CN116715976A - 一类含手性碳的五甲川菁染料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类含手性碳的五甲川菁染料，具有通式I的结构式I中，R1、R2可以相同也可以不同，R1和R2各自独立的选自C1‑6烷基、‑(CH2)pCOOR3、‑(CH2)pOR3或含有R4取代的苄基，R3为H、C1‑6烷基或者苯基；R4为H、卤素、烷氧基、酰胺基或硝基；X‑选自卤素负离子、或OTs‑；p为1‑6。本发明公开的一类含手性碳的五甲川菁染料及其制备方法和应用，含手性碳的五甲川菁染料可以针对有核红细胞和白细胞的差异发出不同的荧光，实现有核红细胞和白细胞的分类及计数。
Description
技术领域
本发明涉及精细化工领域，尤其涉及一类含手性碳的五甲川菁染料及其制备方法和应用。
背景技术
白细胞是血细胞的组成成分之一，在人体免疫***中发挥着杀灭细菌、病毒、抵御炎症等重要作用。大部分的白细胞分布在血管外的细胞间隙内，有30％以上贮存在骨髓内，只有少量的白细胞在血管中流动的。这些白细胞凭借血液的运输，从它们生成的器官，即骨髓和淋巴组织，到达发挥作用的部位。人体内白细胞总数和种类的百分比是相对稳定的。当机体发生炎症或其他疾病时，可引起白细胞总数及各种白细胞的百分比发生变化，因此检查白细胞总数及白细胞分类计数成为辅助临床医生诊断的一种重要方法。
传统的检查方法是借助于人工显微镜对血液中的红细胞、白细胞、血小板计数，并对染色后血涂片的白细胞分类，费时费力，检测项目也少，且准确性和结果一致性差。随着技术的发展，血细胞分析仪凭借着操作简单、方便、自动化程度高的特点，已经全面用于临床血液分析，成为检验科必备的、最基本的自动化设备。特别是采用三维核酸荧光染色技术的五分类血细胞自动分析仪，其通过半导体激光器照射微管中的细胞束，收集前向散射光，侧向散射光和侧向荧光信号，然后运用计算机图像处理技术呈现细胞的三维状态并进行多方位的分离和数字演算，实现了血细胞的分类和计数。该方法的特点是引入了对核酸特异性识别的荧光染料，从而获得了更丰富的样本信息，是目前较先进的血细胞检测方法之一。
能够用于白细胞分类和计数的荧光染料是典型的高附加值精细化学品，我国对这类功能性试剂的研究和发展起步晚，主要依靠进口。因此，需要开发具有独立自主知识产权的新型荧光染料用于血细胞分析。
目前，针对于白细胞分类及计数通道，血细胞分析仪的检测方法是利用特殊的试剂将除嗜碱性粒细胞外的白细胞处理成裸核，然后用荧光染料染色，根据荧光强度的不同，可以对嗜碱细胞和其他白细胞进行分类及计数。但是异常的血液样本中会含有有核红细胞，有核红细胞的核结构也会被保留下来，会对白细胞计数产生干扰。
发明内容
针对现有技术存在的在血细胞分析仪上无法实现有核红细胞和白细胞的区分的问题，本发明提供一类含手性碳的五甲川菁染料及其制备方法和应用，含手性碳的五甲川菁染料可以针对有核红细胞和白细胞的差异发出不同的荧光，实现有核红细胞和白细胞的分类及计数。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一类含手性碳的五甲川菁染料，具有通式I的结构
式I中，R1、R2可以相同也可以不同，R1和R2各自独立的选自C1-6烷基、-(CH2)pCOOR3、-(CH2)pOR3或含有R4取代的苄基，
R3为H、C1-6烷基或者苯基；
R4为H、卤素、烷氧基、酰胺基或硝基；
X-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CF3 -、BF4 -、或OTs-；
p为1-6。
含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)在80-130℃下，2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃反应4-24h，得到式Ⅴ所示的化合物；
(2)在第二反应溶剂中，在60-140℃下，式Ⅴ所示的化合物与丙二醛二苯胺盐酸盐在第一催化剂作用下进行缩合反应，反应0.5-3h，得到I所示的目标化合物。
进一步地，式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚采用如下方法制备而成：
在第三反应溶剂和强碱中，在10-100℃下，2-甲基乙酰乙酸乙酯和苄溴进行亲核取代反应，反应时间为6-24h，得到式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯；
在第四反应溶剂中，在10-100℃下，式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯在碱性条件下进行水解脱羧，反应时间为3-24h，得到式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮；
在60-130℃下，式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮与苯肼或苯肼盐酸盐在第二催化剂的作用下发生Fischer吲哚合成反应，反应时间为1-5h，得到式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚。
进一步地，步骤(1)中，2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃在第一反应溶剂中进行反应，所述第一反应溶剂选自乙腈或甲苯。
进一步地，所述2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃的摩尔比为1:1-2。
进一步地，在步骤(2)中，所述丙二醛二苯胺盐酸盐与式Ⅴ的化合物的摩尔比为1：2-2.5；
所述第二反应溶剂选自乙酸酐或者乙醇；
所述第一催化剂选自对甲苯磺酸、乙酸钠或者哌啶。
进一步地，在制备式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯过程中，所述2-甲基乙酰乙酸乙酯和苄溴的摩尔比为1:1-2；
所述强碱选自氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠或者叔丁醇钾中的一种或两种；
所述第三反应溶剂选自水、二氯甲烷、乙醇、甲醇、叔丁醇、乙酸乙酯或乙腈中的一种或两种。
进一步地，在制备式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮的过程中，所述第四反应溶剂选自水、乙醇、甲醇或乙腈中的一种或两种；使用的碱为氢氧化钾或者氢氧化钠；
在制备式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚过程中，3-甲基-4-苯基-2-丁酮与苯肼或苯肼盐酸盐的摩尔比为1-2:1，所述第二催化剂选自对甲苯磺酸或乙酸酐；反应溶剂为乙酸或乙醇。
含手性碳的五甲川菁染料用于有核红细胞和白细胞分类及计数。
一种对可能含有有核红细胞和白细胞分类及计数的方法，包括如下步骤：
将含手性碳的五甲川菁染料配置成荧光染色液；
将所述荧光染色液用于血细胞分析仪，根据染色血细胞后荧光强度的不同，可实现嗜碱细胞和其他白细胞的分类及计数。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明公开的含手性碳的五甲川菁染料通过在吲哚的季碳原子上引入可自由旋转的苄基，使分子在溶液中有更加立体的空间构型，染料分子在高浓度条件下不易发生堆叠；
第二、本发明公开的含手性碳的五甲川菁染料的合成方法，由廉价易得的2-甲基乙酰乙酸乙酯出发，与苄溴发生亲核取代反应，制备式Ⅱ的化合物；式Ⅱ的化合物在碱性条件下水解脱羧，制备式Ⅲ的化合物；然后与苯肼发生Fischer吲哚合成反应，制备式Ⅳ的化合物；式Ⅳ的化合物与相应卤代试剂反应，制备式Ⅴ的化合物；最后与丙二醛二苯胺盐酸盐发生缩合反应，制备式Ⅰ的化合物，合成方法中原料廉价易得，合成工艺简单，产率高，所有合成步骤不用经过耗时费力的柱层析提纯技术即可得到符合要求的目标化合物；
第三、本发明公开的含手性碳的五甲川菁染料，经检测，最大吸收峰在650nm附近，荧光发射峰在680nm附近，可使用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源；
第四、本发明公开的含手性碳的五甲川菁染料，核酸会使其荧光强度有不同程度的猝灭，可用于体外核酸分子的识别；
第五、本发明公开的含手性碳的五甲川菁染料可与市售血细胞分析仪配套使用，针对有核红细胞和白细胞的差异发出不同的荧光，实现有核红细胞和白细胞的分类及计数。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为染料G的高分辨质谱数据图；
图2为染料G的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)；
图3为染料G的核磁碳谱图13CNMR(DMSO-d6)；
图4为染料H的高分辨质谱数据图；
图5为染料H的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)；
图6为染料H的核磁碳谱图13CNMR(DMSO-d6)；
图7为对比例1的高分辨质谱数据图；
图8为对比例1的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)；
图9为本发明公开的染料G和染料H与对比例1在PBS缓冲液中的紫外吸收光谱图；
图10为本发明公开的染料G和染料H与对比例1在PBS缓冲液中的荧光发射光谱图；；
图11为本发明公开的染料G、染料H与对比例1最大荧光发射峰处的荧光强度随DNA浓度变化图；
图12为本发明公开的染料G、染料H与对比例1最大荧光发射峰处的荧光强度随RNA浓度变化图；
图13为本发明公开的染料G和染料H与迈克原装的血细胞分析用F-Fw染色液在血细胞分析仪中对三个水平的血细胞质控品进行测试得到的血细胞散点图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-13，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一类含手性碳的五甲川菁染料，具有通式I的结构
式I中，R1、R2可以相同也可以不同，R1和R2各自独立的选自C1-6烷基、-(CH2)pCOOR3、-(CH2)pOR3或含有R4取代的苄基，
R3为H、C1-6烷基或者苯基；
R4为H、卤素、烷氧基、酰胺基或硝基；
X-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CF3 -、BF4 -、或OTs-；
p为1-6。
以下，举出由通式I所表示的化合物的具体例，但本发明并不限于这些具体例。
本发明由通式I所示的化合物的合成路线为：
由廉价易得的2-甲基乙酰乙酸乙酯出发，与苄溴发生亲核取代反应，制备式Ⅱ的化合物；式Ⅱ的化合物在碱性条件下水解脱羧，制备式Ⅲ的化合物；然后与苯肼发生Fischer吲哚合成反应，制备式Ⅳ的化合物；式Ⅳ的化合物与相应卤代试剂反应，制备式Ⅴ的化合物；最后与丙二醛二苯胺盐酸盐发生缩合反应，制备式Ⅰ的化合物。
本发明由通式I所示的化合物可通过下述记载的方法合成。
本申请所涉及的Ⅳ所示的化合物采用如下方法制成：
S1：合成式Ⅱ所示的化合物
69.36mmol的2-甲基乙酰乙酸乙酯、83.24mmol乙醇钠和73.83mmol苄溴溶于60mL乙醇中，回流反应6h，停止反应。旋干溶剂，加入60mL水，用盐酸调节pH至中性后用乙酸乙酯萃取，随后依次用水和饱和氯化钠各洗涤三次，旋干后得淡黄色液体15.90g(产率：97％)；
S2：合成式Ⅲ所示的化合物
取64.02mmol步骤S1制得的式Ⅱ的化合物溶于75mL的甲醇水溶液中，加入70.42mmol氢氧化钠固体，然后升温至60℃，反应3-8h后停止反应，向反应液中加入25mL水，用盐酸调节pH至中性后用乙酸乙酯萃取，随后依次用水和饱和氯化钠各洗涤三次，旋干后得到式Ⅲ所示的化合物8.63g(产率：83％)。
S3：合成式Ⅳ所示的化合物
称取9.25mmol苯肼溶于4mL乙酸溶液中，加入11.10mmol步骤S2制得的式Ⅲ化合物，回流反应2-4h后停止反应。旋干溶剂，加入适量乙酸乙酯，分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥有机相，旋干后得式Ⅳ所示的化合物，棕色油状液体2.00g(产率：92％)。
实施例
实施例1
染料G的合成：
称取4.25mmol式Ⅳ所示的化合物溶于3mL乙腈溶液中，加入6.37mmol碘乙烷，回流反应24h后停止反应。冷却至室温，抽滤，采用乙酸乙酯和叔丁基甲醚的混合溶剂洗涤，得0.86g式A1的化合物，产率：51％；
称取0.383mmol丙二醛二苯胺盐酸盐溶于2mL乙酸酐溶液中，加入0.767mmol式A1的化合物，搅拌均匀后加入1.036mmol乙酸钠，以5℃/min的升温速率升温至130℃，反应30min后停止反应，冷却至室温，将反应液加入到40mL叔丁基甲醚溶液中，析出固体，抽滤，滤饼用乙醇、乙酸乙酯和叔丁基甲醚的混合体系打浆，最终得0.20g染料G，产率：75％；
图1为染料G的高分辨质谱数据图；
图2为染料G的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)；
图3为染料G的核磁碳谱图13CNMR(DMSO-d6)。
实施例2
染料H的合成：
称取4.25mmol式Ⅳ所示的化合物溶于3mL乙腈溶液中，加入6.37mmol碘丙烷，回流反应24h后停止反应。冷却至室温，抽滤，采用乙酸乙酯和叔丁基甲醚的混合溶剂洗涤，得0.82g式A2的化合物，产率：49％。
称取0.383mmol丙二醛二苯胺盐酸盐溶于2mL乙酸酐溶液中，加入0.767mmol式A2的化合物，搅拌后加入1.036mmol乙酸钠，升温至130℃反应30min后停止反应。冷却室温，反应液加入到叔丁基甲醚溶液中，析出固体，抽滤，滤饼用乙醇、乙酸乙酯和叔丁基甲醚的混合体系打浆，最终得0.21g染料H，产率为74％；
图4为染料H的高分辨质谱数据图；
图5为染料H的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)；
图6为染料H的核磁碳谱图13CNMR(DMSO-d6)。
对比例
对比例1：
对比例1的合成方法如下：
S1：称取3.14mmol的2,3,3-三甲基-3H-吲哚溶于3mL乙腈溶液中，加入4.71mmol碘乙烷，回流反应24h后停止反应。冷却至室温，抽滤，采用乙酸乙酯和叔丁基甲醚的混合溶剂洗涤，得0.74g的N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚碘化物，产率：74％。
S2：称取0.383mmol丙二醛二苯胺盐酸盐溶于2mL乙酸酐溶液中，加入0.767mmol的N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚碘化物，搅拌后加入1.036mmol乙酸钠，升温至130℃反应30min后停止反应。冷却室温，反应液加入到叔丁基甲醚溶液中，得到油状固体，柱层析提纯(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，最终得0.12g对比例1，产率为57％；
图7为对比例1的高分辨质谱数据图；
图8为对比例1的核磁氢谱图1HNMR(DMSO-d6)。
对比例2：
市售(迈克生物股份有限公司)血细胞分析用F-Fw染色液。
性能检测试验例
试验例1
对比例1、染料G和染料H的紫外吸收和荧光光物理性质实验
实验方法为：分别将对比例1、染料G、染料H加入到PBS缓冲液(pH＝7.4)中，使染料终浓度为3μM，然后使用紫外荧光一体机(HORIBA)记录紫外吸收光谱与荧光发射光谱。测试的光谱数据经过归一化处理后绘制紫外光谱图与荧光光谱图，结果显示于图9-10中。图9为紫外吸收光谱，图10为荧光发射光谱。
结合图9-10可以看出，对比例1的最大吸收峰在640nm附近，荧光发射峰在660nm附近；染料G和染料H的最大吸收峰在650nm附近，荧光发射峰在675nm附近，可使用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源，使用成本低。
试验例2
对比例1、染料G和染料H的核酸滴定实验
实验方法为：分别将对比例1、染料G、染料H加入到PBS缓冲液(pH＝7.4)中，使染料终浓度为3μM，逐渐向体系中加入小牛胸腺DNA或者酵母RNA使浓度梯度为0-160μg/mL，收集荧光光谱数据，测试的光谱数据经过归一化处理后绘制荧光光谱图，结果显示于图11-12中，图11为对比例1、染料G、染料H最大荧光发射峰处的荧光强度随DNA浓度变化图；图12为对比例1、染料G、染料H最大荧光发射峰处的荧光强度随RNA浓度变化图；
结合图11和图12可以看出，引入苯基后，改变了染料性质，荧光染料对小牛胸腺DNA和酵母RNA均具有不同程度的猝灭，而对比例1的荧光强度不会随着DNA和RNA的增加而猝灭；因此，具有通式I的荧光染料可用于体外核酸分子的检测。
试验例3
染料G和染料H在血细胞分析仪中对血细胞质控品检测实验
实验方法为：将染料G和染料H配置成相同浓度的荧光染色液后，使用迈克原装的F880系列血细胞分析(按仪器说明书的使用方法)对血细胞质控品(水平1、水平2和水平3)进行测试，与迈克原装的F880系列血细胞分析用F-Fw染色液测试结果进行对比，得到9张血细胞散点图，结果显示于图13中。
不同的血细胞的细胞大小和细胞内核酸含量不同，会造成输出的光学信号不一样(侧向散射光、侧向荧光或前向散热光)，借助血细胞分析仪内部的器件，能够把光学信号转换为数字信号，然后再进行算法优化，实现不同细胞的分类和计数。从图13可以看出，染料G和染料H的血细胞散点图与对比例相比，有着高度的相似性，可以将有核红细胞和白细胞区分开来。实现细胞的分类和计数。
试验例4
荧光染料G和荧光染料H在血细胞分析仪中对临床样本检测实验
将荧光染料G和荧光染料H配置的荧光染色液与迈克原装的F880系列血细胞分析用F-Fw染色液按仪器说明书的使用方法对60例18岁以上成年人外周血液样本进行测试，数据列于下表1-2中。
表1荧光染料G、荧光染料H和F-Fw染色液对1-23例样本检测结果
表2荧光染料G、荧光染料H和F-Fw染色液对24-60例样本检测结果
从表1和表2可以看出，具有化学式Ⅰ的荧光染料G和荧光染料H对白细胞、有核红细胞和嗜碱性粒细胞计数与迈克F880仪器配套试剂的测试结果几乎一致。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一类含手性碳的五甲川菁染料，其特征在于，具有通式I的结构
式I中，R1、R2可以相同也可以不同，R1和R2各自独立的选自C1-6烷基、-(CH2)pCOOR3、-(CH2)pOR3或含有R4取代的苄基，
R3为H、C1-6烷基或者苯基；
R4为H、卤素、烷氧基、酰胺基或硝基；
X-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CF3 -、BF4 -或OTs-；
p为1-6。
2.权利要求1所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在80-130℃下，2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃反应4-24h，得到式Ⅴ所示的化合物；
(2)在第二反应溶剂中，在60-140℃下，式Ⅴ所示的化合物与丙二醛二苯胺盐酸盐在第一催化剂作用下进行缩合反应，反应0.5-3h，得到I所示的目标化合物。
3.根据权利要求2所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚采用如下方法制备而成：
在第三反应溶剂和强碱中，在10-100℃下，2-甲基乙酰乙酸乙酯和苄溴进行亲核取代反应，反应时间为6-24h，得到式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯；
在第四反应溶剂中，在10-100℃下，式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯在碱性条件下进行水解脱羧，反应时间为3-24h，得到式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮；
在60-130℃下，式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮与苯肼或苯肼盐酸盐在第二催化剂的作用下发生Fischer吲哚合成反应，反应时间为1-5h，得到式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚。
4.根据权利要求2所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃在第一反应溶剂中进行反应，所述第一反应溶剂选自乙腈或甲苯。
5.根据权利要求2或4所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，所述2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚Ⅳ和N烷基化试剂R1取代的卤代烷烃的摩尔比为1:1-2。
6.根据权利要求2所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述丙二醛二苯胺盐酸盐与式Ⅴ的化合物的摩尔比为1：2-2.5；
所述第二反应溶剂选自乙酸酐或者乙醇；
所述第一催化剂选自对甲苯磺酸、乙酸钠或者哌啶。
7.根据权利要求3所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，在制备式Ⅱ所示的2-苄基乙酰乙酸乙酯过程中，所述2-甲基乙酰乙酸乙酯和苄溴的摩尔比为1:1-2；
所述强碱选自氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠或者叔丁醇钾中的一种或两种；
所述第三反应溶剂选自水、二氯甲烷、乙醇、甲醇、叔丁醇、乙酸乙酯或乙腈中的一种或两种。
8.根据权利要求3所述的含手性碳的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，在制备式Ⅲ所示的3-甲基-4-苯基-2-丁酮的过程中，所述第四反应溶剂选自水、乙醇、甲醇或乙腈中的一种或两种；使用的碱为氢氧化钾或者氢氧化钠；
在制备式Ⅳ所示的2，3-二甲基-3-苄基-3H-吲哚过程中，3-甲基-4-苯基-2-丁酮与苯肼或苯肼盐酸盐的摩尔比为1-2:1，所述第二催化剂选自对甲苯磺酸或乙酸酐；反应溶剂为乙酸或乙醇。
9.权利要求1所述的含手性碳的五甲川菁染料的应用，其特征在于，用于有核红细胞和白细胞分类及计数。
10.一种对可能含有有核红细胞和白细胞分类及计数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1的含手性碳的五甲川菁染料或权利要求2-8任意方法制得的含手性碳的五甲川菁染料配置成荧光染色液；
将所述荧光染色液用于血细胞分析仪，根据染色血细胞后荧光强度的不同，可实现嗜碱细胞和其他白细胞的分类及计数。
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