS)Detection Assay Kit(Catalog:K936)试剂盒检测细胞内ROS含量，操作步骤如下：

4.1测荧光强度值

1)12孔板中，每孔接种3×10⁵个细胞，过夜能达到约80％的融合度；第二天除去培养基，并用500μL ROS Assay Buffer洗涤；

2)每孔中加入500μL用无血清培养基稀释的1×ROS Label(即H2DCFDA探针)。避光在37℃中孵育45min。每组做3个复孔，并设置不加探针的对照；

3)除去含探针的培养基，用无血清培养基洗涤3次，每孔加1mL无血清培养基马上检测荧光强度。包括对照(细胞和培养基)和空白孔(只有培养基)。Ex/Em＝495/529nm；

4)记录每孔荧光强度值。

4.2细胞总蛋白提取

1)检测完荧光强度后，吸除12孔板中的液体，用PBS洗涤一次；

2)每孔加30μL RIPA裂解液和0.3μL PMSF，充分吹打，将细胞完全裂解下来，合并复孔的液体加入新的EP管中；

3)将EP管放置冰上孵育30min，每10min涡旋震荡一次；

4)15000rpm，4℃离心5min，将上清转移至新的EP管中。

4.3BCA法测蛋白浓度

1)用PBS将标准蛋白稀释为1mg/mL；

2)配制BCA工作液，试剂A：试剂B＝50:1，BCA工作液室温可稳定24h；

3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准孔中，加PBS补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2mg/mL；

4)加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS补足到20μL，记录所加样品的体积；

5)各孔加200mL BCA工作液，放于37℃下显色20-30min；

6)用酶标仪测定A562或波长540-595nm之间的吸光度；

7)制作标准曲线，根据标准曲线和使用的体积计算出样品的蛋白浓度，以及蛋白的总质量。

4.4定量ROS

根据公式：ROS含量＝平均荧光强度值/平均蛋白质量-对照孔的平均荧光强度值/对照孔的平均蛋白质量，计算该组细胞内ROS含量(AFU/μg)。

(5)线粒体内ROS含量测定

1)6孔板中，每孔接种8×10⁵个细胞，过夜至90％融合度；

准备5mmol/LMitoSOX试剂原液：

将一瓶MitoSOX线粒体超氧化物指示剂(组分A)的含量(50μg)溶解于13μL的二甲基亚砜中(DMSO)制作5mM的MitoSOX试剂原液。

2)标记细胞：

①准备5μmol/LMitoSOX试剂工作溶液：用无血清培养基稀释5mmol/L的MitoSOX试剂原液至5μM，即稀释1000倍；

②负载细胞：加1.0-2.0mL的5μM MitoSOX试剂工作溶液至6孔板中，在37℃下避光孵育10min；

③洗涤细胞：用HBSS缓冲液清洗细胞1次；

3)用0.125％胰酶消化细胞，离心750rpm，3min；去上清，HBSS洗1次，离心750rpm，3min；

4)去上清，加1mL HBSS缓冲液重悬细胞；

5)96孔板，每孔加150μL重悬的细胞，用流式细胞仪(FITC通道)检测细胞荧光强度值，即线粒体内ROS的含量。

(6)m6A RNA甲基化免疫共沉淀法制备RNA样本

6.1RNA片段化

1)用DEPC水将RNA浓度调节至1μg/μL。每个200μL PCR管分装18μL(即18μg)的总RNA。加入2μL的Fragmentation Buffer 10×(货号CS220011)。吹打，充分混合，上下颠倒混匀；(对于300μg总RNA，需要17管)

2)将PCR仪预热至94℃。在加热盖关闭的情况下，在PCR仪中一次孵育5个试管5min。从仪器中取出试管，然后立即向每支试管中加入2μL 0.5mol/L EDTA(货号CS203175)。涡旋并旋转试管，将其放在冰上。重复此步骤，直到所有RNA都片段化；

3)收集所有试管的内容物于新的1.5mL EP管中，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH 5.2)，糖原(最终100μg/mL)和2.5体积的100％乙醇。混合内容物，并于-80℃孵育过夜；

4)在4℃，15000g离心25min。丢弃上清液，注意不要破坏沉淀，由于存在糖原，很容易看到沉淀；

5)用1mL 75％(vol/vol)乙醇洗涤沉淀，然后4℃，15000g，离心15min；

6)小心吸除上清液，待自然晾干，加入300μL DEPC水重悬沉淀。

6.2制备用于免疫沉淀的磁珠

1)制备样品1×IP缓冲液：将5×IP缓冲液用DEPC水稀释5倍，制备成5mL 1×IP缓冲液，即：4mL DEPC水+1mL 5×IP缓冲液，放置于新的15mL离心管中，置于冰上备用；

2)标记适当数量的EP管：每组样品准备2个1.5mL微量离心管，一管用于抗m6A抗体和一管阴性对照正常小鼠IgG；

3)拿出Magna ChIP蛋白A /G磁珠，充分分散和重悬直到看不见成团的珠子；

4)步骤2中准备的EP管，每管加入50μL Magna ChIP蛋白A /G磁珠；

5)每管中加入磁珠体积10倍的量的第一步制备的1×IP缓冲液，即每50μL体积原始磁珠加入500μL MeRIP稀释缓冲液，轻轻地吹打混匀使磁珠完全重悬；将试管放在磁力分离架上1min；

6)小心吸除上清液，确保不要吸到任何磁珠。从磁力分离架上拆下EP管；

7)重复步骤4)和步骤5)，再洗一次；

8)加入200μL 1×IP缓冲液，重悬50μL原始磁珠量的磁珠，向标记m6A的EP管中加入10μg抗m6A抗体，标记IgG的EP管加入10μg IgG作为后续的阴性对照；

9)室温，旋转孵育30min；

10)短暂离心后，将其放在磁力分离架上1min，然后去除上清液；

11)从磁力分离架上取下EP管。向每个EP管中加入0.5mL的1×IP缓冲液，并轻柔吹打几次以完全重悬磁珠。将EP管放在磁力分离架上1min，然后去除上清液；

12)重复步骤10)，继续洗两次。确保上清去除干净，仅留下磁珠；

13)磁力分离架上取下EP管，将其放在冰上。关闭EP管盖，以免磁珠变干。这些样本将在下面免疫沉淀部分的第3步中使用。

6.3免疫沉淀(MeRIP)

1)取出30μg总RNA(10％作为Input)，并将其放入标有“RNA Input”的新EP管中。将Input样品放在-80℃保存。该样品将用于生成标准曲线或用于qPCR方法中的比较，或用于RNA-seq中的输入对照；

2)配置300μg总RNA的1000μL MeRIP反应混合物(表1)：

表1 MeRIP反应混合物

3)向制备好的每个磁珠-抗体管中加入500μL MeRIP反应混合物。轻轻吹打几次以完全重悬磁珠，放在冰上；

4)将所有EP管放在4℃旋转孵育2h；

5)短暂离心EP管，以除去EP管的盖子和侧面上的液体。放在磁力分离架上1min；

6)吸除上清，小心不要碰到磁珠；

7)从磁力分离架上取下EP管，每管加入500μL预冷的1×IP缓冲液，并轻轻吹打几次以完全重悬磁珠；

8)将EP管放在磁力分离架上1min，然后弃去上清液；

9)重复上述洗涤程序(步骤7)至步骤8))2次，共洗涤3次；

10)将准备好的EP管放在冰上，立即进行下步洗脱。

6.4洗脱

1)制备20mmol/L m6A盐：将10mg N6甲基腺苷-5'单磷酸钠盐(m6A)(货号CS220007)溶解在1.3mL DEPC水中。每管150μL分装后，储存于-20℃；

2)制备洗脱缓冲液：每个管大概准备225μL，45μL 5×IP缓冲液(CS220009)+75μL步骤1中制备的20mM m6A盐+3.5μL RNase Inhibitor(CS216138)+101.5μL DEPC水，将混合液混匀备用；

3)加200μL洗脱缓冲液至预先制备好的磁珠中，轻轻吹打几次混匀，完全重悬磁珠；

4)将所有EP管放在4℃下连续振荡洗脱1h；

5)短暂离心EP管，以去除EP管盖和管壁的液体，放在磁力分离架上1min；

6)将上清液转移至新的1.5mL EP管中，特别注意不要吸出磁珠，否则会增加背景噪音；

7)重复上述步骤3)-步骤6)，即洗脱两次，将来自同一样品的所有洗脱液合并，每种样品总洗脱体积应为200μL。

6.5纯化RNA片段

1)根据RNeasy mini试剂盒(Qiagen)说明书，将上述200μL样品转移到新的15mL锥形管中。加入700μL Buffer RLT，并充分混合；

2)加入1400μL无水乙醇，然后吹打，充分混合，不要离心，立即进入下一步；

3)将其中700μL样品转移到RNeasy MinElute旋转柱中并将其置于2mL收集管上，轻轻合上盖子，以≥8,000×g(≥10,000rpm)的速度离心15s，丢弃收集管中的液体，将另外700μL样品转移到离心管中，丢弃液体。重复该过程，直到所有样品上样完毕；

4)将RNeasy MinElute旋转柱放在新的2mL收集管中，将500μL Buffer RPE加至离心柱中。轻轻合上盖子，以≥8,000×g(≥10,000rpm)的速度离心15s，以洗涤离心柱膜。弃去收集管中的液体，在下步中重复使用此收集管；

5)在RNeasy MinElute离心柱中加入50μL 80％乙醇，轻轻合上盖子，并以≥8000×g(≥10,000rpm)的速度离心2min，以洗涤离心柱膜，同时弃去收集管和其中的液体；

6)将RNeasy MinElute旋转柱放在新的2mL收集管中(RNA纯化试剂盒中提供)，打开离心柱的盖子，15,000rpm离心5min，弃去收集管和其中的液体；

7)将RNeasy MinElute旋转柱放在新的1.5mL收集管中(由RNA纯化试剂盒提供)。将14μL无RNase的水直接添加到离心柱膜的中心，轻轻合上盖子，并15,000rpm离心1min以洗脱RNA，洗脱的RNA可储存于-80℃。

(7)m6A RNA甲基化测序

1)将上个步骤中制作好的RNA样品，委托上海云序生物科技有限公司进行m6A RNA甲基化的高通量测序；

2)测序后，使用Q30质控，筛选双端高质量的reads，以人类参考基因组UCSC HG19(GRCh37，GCA_000001405.1)作为比对基因组。

(8)m6A RNA甲基化谱分析

1)使用diffReps软件进行差异甲基化位点的识别。再通过自有程序挑选出与蛋白编码基因的exon重叠的部分，筛选P-value≤0.0001并且Foldchange≥2的基因认为差异表达基因；

2)把测序结果中bam.文件导入至Integrative Genomics Viewer(IGV)软件，观察每个样本特定基因在基因组的丰度，将m6A RNA甲基化位点进行可视化。

实验结果及分析：

(1)细胞形态学观察及β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老的发生

如图1A所示，光学显微镜下显示随细胞代龄增加，细胞形态由纤长逐渐变大铺平，早衰起始组PSi组细胞变大扁平，PSp组细胞与49PDL相似，细胞核变大，有些细胞皱缩走向死亡。如图1B中SA-β-半乳糖苷酶染色结果显示，49PDL与PSp组细胞内蓝染细胞数量最多，SA-β-半乳糖苷酶表达增加，分别是22PDL的42.2和37.9倍，PSp和49PDL之间无明显差异。PSi组蓝染细胞数是22PDL的16.3倍，低于49PDL和PSp；如图1C所示，随着代龄增加，SA-β-半乳糖苷酶表达也逐渐增加。

(2)年轻细胞和衰老细胞内活性氧含量变化情况

由图2A可知，35PDL、49PDL和PSi三组细胞内总ROS含量均高于22PDL，分别是22PDL的1.9、3.4、2.5倍，差异具有统计学意义(P<0.05)；PSp组总ROS含量是22PDL的0.8倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。与49PDL相比，PSp和PSi两组细胞内总ROS含量较低，分别是49PDL的0.2、0.7倍，差异有统计学意义(P<0.05)。图2B显示，随着代龄增加，线粒体内mtROS含量逐渐增加，与22PDL相比，49PDL与PSi均增加，分别是22PDL的10.9、1.8倍；与49PDL相比，PSi、PSp均降低，分别是49PDL的0.6、0.2倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明人胚肺成纤维细胞及其线粒体ROS随增龄逐渐累积，启动复制性衰老；中等浓度过氧化氢可使其ROS水平急剧增加，诱导早衰起始，后逐渐代偿性减弱，出现不可逆的持续早衰状态。

(3)年轻细胞和衰老细胞的m6A RNA甲基化Motif基序

经过RNA甲基化测序图谱分析，细胞内发生m6A RNA甲基化位点主要分布在3'UTR和CDS编码区，三组之间的分布位点无明显差异，几乎无m6A RNA甲基化位点分布在5'UTR。22PDL发现7个特异RNA甲基化基序，49PDL发现7个特有RNA甲基化基序，PSp组发现12个特有RNA甲基化基序；除了共有的常见的m6A基序GGACU外，不同细胞衰老阶段的m6A RNA甲基化亦有特有序列，其中22PDL组：C/G/UUGGA，AGCAG/C，CUU/ACCU，49PDL组：AGAGCA/G，G/A/UCAGC，UGGAA/C，PSp组：G/CGA/UGGA，G/AAGAUCG，CAGCAG/CC，G/CAAGA，C/AUGUA，这些特有序列说明检测的细胞在不同的状态具有其特定的m6A修饰基序，特有的基序可用于鉴定其所处的衰老状态(图3)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的m6A RNA甲基化基序包括如下三组基序：

A组：用于鉴定年轻细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：CUGGA，GUGGA，UUGGA，AGCAG，AGCAC，CUUCCU，CUACCU；

B组：用于鉴定复制性衰老细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：AGAGCA，AGAGCG，GCAGC，ACAGC，UCAGC，UGGAA，UGGAC；

C组：用于鉴定早衰细胞的基序，为如下序列的一种或多种组合：GGAGGA，GGUGGA，CGAGGA，CGUGGA，GAGAUCG，AAGAUCG，CAGCAGC，CAGCACC，GAAGA，CAAGA，CUGUA，AUGUA。

3.根据权利要求2所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述细胞衰老诊断试剂盒通过分析细胞中m6ARNA甲基化图谱，从而诊断细胞衰老情况：

1)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有A组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为年轻细胞；

2)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有B组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为复制性衰老细胞；

3)当m6ARNA甲基化图谱显示细胞中含有C组所示基序的一种或多种组合时，判断细胞为早衰细胞。

4.根据权利要求2或3所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的年轻细胞的定义为：群体倍增水平PDL小于或等于其寿命的50％的细胞；

所述的复制性衰老细胞的定义为：群体倍增水平PDL大于或等于其寿命的90％的细胞；

所述的早衰细胞为年轻细胞应激诱导的衰老细胞，应激因素包括但不限于氧化应激；

其中，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

5.根据权利要求2或3所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的细胞衰老情况通过以下步骤诊断：

(1)提取待测细胞总RNA；

(2)RNA甲基化免疫共沉淀法富集m6A RNA甲基化片段，洗脱，纯化，得到待测样品；

(3)取待测样品进行m6A RNA甲基化测序，获得m6ARNA甲基化图谱，根据图谱所显示的m6A RNA甲基化基序类型，诊断细胞衰老情况。

6.根据权利要求2或3所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的衰老诊断试剂盒中含有RNA提取试剂，m6A RNA甲基化片段富集试剂，以及m6ARNA甲基化测序和分析试剂中的一种或多种组合。

7.根据权利要求2或3所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞。

8.根据权利要求7所述的m6A RNA甲基化基序在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的细胞是人胚肺成纤维细胞。

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