CN116716374A - 一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，该发明是一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其解磷促生效果验证，包括以下步骤，a、获取得到根际土壤和植物组织；b、采用添加溴酚蓝指示剂的分离培养基和液体培养基从步骤a中获取得到的根际土壤或植物组织内部初步分离出具备解磷能力的菌株，完成解磷菌初筛；c、通过测定步骤b中解磷菌初筛得到的菌株中IAA和铁载体分泌量筛出有多种促生功能的高效解磷菌，并通过16SrRNA测序鉴定菌株，筛选一株进行菌株鉴定和命名，完成解磷菌复筛；本发明借助定性和定量试验从玉米根际土壤、茎秆中筛选出既能产IAA又能分泌铁载体的高效解磷菌，并将其应用于玉米，验证其促生效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证。
背景技术
磷对作物的生长发育至关重要，是仅次于氮的第二大营养元素。在土壤-植物磷循环中，由于土壤的固定吸附作用，致使土壤中的磷酸盐难以被作物吸收利用。早期，人们通过施用化学磷肥来补充土壤磷储存量，满足作物对磷的需求。但随着化肥施用量的不断增加，引发一系列环境和生态问题(水体富营养化、土壤板结等)。同时，过量施用化肥的增产效果甚微，难以满足日益增加的人口需求。目前，寻求化学磷肥的替代品逐渐受到农业工作者的青睐。
解磷菌通过增溶(有机酸)和矿化(磷酸酶、植酸酶等)作用，将土壤中难溶的磷酸盐转化成能被作物直接吸收利用的可溶性磷酸盐，是土壤-植物磷循环的重要参与者，在可持续和有机农业中均有广阔的应用前景。同时，解磷菌取之土壤用于土壤，对环境友好，可缓解化肥过量施用引发的环境污染问题，是替代化肥的绿色生物技术措施之一。
传统的解磷菌筛选主要借助于蒙金娜培养基，通过观察产生溶磷圈的大小来反映其溶磷能力，但由此筛选出来的解磷菌往往功能单一，不易在土壤中定殖，促生作用不明显，通过借助多项指标筛选高效解磷菌对于扩大解磷菌的商业化应用范围具有重要战略意义。吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)是一种植物生长激素，能促进作物根系的生长发育，增加根毛和侧根数量，增加根系分泌物数量，改善土壤质地和微生物群落结构。铁载体是一种可以螯合三价铁离子的低分子量物质，能促进植物对养分的吸收。本发明借助定性和定量试验从玉米根际土壤、茎秆中筛选出既能产铁载体又能分泌IAA的高效解磷菌，并将其应用于玉米，验证其促生效果。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是，借助定性和定量试验从玉米根际土壤、茎秆中筛选出既能产IAA又能分泌铁载体的高效解磷菌，并将其应用于玉米，验证其促生效果。
为实现上述目的，本发明提供了一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：包括以下步骤，a、获取得到根际土壤和植物组织；b、采用添加溴酚蓝指示剂的分离培养基和液体培养基从步骤a中获取得到的根际土壤或植物组织内部初步分离出具备解磷能力的菌株，完成解磷菌初筛；c、通过测定步骤b中解磷菌初筛得到的菌株中IAA和铁载体分泌量筛出有多种促生功能的高效解磷菌，并通过16S rRNA测序鉴定菌株，筛选一株进行菌株鉴定和命名，完成解磷菌复筛；d、将步骤c中筛选出的解磷菌制备成菌悬液，并通过盆栽试验，验证其促生效果。
这样，上述的产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，通过选用根际土壤和植物组织，并且在完成解磷菌初筛时，是从根际土壤或植物组织内部初步分离出具备解磷能力的菌株，这使得分离出来的菌株能够更好的发挥解磷能力，更好的将土壤中难溶的磷酸盐转化成能被作物直接吸收利用的可溶性磷酸盐，更好的适应植株生长需求。
在完成解磷菌复筛时，是通过测定菌株中IAA和铁载体分泌量筛出有多种促生功能的高效解磷菌的。与传统的解磷菌筛选相比，传统的筛选主要借助于蒙金娜培养基，通过观察产生溶磷圈的大小来反映其溶磷能力，传统的筛选出来的解磷菌往往功能单一，不易在土壤中定殖，促生作用不明显。本方法在筛选得到的解磷菌时，测定菌株中IAA和铁载体分泌量，吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)是一种植物生长激素，能促进作物根系的生长发育，增加根毛和侧根数量，增加根系分泌物数量，改善土壤质地和微生物群落结构。铁载体是一种可以螯合三价铁离子的低分子量物质，能促进植物对养分的吸收。本方法中，借助解磷菌初筛步骤中的定性和解磷菌复筛时的定量试验从玉米根际土壤、茎秆中筛选出既能产IAA又能分泌铁载体的高效解磷菌，使得筛选得到的解磷菌能够具备促进作物根系的生长发育，增加根毛和侧根数量，增加根系分泌物数量，改善土壤质地和微生物群落结构的作用，同时还具备能促进植物对养分的吸收的作用。并且将筛选得到的解磷菌应用于玉米，验证其促生效果。
作为优化，在步骤b中，分离培养基为改良蒙金娜培养基；液体培养基为蒙金娜培养基。
这样，分离培养基为改良蒙金娜培养基；液体培养基为蒙金娜培养基，改良蒙金娜培养基和蒙金娜培养基能够具有更加方便制备的优点。
作为优化，在步骤b中，包括应用蒙金娜培养基从根际土壤、植物组织内部初步分离筛选具备解磷能力的菌株的步骤；包括应用蒙金娜液体培养基比较不同解磷菌解磷能力差异的步骤。
这样，在步骤b中，通过采用蒙金娜培养基从根际土壤、植物组织内部初步分离筛选具备解磷能力的菌株，再采用蒙金娜液体培养基比较不同解磷菌解磷能力差异，完成定性的筛选。筛选步骤更加简单。
作为优化，在步骤c中，筛选一株进行菌株鉴定和命名，其中C11鉴定为台湾假单胞菌，命名为CYLM001，NCBI登录号为：OP303214。
这样，筛选一株进行菌株鉴定和命名，将C11鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)，命名为CYLM001，NCBI登录号为：OP303214。
作为优化，步骤d中，制备菌悬液时，解磷菌悬浮液命名为：台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)；并且以无菌磷酸缓冲液浸种作为空白对照。
这样，将解磷菌悬浮液命名为：台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)；再以无菌磷酸缓冲液浸种作为空白对照，能够更好的进行对照比较。
作为优化，步骤d中，盆栽结果表明，在施磷和不施磷条件下，与对照相比，添加台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)菌悬液能显著提高玉米抽雄期、灌浆期、成熟期的生物量。
作为优化，步骤d中，选取京科糯928玉米种子作为实验材料。
综上所述，采用上述方法筛选出既能产IAA又能分泌铁载体的高效解磷菌，能够更好的促进作物根系的生长发育，增加根毛和侧根数量，增加根系分泌物数量，改善土壤质地和微生物群落结构；促进植物对养分的吸收。
附图说明
图1菌株的16s RNA鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，需注意的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方式构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
实施例
1、解磷菌的初筛
1.1试剂与培养基
(1)溴酚蓝
(2)75％酒精
(3)2.5％的NaClO
(4)NaOH
(5)HCL
(6)2，6二硝基酚
(7)硫酸钼锑贮备液：量取126mL浓硫酸，缓缓加入到400mL水中，不断搅拌冷却。另称取经磨细的钼酸铵(GB657)10g溶于温度约60℃300mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓慢倒入钼酸铵溶液中，再加入5g·L-1酒石酸锑钾100mL，冷却后，加水稀释至1000mL，摇匀，贮于棕色试剂瓶中，此贮备液含10g·L钼酸铵，2.25mol·L-1硫酸。
(8)5g·L-1酒石酸锑钾：称取化学纯酒石酸锑钾0.5g溶于100mL水中。
(9)钼锑抗显色剂：称取1.5g抗坏血酸(左旋，旋光度+21-22)溶于100mL钼锑贮备液中。此溶液有效期补偿，宜用时现配。
(10)分离培养基(改良蒙金娜培养基)
葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，0.4％溴酚蓝(pH 6.7)6mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
注：葡萄糖滤膜过滤后加入。
(11)Ca3(PO4)2复筛培养基
葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，0.4％溴酚蓝(pH 6.7)6mL，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
注：葡萄糖滤膜过滤后加入。
(12)LB培养基
胰蛋白胨10g、酵母提取物5g；氯化钠(NaCl)10g、H2O 1000mL、pH值7.40，121℃灭菌20min。
1.2具体实施方式
1.2.1应用蒙金娜培养基从根际土壤、植物组织内部初步分离筛选具备解磷能力的菌株。
(1)称取25g根际土样加到装有225mL无菌生理盐水(0.85％)的500mL三角瓶中(内含玻璃珠)，25℃摇床170r·min-1震荡20min，使土壤均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；
(2)在超净工作台上吸取1mL土壤悬液到装有9mL无菌水的25mL无菌离心管中，按照10倍法依次稀释10-1→10-2→10-3→10-4→10-5→10-6。每次吸取土壤悬液时，所用的吸管在稀释液中反复吸入吹出悬液3-5次，使管壁吸附部分饱和以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散；
(3)再依次吸取10-4、10-5、10-6稀释度0.1mL，涂布于分离培养基(配方：葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，0.4％溴酚蓝(pH 6.7)6mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；注：葡萄糖滤膜过滤后加入)上，每个稀释度作4个重复，将平板倒置于28℃恒温培养箱培养2-3d；
(4)有黄色解磷圈即为初筛的解磷菌；
(5)利用灭菌接种环挑取不同形态的单菌落在分离培养基上进行划线纯化，直至镜检无杂菌为止；
(6)然后挑取单菌落转至LB培养基上培养直至菌苔长起，置于4℃冰箱保存备用。
1.2.2应用蒙金娜液体培养基比较不同解磷菌解磷能力差异
分别配制以Ca3(PO4)2为唯一磷源液体复筛培养基(葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，液体复筛培养基pH 7.0；将配制好的液体复筛培养基于115℃灭菌20-30分钟后；注：葡萄糖滤膜过滤后加入)，通过钼锑抗比色反映目标菌株解磷能力的强弱，筛选具有高解磷能力的菌株。
2解磷菌的复筛
2.1试剂与培养基
(1)LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g；NaCl 10g、H2O 1000mL、pH值7.40，121℃灭菌20min。
(2)Salkowski's试剂:1mL 0.5mol·LFeCl3，溶解于49mL 35％HClO4(25mL70％高氯酸定容50mL)中。
(3)0.5mol·L FeCl3：称取67.5g三氯化铁固体，在500mL去离子水中加入10mL6mol/L的盐酸抑制水解，再加入固体，搅拌均匀即可。
(4)100mL CAS检测固体培养基：1mL 20％蔗糖溶液，3mL 10％酸水解酪蛋白，100uL 1mmol/L CaCl2，0.5mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，5mL CAS染液，1.8g琼脂粉，蒸馏水1000mL。
(5)CAS染液：称取0.012g CAS(刃天青)溶解于10mL去离子水中，并与2mL 1mmol/LFeCl3混合，得a液；取0.015g CTAB溶于8mL去离子水中，得b液；a液与b液混合即得CAS染液。
2.2具体实施方式
(1)候选解磷菌株IAA分泌量的比较
a活化筛选出的具有解磷能力的菌株；
b吸取50uL接入1mL添加色氨酸(1g/L)的LB液体培养基，并以不接菌的培养基作为对照，每个处理做三个重复，置于28℃180r/min摇床震荡培养3天；c吸取800uL置于1.5毫升离心管，4℃12000r/min离心后取100uL上清液加入到添加入100uL Salkowski's试剂(1mL0.5mol·L-1氯化铁溶解于49mL 35％高氯酸中)96孔板中吹打混匀，室温下避光显色30min，然后进行观察；
d能够产生IAA的菌株菌悬液上清与Salkowski's试剂混合会呈现红色或者粉红色，而色氨酸是黄色或者无颜色反应。
(2)测定候选解磷菌株的铁载体分泌量的比较。
将所分离菌种接种于CAS检测培养基(1mL 20％蔗糖溶液，3mL 10％酸水解酪蛋白，100u L 1mmol/L CaCl2，0.5mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8，5mL CAS染液，琼脂粉1.8g)上，28℃培养7d，看是否有橘黄色晕圈出现，如果有则说明有铁载体分泌，并以不接菌的培养基作为对照。
2.3结果，如表1所示、图1所示，通过蒙金娜培养基进行定性和定量初筛，共筛选出18株解磷菌，通过测定IAA和铁载体含量，选择一株进行菌株鉴定和命名，其中C11鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，命名为CYLM001，NCBI登录号为：OP303214。此外，C11菌株的生理生化指标如表2所示。对C11菌株的生物学特性研究表明，该菌株能在pH值5–9的范围内生长，耐酸碱能力强。
表1不同解磷菌的解磷促生效果比较：
表2为C11菌株的生理生化指标：
3玉米盆栽试验
3.1试剂与培养基
(1)LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g；氯化钠(NaCl)10g、H2O 1000mL、pH值7.40，121℃灭菌20min。
3.1具体实施方式
(1)解磷菌悬浮液制备：菌株按1％的接种量接种于装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，120rpm，28±2℃，摇床培养24h，使其浓度达到108cfu·mL-1。培养液以8000rpm、4℃、离心10分钟，收集细菌细胞，用无菌磷酸缓冲液洗涤两次。将细菌悬浮于100mL无菌磷酸缓冲液中，浓度达到108cfu·mL-1，重悬后用于种子引发。无菌磷酸缓冲液浸种作为空白对照(CK)，以台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)浸种的作为处理(T1)。
(2)试验材料：京科糯928。挑选饱满一致的玉米种子，先用10％H2O2消毒30min，无菌水洗涤3次，然后在蒸馏水中浸泡6h，之后于在细菌悬浮液中浸泡1h，把吸足菌液的种子均匀铺在湿润滤纸上，放入25℃的恒温培养箱中遮光催芽24h。通过连续稀释测定，每粒种子表面的细菌数量约为108cfu。处理过的种子撒在培养皿中，在室温下风干一夜。每种解磷菌各引发100粒种子。
(3)为了确定各分离菌株对玉米生物量的影响，进行玉米盆栽试验，设置2个磷水平：正常磷P正(100kg/hm2)、、不施磷P低(0mg/hm2)，依据菌株类型设置四个处理：对照(CK)、台湾假单胞菌(T1)。挑选大小均匀的引发种子接种到育苗盘中，每天定时浇水，待玉米长至两叶一心时，挑选长势一致的玉米苗移至盆钵中，每盆移苗2棵，一周后定苗1株。为了保证植物生长期间养分的正常供应，装盆前每盆土壤采用四分法混入纯氮220kg/hm2，纯钾110kg/hm2，有机肥20g/kg，每盆浇灌4升水。试验采用完全随机试验，每个处理设置10组生物学重复。每天给植物浇水，以保持田间持含水量(80％，w/w)。测定抽雄期、灌浆期、成熟期玉米生物量，证实其促生效果。
3.3结果，如表2所示，
盆栽结果表明，在不施磷和施磷条件下，与对照相比，添加台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)能显著提高玉米抽雄期、灌浆期、成熟期的生物量，籽粒粒重增幅分别为9.24％(不施磷)、10.65％(施磷)，证实了本发明筛选出来的多功能高效解磷菌具有优良的促生效果和应用前景。
表2菌液处理下玉米生育后期的生物量差异
注：1)CK：未施用解磷菌；T1：施用台湾假单胞菌。
2)同一列数字之后不同字母表示方差分析的显著性(p＜0.05)。同一施磷水平下不同施菌处理间进行方差分析，不同磷水平间不进行方差分析。
本发明技术方案具有以下特点：
1、筛菌方法创新：在蒙金娜培养基的基础上，又将铁载体和IAA作为筛选优势溶磷菌的关键指标。
2、接种方式创新：
a、试验材料：京科糯928。挑选饱满一致的玉米种子，先用10％H2O2消毒30min，无菌水洗涤3次，然后在蒸馏水中浸泡6h，之后于在细菌悬浮液中浸泡1h，把吸足菌液的种子均匀铺在湿润滤纸上，放入25℃的恒温培养箱中遮光催芽24h。这样，采用生物引发的方式接种玉米种子，使种子处于一种将要萌发又未萌发的状态，帮助菌体在种子内部定殖，提高接种效率。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：包括以下步骤，a、获取得到根际土壤和植物组织；b、采用添加溴酚蓝指示剂的分离培养基和液体培养基从步骤a中获取得到的根际土壤或植物组织内部初步分离出具备解磷能力的菌株，完成解磷菌初筛；c、通过测定步骤b中解磷菌初筛得到的菌株中IAA和铁载体分泌量筛出有多种促生功能的高效解磷菌，并通过16SrRNA测序鉴定菌株，筛选一株进行菌株鉴定和命名，完成解磷菌复筛；d、将步骤c中筛选出的解磷菌制备成菌悬液，并通过盆栽试验，验证其促生效果。
2.如权利要求1所述的一种吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：在步骤b中，分离培养基为改良蒙金娜培养基；液体培养基为蒙金娜培养基。
3.如权利要求1所述的一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：在步骤b中，包括应用蒙金娜培养基从根际土壤、植物组织内部初步分离筛选具备解磷能力的菌株的步骤；包括应用蒙金娜液体培养基比较不同解磷菌解磷能力差异的步骤。
4.如权利要求1所述的一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：在步骤c中，筛选一株进行菌株鉴定和命名，其中C11鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)，命名为CYLM001，NCBI登录号为：OP303214。
5.如权利要求4所述的一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：步骤d中，制备菌悬液时，解磷菌悬浮液命名为：台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)；并且以无菌磷酸缓冲液浸种作为空白对照。
6.如权利要求5所述的一种产吲哚乙酸高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：步骤d中，盆栽结果表明，在施磷和不施磷条件下，与对照相比，添加台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)菌悬液能显著提高玉米抽雄期、灌浆期、成熟期的生物量。
7.如权利要求4所述的一种产铁载体高效解磷菌的筛选及其促生效果验证，其特征在于：步骤d中，选取京科糯928玉米种子作为实验材料。
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