CN116710505A - 官能化的聚甘氨酸-聚(亚烷基亚胺)共聚物，它们的制备以及它们用于制备阴离子活性成分和效应物质的配制剂或用于复合阴离子活性成分和效应物质的用途 - Google Patents

官能化的聚甘氨酸-聚(亚烷基亚胺)共聚物，它们的制备以及它们用于制备阴离子活性成分和效应物质的配制剂或用于复合阴离子活性成分和效应物质的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有式(I)、式(II)和式(III)的结构单元或式(IV)、式(V)和式(VI)的结构单元的共聚物，‑NR1‑CHR3‑CHR4‑(I)，‑NH‑CO‑CHR7‑(II)，‑NH‑CHR9‑CHR10‑(III)，‑NR1‑CHR3‑CHR4‑CHR5‑(IV)，‑NH‑CO‑CHR7‑CHR8‑(V)，‑NH‑CHR9‑CHR10‑CHR11‑(VI)，其中R1代表式‑CO‑R2、式‑CO‑NH‑R2，式‑CH2‑CH(OH)‑R12或式‑CH2‑CH(NH2)‑R12的残基，R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10和R11彼此独立地代表氢、甲基、乙基、丙基或丁基，和R2和R12是氢或选择的有机基团。这些共聚物的特征在于具有良好的可分解性，并且可例如用于制备活性成分的配制剂或用于复合阴离子活性成分或效应物质。

Description

官能化的聚甘氨酸-聚(亚烷基亚胺)共聚物，它们的制备以及 它们用于制备阴离子活性成分和效应物质的配制剂或用于复 合阴离子活性成分和效应物质的用途
本发明涉及新型共聚物，其可被描述为官能化的聚甘氨酸-聚亚烷基亚胺共聚物，该共聚物的特征在于非常好的可降解性。特别地，本发明涉及通过将聚亚烷基亚胺氧化和然后将在已部分氧化的聚合物主链中的NH基团进行官能化来制备和加工这些共聚物。这些共聚物可特别用于制备活性和效应物质的配制剂以及用于复合阴离子活性和效应物质，特别是遗传物质，例如siRNA、mRNA、DNA和CRISPR/Cas。
生物相容性聚合物代表了用于生物医疗应用(例如药物递送)的极具吸引力的材料。聚(乙二醇)(PEG)是目前用于此类目的最广泛使用的聚合物。由于其高亲水性和所谓的“遮蔽行为”，它在体内几乎不引发免疫应答，从而增加了药品的血液循环时间。然而，PEG有多个缺点，即形成有毒副产物，封存在器官中和刺激抗PEG抗体。
具有短侧链的聚(2-正烷基-2-噁唑啉)(PAOx)显示出类似的亲水性、生物相容性和“遮蔽行为”，并且因此看起来是替代PEG的有希望的候选者，这在它们溶解行为的详细比较中得到了进一步证实(参见Grube,M.；Leiske,M.N.；Schubert,U.S.；Nischang,I.POx asan alternative to PEG？A hydrodynamic and light scatteringstudy.Macromolecules 2018,51,1905-1916)。与PEG不同，PAOx由于其侧链可修饰性而还表现出更大的结构多功能性。
具有较长侧链的PAOx是疏水的并且可用于制备两亲性共聚物、低表面能材料或低粘附性涂层。热和结晶性能也可通过所述PAOx侧链的改变进行调整(参见Hoogenboom,R.；Fijten,M.W.M.；Thijs,H.M.L.；van Lankvelt,B.M.；Schubert,U.S.Microwave-assistedsynthesis and properties of a series of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s.Des.Monomers Polym.2005,8,659-671；Rettler,E.F.J.；Kranenburg,J.M.；Lambermont-Thijs,H.M.L.；Hoogenboom,R.；Schubert,U.S.Thermal,mechanical,andsurface properties of poly(2-N-alkyl-2-oxazoline)s Macromol.Chem.Phys.2010,211,2443-2448；Kempe,K.；Lobert,M.；Hoogenboom,R.；Schubert,U.S.Synthesis andcharacterization of a series of diverse poly(2-oxazoline)s.J.Polym.Sci.,PartA:Polym.Chem.2009,47,3829-3838；Beck,M.；Birnbrich,P.；Eicken,U.；Fischer,H.；Fristad,W.E.；Hase,B.；Krause,H.-J.Polyoxazolines on a lipid chemicalbasis.Angew.Makromol.Chem.1994,223,217-233；Rodríguez-Parada,J.M.；Kaku,M.；Sogah,D.Y.Monolayers and Langmuir-Blodgett films of poly(AT-acylethylenimines)with hydrocarbon and fluorocarbon sidechains.Macromolecules 1994,27,1571-1577；Oleszko-Torbus,N.；Utrata-A.；Bochenek,M.；Lipowska-Kur,D.；Dworak,A.；/>W.Thermal and crystallineproperties of poly(2-oxazoline)s.Polym.Chem.2020,11,15-33；Demirel,A.L.；Tatar,G.P.；Verbraeken,B.；Schlaad,H.；Schubert,U.S.；Hoogenboom,R.Revisiting thecrystallization of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s.J.Polym.Sci.,Part B:Polym.Phys.2016,54,721-729)。Schubert和同事们先前报道了玻璃化转变温度(Tg)随着一系列聚(2-正烷基-2-噁唑啉)(直到聚(2-戊基-2-噁唑啉))的侧链长度增加而降低。对于具有较长侧链的PAOx，观察到具有与侧链长度无关的熔融温度Tm的结晶性能。
然而，PAOx以及PEG被认为是生物不可降解的。对于生物医药和其它领域中的各种应用，生物可降解性将是一项重要性能，例如，为了防止具有超过20,000g mol-1分子量的聚合物在体内积累，以及为了将所述聚合物从有机体中完全除去。解决这个问题的一个策略可能是将水解敏感的基团整合到聚合物主链中，例如酯或酰胺单元。它们可以在例如酸性或酶促条件下发生水解，这可能导致整个聚合物的降解。已经有人研究出将酯基团并入到PAOx主链中的多种途径。最近，已经有人报道了一系列具有侧酰胺键的聚(酯酰胺)的合成，其是通过N-乙酰化-1,4-氧氮杂环庚-7-酮单体的有机催化开环聚合制备的(参见Wang,X.；Hadjichristidis,N.Organocatalytic ring-opening polymerization of N-acylated-1,4-oxazepan-7-ones toward well-defined poly(ester amide)s:biodegradablealternatives to poly(2-oxazoline)s.ACS Macro Lett.2020,9,464-470)。所得聚合物可被认为是交替的聚(酯-co-噁唑啉)，并且因此可被认为是生物可降解的PAOx替代物。在具有不同可降解性的聚(2-烷基-2-噁唑啉)和聚(2-芳基-2-噁唑啉)类似物的系列中，所有聚合物均表现出无定形行为并显示出与它们的不可降解的PAOx对应物相比更低的Tg。
最近，已经有人报道了由相同的以下重复单元组成的聚合物得到了N-乙酰化的聚(氨基酯)大分子单体，所述重复单元是通过2-噁唑啉和丙烯酸的自发两性离子共聚合成的。这些大分子单体的下游氧化还原引发的可逆加成断裂链转移(RRAFT)聚合导致形成生物可降解的梳形聚合物(参见Kempe,K.；de Jongh,P.A.；Anastasaki,A.；Wilson,P.；Haddleton,D.M.Novel comb polymers from alternating N-acylated poly(aminoester)s obtained by spontaneous zwitterionic copolymerization.Chem.Commun.2015,51,16213-16216；de Jongh,P.A.J.M.；Mortiboy,A.；Sulley,G.S.；Bennett,M.R.；Anastasaki,A.；Wilson,P.；Haddleton,D.M.；Kempe,K.Dual stimuli-responsivecomb polymers from modular N-acylated poly(aminoester)-basedmacromonomers.ACS Macro Lett.2016,5,321-325)。
其它方法使用以下过程：将二乙醇胺酰胺化，其导致形成不同的羟乙基琥珀酰胺单体，和随后将这些单体与琥珀酸缩聚，其目的在于类似的聚合物结构(参见Swanson,J.P.；Monteleone,L.R.；Haso,F.；Costanzo,P.J.；Liu,T.；Joy,A.A library ofthermoresponsive,coacervate-forming biodegradable polyesters.Macromolecules2015,48,3834-3842；Gokhale,S.；Xu,Y.；Joy,A.A library of multifunctionalpolyesters with"peptide-like"pendant functionalgroups.Biomacromolecules 2013,14,2489-2493)。
然而，据本发明的发明人所知，尚没有人尝试将酰胺键引入到聚噁唑啉主链中或引入到其它官能化的聚亚烷基亚胺的主链中以改进可降解性。
因此，本发明的一个目的是提供具有改进的可降解性的新型官能化共聚物。
本发明的另一个目的是提供制备这些官能化共聚物的简单方法。
这个目的通过提供以下共聚物得到解决，所述共聚物含有：
5至75摩尔％的式(I)的结构单元，
5至75摩尔％的式(II)的结构单元，和
20至90摩尔％的式(III)的结构单元
-NR1-CHR3-CHR4- (I)，
-NH-CO-CHR7- (II)，
-NH-CHR9-CHR10- (III)，
或提供以下共聚物得到解决，所述共聚物含有：
5至75摩尔％的式(IV)的结构单元，
5至75摩尔％的式(V)的结构单元，和
20至90摩尔％的式(VI)的结构单元
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5-(IV)，
-NH-CO-CHR7-CHR8- (V)，
-NH-CHR9-CHR10-CHR11-(VI)，
其中
R1是式-CO-R2、式-CO-NH-R2，式-CH2-CH(OH)-R12或式-CH2-CH(NH2)-R12的残基，
R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10和R11彼此独立地是氢、甲基、乙基、丙基或丁基，
R2选自氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、-CmH2m-X或-(CnH2n-O)o-(CpH2p-O)q-R6，
R6是氢或C1-C6烷基，
R12选自氢、烷基、烯基、环烷基、芳基或芳烷基，
X选自羟基、烷氧基、氨基、N-烷基氨基、N,N-二烷基氨基、具有至少一个环氮原子的杂环基、胍基、羧基、羧酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基或氨基甲酸酯基，
m是1至18的整数，
n和p彼此独立地是2至4的整数，其中n不等于p，和
o和q彼此独立地是0至60的整数，o或q中的至少一个不等于0，
其中所述百分比是基于式(I)、(II)和(III)的结构单元或式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的总量计的。
这些共聚物可由易于获得的聚(亚烷基亚胺)开始制备。
因此，本发明在第一变型方案中还涉及制备这些共聚物的方法，该方法包括以下步骤：
i)使优选量为至少90摩尔％的含有式(Ia)或式(IVa)的重复结构单元的聚亚烷基亚胺与氧化试剂反应，从而获得含有式(Ia)和式(II)的结构单元或含有式(IVa)和式(V)的结构单元的共聚物
-NH-CR3H-CR4H- (Ia)，
-NH-CO-CR7H- (II)，
-NH-CR3H-CR4H-CR5H- (IVa)，
-NH-CO-CR7H-CR8H- (V)，
其中R3、R4、R5、R7和R8具有上文限定的含义，和
ii)使步骤i)的共聚物与式(VII)的酰基衍生物或与式(VIII)的异氰酸酯或与式(IX)的环氧化物或与式(X)的氮丙啶进行反应以形成含有式(I)、(II)和(III)的上文限定的结构单元或式(IV)、(V)和(VI)的上文限定的结构单元的共聚物
R2-CO-R13 (VII)，
R2-NCO (VIII)，
其中R2和R12具有上文限定的含义，并且
R13代表离去基团，特别是氟、氯、溴、碘或另一种活化的羧酸衍生物的离去基团。
另外，在第二个实施方案中，本发明涉及制备这些共聚物的方法，该方法包括以下步骤：
iii)使含有式(I)的重复结构单元的聚噁唑啉或含有式(IV)的重复结构单元的聚噁嗪发生部分水解以形成含有式(I)和式(III)的重复结构单元或式(IV)和式(VI)的重复结构单元的共聚物
-NR1-CHR3-CHR4-(I)，
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5-(IV)，
-NH-CHR9-CHR10-(III)，
-NH-CHR9-CHR10-CHR11-(VI)，
其中R1、R3、R4、R5、R9、R10和R11具有上文限定的含义，和
iv)使得自步骤iii)的共聚物与氧化试剂进行反应，由此获得含有式(I)、式(II)和式(III)的结构单元或含有式(IV)、式(V)和式(VI)的结构单元的共聚物
-NH-CO-CHR7- (II)，
-NH-CO-CHR7-CHR8- (V)，
其中R7和R8具有上文限定的含义。
根据本发明，已经发现可通过简单的合成路线制备可降解的官能化聚甘氨酸-聚亚烷基亚胺共聚物，其具有整合到聚合物主链中的酰胺键。为此，可将聚亚烷基亚胺部分氧化，并可将所得产物通过与环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯或活化的酯或酰卤进行反应而官能化。在一个替代性的合成路线中，可将聚噁唑啉或聚噁嗪部分水解以得到聚亚烷基亚胺单元，其可在随后的步骤中被部分氧化。
在根据本发明的方法的第一变型方案中使用的聚亚烷基亚胺通常含有至少90摩尔％的式(Ia)或式(IVa)的重复结构单元，并且是可商购获得的或者可通过水解以下物质获得：在2-位取代的聚(2-噁唑啉)(POx)，特别是PEtOx，或在2-位取代的聚(2-噁嗪)。
作为水解的起始材料，通常使用以下POx，其在聚合物中含有至少20摩尔％，优选至少50摩尔％的衍生自2-噁唑啉的重复结构单元。尽管可商购获得的聚亚烷基亚胺是支化的，但通过POx的水解获得的是线性聚亚烷基亚胺。
在根据本发明的方法的第二变型方案中，聚噁唑啉或聚噁嗪的水解也可以部分进行并导致含有式(I)和(III)的重复结构单元或含有式(IV)和(VI)的重复结构单元的共聚物。可以将这些共聚物氧化，直接导致本发明的共聚物。在这个方法变型方案中，再酰化通常被省略。
后聚合的优选简单合成路线是经由聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEtOx)的连续水解，部分氧化和再酰化。使用PEtOx或相应的聚(2-烷基-2-噁唑啉)作为明确限定的起始材料是有利的，因为这些聚合物可通过可商购获得的单体的阳离子开环聚合(CROP)获得。随后PEtOx或相应的聚(2-烷基-2-噁唑啉)在酸性条件下的水解导致形成线性聚(亚乙基亚胺)(PEI)是本领域技术人员所充分研究和已知的，并且其还可以部分地进行。然而，PEI是不利的，因为它具有细胞毒性，并且与PEtOx类似，它具有不可降解性。Englert等人报道了用过氧化氢将线性PEI受控氧化以通过将酰胺基团引入到PEI主链中来提高可降解性(参见Enhancingthe biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine)through controlled oxidation；Macromolecules2015,48,7420-7427)。所得的结构对应于聚(甘氨酸)的重复单元，并且因此该聚合物可被认为是聚(亚乙基亚胺-co-甘氨酸)(本文中称为oxPEI)。由于其具有额外的水解敏感的酰胺基团，因此所述聚合物与其它有细胞毒性的PEI相比，不仅显示出增加的可降解性，而且还显示出改进的生物相容性。
根据本发明，用随后的再酰化步骤或通过与异氰酸酯或与环氧化物或与氮丙啶进行反应将oxPEI官能化。因此，可以使用同系的聚亚丙基亚胺(PPI)代替PEI。将oxPEI用酰化试剂(例如酰卤)再酰化使得可以制备聚(2-正烷基-2-噁唑啉-stat-甘氨酸)(本文中称为dP(AOx-co-EI))。由于在聚合物主链中存在额外的酰胺基团，因此怀疑并且实验也证明，所得的dP(AOx-co-EI)表现出与它们的聚(2-正烷基-2-噁唑啉)等价物相比提高的可降解性。PEI与活化的羧酸衍生物(例如酰氯、酸酐或N-羟基琥珀酰亚胺酯)的类似酰化反应之前已经以各种方式报道(参见Mees,M.A.；Hoogenboom,R.Functional poly(2-oxazoline)s bydirect amidation of methyl ester side chains.Macromolecules 2015,48,3531-3538；Sedlacek,O.；Monnery,B.D.；Hoogenboom,R.Synthesis of defined high molarmass poly(2-methyl-2-oxazoline).Polym.Chem.2019,10,1286-1290；Englert,C.；Tauhardt,L.；Hartlieb,M.；Kempe,K.；Gottschaldt,M.；Schubert,U.S.Linear poly(ethylene imine)-based hydrogels for effective binding and release ofDNA.Biomacromolecules 2014,15,1124-1131；Englert,C.；Trutzschler,A.K.；Raasch,M.；Bus,T.；Borchers,P.；Mosig,A.S.；Traeger,A.；Schubert,U.S.Crossing the blood-brain barrier:glutathione-conjugated poly(ethylene imine)for genedelivery.J.Controlled Release 2016,241,1-14；和Englert,C.；Prohl,M.；Czaplewska,J.A.；Fritzsche,C.；Preussger,E.；Schubert,U.S.；Traeger,A.；Gottschaldt,M.D-Fructose-decorated poly(ethylene imine)for human breast cancer celltargeting.Macromol.Biosci.2017,17,1600502)。
尚没有人描述oxPEI或已氧化的聚(亚丙基亚胺)(oxPPI)的再官能化。
在再官能化过程中，式(VII)的酰基衍生物或式(VIII)的异氰酸酯或式(IX)的环氧化物或式(X)的氮丙啶的量应被选择为使得在所得共聚物中的式(III)或式(VI)的结构单元的比例在20至90摩尔％之间。
在本说明书的上下文中，“共聚物”的意思是以某些单元(单体单元或重复单元)的重复为特征的上述有机化合物。根据本发明的共聚物由至少三种类型的不同重复单元组成。聚合物是通过其中形成共价键(聚合)的单体的化学反应制备的，并通过连接所聚合的单元形成所谓的聚合物主链。它可具有侧链，其中官能团可位于该侧链上。根据本发明的共聚物由至少三种不同的单体单元组成，这些单体单元可以无规地，作为梯度，交替地或作为嵌段排列。如果所述共聚物具有部分疏水性能，则它们可以在水性环境中形成纳米级结构(例如纳米颗粒、胶束、囊泡)。
在本说明书的上下文中，“水溶性化合物”或“水溶性共聚物”是在25℃下溶解度为至少1g/L水的化合物或共聚物。
在本说明书的上下文中，“活性成分”是对活的有机体施加期望效果的化合物或化合物混合物。这些可以例如是药物活性成分或农用化学活性成分。活性成分可以是低分子量或高分子量有机化合物。优选地，所述活性成分是分子量较高的药物活性物质，由此得自核酸的亲水活性成分，特别是得自潜在治疗有用的核酸(例如小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、质粒DNA)的亲水活性成分是特别令人感兴趣的。
如本文中使用的，术语“活性药物成分”的意思是表现出药理作用的任何无机或有机分子、物质或化合物。术语“活性药物成分”与术语“药品”在本文中是同义使用的。
在本说明书的上下文中，术语“效应物质”被理解为意思是添加到配制剂中以赋予其特定的额外性能和/或促进其加工的化合物或化合物混合物。在本说明书的上下文中，术语“效应物质”和“助剂和添加剂”是同义使用的。
在本说明书的上下文中，“助剂和添加剂”是添加到配制剂中以赋予其特定的额外性能和/或促进其加工的物质。助剂和添加剂的实例是示踪剂、造影剂、载体、填料、颜料、染料、香料、润滑剂、UV稳定剂、抗氧化剂或表面活性剂。特别地，“助剂和添加剂”要被理解为是任何药理学相容的和治疗上有用的物质，其不是药物活性成分，但其可以与在药物组合物中的药物活性成分一起配制，以影响，特别是改进所述药物组合物的定性性能。优选地，所述助剂和/或添加剂不施加任何药理作用，或者关于预期的治疗，不施加任何显著的药理作用或至少不施加任何不希望的药理作用。
在本说明书的上下文中，“聚合物颗粒”的意思是指颗粒形式的根据本发明的共聚物，其可能还含有其它成分。所述颗粒可以液体形式存在，其分散在亲水性液体中，或者所述颗粒可以固体形式存在，其要么分散在亲水性液体中，要么以粉末形式存在。所述颗粒的尺寸可通过诸如显微法的视觉方法测定；对于纳米级的颗粒尺寸，可以使用光散射或电子显微法。所述聚合物颗粒的形状可以是任意的，例如球形、椭球形或不规则的。所述聚合物颗粒还可以形成多个初级颗粒的聚集体。优选地，根据本发明的共聚物的颗粒以纳米颗粒的形式存在。除了所述共聚物外，所述颗粒还可含有其它组分，例如活性成分或助剂或添加剂。
在本说明书的上下文中，术语“颗粒”或“微粒(corpuscle)”是同义使用的。
在本说明书的上下文中，术语“纳米颗粒”是指直径小于1μm的颗粒并且其可由一种或多种分子组成。它们的特征通常是非常高的表面体积比，并且因此提供非常高的化学反应性。纳米颗粒可由根据本发明的共聚物组成，或者除了这些共聚物外还含有其它组分，例如活性成分或助剂或添加剂。
根据本发明的共聚物可以作为线性聚合物存在，或者它们也可以是支化共聚物。线性共聚物例如是通过以下过程形成的：PEtOx的连续水解，然后部分氧化成oxPEI并再酰化成dP(AOx-co-EI)。支化共聚物是例如通过以下过程形成的：将已知是支化的可商购获得的PEI部分氧化成oxPEI，然后再官能化，例如再酰化成dP(AOx-co-EI)。
根据本发明的共聚物的溶解度可受到与合适的单体的共聚合和/或受到官能化的影响。这些技术是技术人员已知的。
根据本发明的共聚物可包含宽范围的摩尔质量。典型的摩尔质量(Mn)范围为1,000至500,000g/mol，特别是1,000至50,000g/mol。这些摩尔质量可通过溶解的聚合物的1H-NMR波谱法来测定。特别地，可以使用分析超速离心机或色谱方法(例如尺寸排阻色谱法)来测定所述摩尔质量。
优选的根据本发明的共聚物具有在1,000至50,000g/mol范围内，特别是3,000至20,000g/mol范围内的平均分子量(数均分子量)，其是通过1H-NMR波谱法或通过使用分析超速离心机测定的。优选地，这些是线性共聚物。根据本发明的支化共聚物优选具有较高的平均摩尔质量，例如在50,000至500,000g/mol，特别是80,000至200,000g/mol范围内的Mn。
式(I)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔比例为基于所述式(I)、(II)和(III)的结构单元的总量计的5至75摩尔％，优选20至60摩尔％。
式(II)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔比例为基于所述式(I)、(II)和(III)的结构单元的总量计的5至75摩尔％，优选10至60摩尔％。
式(III)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔比例为基于所述式(I)、(II)和(III)的结构单元的总量计的20至90摩尔％，优选21至90摩尔％，和特别是30至80摩尔％。
式(IV)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔比例为基于所述式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的总量计的5至75摩尔％，优选20至60摩尔％。
式(V)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔分数为基于所述式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的总量计的5至75摩尔％，优选10至60摩尔％。
式(VI)的结构单元在根据本发明的共聚物中的摩尔比例为基于所述式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的总量计的20至90摩尔％，优选21至90摩尔％，和特别是30至80摩尔％。
R1是式-CO-R2的，或式-CO-NH-R2的，或式-CH2-CH(OH)-R12的，或式-CH2-CH(NH2)-R12的残基，优选式-CO-R2的残基。
R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10和R11彼此独立地表示氢、甲基、乙基、丙基或丁基，优选氢、甲基或乙基，并且特别是氢。
R2是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、-CmH2m-X或-(CnH2n-O)o-(CpH2p-O)q-R6，优选氢、C1-C18烷基、环己基或苯基，特别是C1-C18烷基，并且非常优选C4-C14烷基。
R6是氢或C1-C6烷基，优选氢或甲基。
R12是氢、烷基、烯基、环烷基、芳基或芳烷基，优选氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、环己基或苯基，特别是氢、C1-C6烷基或C2-C3烯基。
m是1至18，优选2至12的整数。
X是羟基、烷氧基、氨基、N-烷基氨基、N,N-二烷基氨基、具有至少一个环氮原子的杂环基、胍基、羧基、羧酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基或氨基甲酸酯基。
在本说明书的上下文中，杂环基基团是具有五至七个环原子的环状饱和或不饱和单价残基，它的一至三个环原子是除碳以外的杂原子，其中的至少一个是氮原子，优选选自氮、氧或硫的杂原子，并且其中其余的环原子是碳原子。杂环基基团还可以形成具有两个或更多个杂环的环体系，所述杂环是通过共价键连接的，例如联吡啶残基，或者所述杂环是稠合的，例如茚基残基。另外，杂环基基团可以是以下环体系，其中存在一个或多个连接于烃环的杂环，例如苯并咪唑环。杂环基基团可以是芳族的或非芳族的。
杂环基基团可以由环组成。实例包括哌啶基、吡啶基、吗啉基或咪唑基残基。
杂环基基团可以由多重环组成。实例为苯并咪唑或茚基残基。
n和p独立地是2至4的整数，其中n不等于p。优选地，n是2和p是3。
o和q独立地是0至60的整数，其中o或q中的至少一个不是0。优选地，o和q彼此独立地是1至40，特别是2至10。
残基R2和R12可表示烷基。这些通常是具有一至二十个碳原子的烷基基团，它们可以是直链或支链的。实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基或二十烷基。甲基、乙基和丙基是优选的。
残基R12可以指烯基。这些通常是具有二至二十个碳原子的烯基基团，它们可以是直链或支链的。双键可位于链中的任何位置，但优选在α位。烯基残基的实例是乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基或二十碳烯基。乙烯基和烯丙基是特别优选的。
残基R2和R12可表示环烷基。这些通常是具有五至六个环碳原子的环烷基基团。环己基是特别优选的。
残基R2和R12可表示芳基。这些通常是具有五至十个环碳原子的芳族烃残基。优选的是苯基。
残基R22和R12可表示芳烷基。这些通常是通过亚烷基基团连接于所述分子其余部分的芳基基团。优选的是苄基。
残基X可以指烷氧基。这些通常是C1-C6烷氧基基团。优选的是乙氧基，并且尤其是甲氧基。
残基X可以指氨基，N-烷基氨基或N,N-二烷基氨基。所述烷基基团通常是C1-C6烷基基团。优选的是乙基，并且特别是甲基。
残基X可以指具有至少一个环氮原子的杂环基。优选的是哌啶基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、吗啉基、咪唑基、苯并咪唑基、腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。
残基X可以是羧酸酯基(-COOR)、磺酸酯基(-SO3R)、硫酸酯基(-SO4R)或氨基甲酸酯基(-NR'COOR或-OCONRR')(R和R'各自是单价有机残基)。这些通常是羧酸、磺酸、硫酸或氨基甲酸与脂族醇形成的酯，特别是与脂族C1-C6醇形成的酯。优选的是乙基酯和特别是甲基酯。
优选的是含有15至60摩尔％的式(I)的结构单元、10至60摩尔％的式(II)的结构单元和25至75摩尔％的式(III)的结构单元的共聚物。
此外，还优选其中R1是式-CO-R2的残基的共聚物。
此外，还优选其中R2是C1-C18烷基，特别是C1-C6烷基，和非常优选C1-C2烷基的共聚物。
进一步优选的是其中R2是C3-C18烷基，特别是C7-C12烷基的共聚物。
另一组优选的共聚物的特征在于R2是C1-C18烷基和R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10和R11是氢。
另外，其中R6是氢或甲基的共聚物是优选的。
进一步优选的共聚物的特征在于R12是C1-C18烷基或C2-C18烯基，特别是甲基、乙基、乙烯基或烯丙基。
进一步优选的共聚物的特征在于n＝2和p＝3。
本发明的共聚物可由式(I)、(II)和(III)的结构单元组成或由式(IV)、(V)和(VI)的结构单元组成，或者可另外还含有其它结构单元，该其它结构单元衍生自能够与用于制备聚亚烷基亚胺或聚噁唑啉的单体共聚的单体。这些其它结构单元基于所述共聚物的总质量的比例通常为最高至25摩尔％。这些其它结构单元可以无规分布或以嵌段形式排列在所述共聚物中。
优选的根据本发明的共聚物的特征在于，它们含有基于其总质量计至少90摩尔％，特别是至少95摩尔％的式(I)、式(II)和式(III)的结构单元或式(IV)、式(V)和式(VI)的结构单元。
根据本发明的共聚物具有通常在制备聚(噁唑啉)或聚(亚烷基亚胺)的过程中形成的末端基团。这些末端基团可通过官能化进行改性。为此所需的技术是本领域技术人员已知的。
本发明的共聚物的聚噁唑啉或聚噁嗪起始材料的ω末端基团的实例是卤素原子，例如氟、氯、溴或碘；或叠氮基团-N3；或氟代(烷基)磺酸酯基团，例如九氟丁磺酸酯基团-OSO2C4F9、三氟甲烷磺酸酯基团-OSO2CF3或氟磺酸酯基团-OSO2F；或芳基或烷基磺酸基团，例如甲苯磺酰基基团CH3-C6H4-SO2-或甲磺酰基基团CH3-SO2-；未取代的、单或双取代的氨基基团-NH2、-NHR或-NR2(其中R＝单价有机残基)，羟基基团-OH，硫醇基团-SH，或酯基团-OCOR，硫代酯基团-SCOR；邻苯二甲酰亚胺基团或氰基基团-CN以及可通过修饰这些末端基团获得的其它官能团。根据本发明的共聚物含有这些残基作为末端基团，或者可以含有这些残基的水解和/或氧化产物作为末端基团。
根据本发明的共聚物可通过所述末端基团共价连接于其它活性或效应物质。
根据本发明的共聚物可如上所述的那样通过聚亚烷基亚胺的部分氧化和通过已氧化产物的再官能化来制备，所述再官能化是通过与环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、活化的羧酸或酰卤进行反应实现的。
所述氧化优选是在溶液中进行的，特别是在水溶液或醇水溶液中进行的。可将本身已知的氧化剂用作氧化试剂。实例包括过氧化合物、次氯酸化物、氯或氧，尤其是过氧化氢。
优选地，使用过氧化合物。实例是过氧化氢、过酸、有机过氧化物或有机氢过氧化物，特别是过氧化氢。
优选的方法是其中所使用的氧化试剂是过氧化氢的那些方法。
氧化试剂的量被选择为使得在所述聚合物主链中形成所需比例的被氧化的结构单元。
反应温度通常在10至80℃之间，特别是在20至40℃的范围内。
氧化的反应时间通常在5分钟至5天之间。
已氧化产物的再官能化是通过与如上所述的式(VII)的酰基衍生物或与如上所述的式(VIII)的异氰酸酯或与如上所述的式(IX)的环氧化物或与如上所述的式(X)的氮丙啶进行反应实施的。
合适的酰基衍生物的实例是酰基卤、羧酸酐或借助于已知偶联试剂活化的羧酸，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、二环己基碳二亚胺酯(DCC酯)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺酯(EDC酯)。
合适的异氰酸酯的实例是单烷基异氰酸酯，例如甲烷异氰酸酯或乙烷异氰酸酯、环己基异氰酸酯或苯基异氰酸酯。
合适的环氧化物的实例是环氧乙烷、环氧丙烷、1,2-环氧丁-3-烯或1,2-环氧戊-4-烯。
合适的氮丙啶的实例是氮杂环丙烷、1,2-氮杂丙烷、1,2-氮杂丁-3-烯或1,2-氮杂戊-4-烯。
反应温度通常在10至80℃之间，特别是在20至40℃范围内。
在再官能化过程中，反应时间通常在5分钟至5天之间，特别是在12至48小时之间。
优选地，所用的聚(亚烷基亚胺)是通过聚(2-噁唑啉)，尤其是聚(2-烷基-2-噁唑啉)的碱水解或特别是酸水解获得的共聚物。这些共聚物是线性的，并且可用作已明确限定的起始材料，其衍生自可通过可商购单体的CROP获得的聚合物。
聚(噁唑啉)是公知的化合物。它们通常通过2-噁唑啉在溶液中和在引发剂的存在下进行阳离子开环聚合来制备。引发剂的实例包括亲电试剂，例如芳族磺酸的酯，脂族磺酸或羧酸的盐或酯，或芳族卤素化合物。多官能亲电试剂也可用作引发剂。除了线性聚(噁唑啉)外，还可以形成支化或星形的分子。优选的引发剂的实例是芳基磺酸的酯，例如甲苯磺酸甲酯，烷磺酸的酯，例如三氟甲磺酸甲酯，或单溴或二溴甲基苯。所述聚合通常在极性非质子溶剂(例如乙腈)中进行。
制备根据本发明的聚(噁唑啉)的噁唑啉是在碳原子2和氮原子之间具有C＝N双键的2-噁唑啉(4,5-二氢噁唑)。它们可以在2-、4-和/或5-碳原子上，优选在2-碳原子上被取代。
优选地，使用在2-位含有取代基的2-噁唑啉。这样的取代基的实例是甲基或乙基。
除了2-噁唑啉外，还可在用作根据本发明的起始材料的聚(噁唑啉)的制备中使用能够与2-噁唑啉共聚的其它单体。
代替噁唑啉，还可以使用2-噁嗪制备同系的聚(噁嗪)。
聚(噁唑啉)的水解优选是在溶液中进行的，特别是在水溶液或醇水溶液中进行的。作为酸，可以使用无机或有机酸。优选地，使用矿物酸。实例是盐酸、硫酸或硝酸，优选盐酸。合适的碱包括碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾。
反应温度通常在20至180℃之间，尤其是在70至130℃范围内。
酸水解的反应时间通常在5分钟至24小时之间。
因此，优选其中通过聚(噁唑啉)的水解，特别是酸水解获得在步骤i)中使用的聚亚烷基亚胺的方法。
根据本发明的共聚物可用于制备含有药物或农用化学活性成分的配制剂。
由于它们良好的生物可降解性，它们非常适合于在药物递送领域中的应用。这些应用也在本发明的范围内。
根据本发明的共聚物可以是水溶性的或非水溶性的，这取决于它们的官能化。用甲酰基、乙酰基-丙酰基或丁酰基基团官能化的共聚物通常是水溶性的。另一方面，用较长的烷酰基链官能化的共聚物不溶于水。
非水溶性的根据本发明的共聚物可以分散在亲水性液体中的形式存在，例如作为乳液或悬浮液。
优选地，根据本发明的共聚物是颗粒的形式，特别是纳米颗粒的形式。
本发明因此还涉及包含上述共聚物的颗粒，特别是纳米颗粒。
优选的是平均直径D50为小于1μm，优选为20至500nm的纳米颗粒。
含有一种或多种药物或农用化学活性成分的颗粒是特别优选的。
除了本发明的共聚物之外，特别优选的颗粒还含有至少一种药物活性成分以及合适的助剂和添加剂。
所述颗粒可作为粉末以固体形式存在，或者它们可以分散在亲水溶剂中的形式存在，所述颗粒以液体形式或，特别地，以固体形式存在于分散介质中。
优选地，所述颗粒在含有水和/或能与水混溶的化合物的液体中形成分散相。
颗粒在分散体中的比例可覆盖很宽的范围。典型地，颗粒在分散介质中的比例为0.5至20重量％，优选1至5重量％。
根据本发明的颗粒可通过沉淀来制备，优选通过纳米沉淀来制备。为此目的，将由于存在疏水基团而几乎没有或没有亲水性的根据本发明的共聚物溶解在能与水混溶的溶剂(例如丙酮)中。将该溶液滴入到亲水性分散介质中。这优选在剧烈搅拌下完成。这可促进较小颗粒的产生。所述共聚物以精细分散的形式沉积在分散介质中。
或者，根据本发明的颗粒还可以通过乳化来制备，优选通过纳米乳化来制备。为此目的，将由于存在疏水基团而几乎没有或没有亲水性的根据本发明的共聚物溶解在不能与水混溶的溶剂(例如二氯甲烷或乙酸乙酯)中。将该溶液与亲水性分散介质组合，其优选形成两个液相。然后，通过能量输入，优选通过用超声波进行超声处理将该混合物乳化。
除了根据本发明的共聚物之外，在其分散在分散介质中的过程中还可以存在一种或多种活性成分和/或一种或多种辅助物质和添加剂。或者，可以在将所述共聚物分散在亲水性液体中之后添加这些活性成分和/或辅助物质和添加剂。
所述聚合物颗粒与所述亲水性液体的分离可以不同方式进行。实例包括离心、超滤或透析。
根据本发明制备的聚合物分散体可在制备后被进一步纯化。常用的方法包括通过透析、超滤、过滤或离心进行纯化。
根据本发明的共聚物可以很好地用于与阴离子化合物形成复合物。这种复合物可以是溶解的形式，但优选是颗粒的形式，并且特别是纳米颗粒的形式。
本发明因此还涉及上述共聚物和具有阴离子基团的化合物的复合物，所述具有阴离子基团的化合物例如具有羧基基团、硫酸根基团、磺酸根基团或磷酸根基团的化合物。
本发明还涉及颗粒，特别是纳米颗粒，其含有上述共聚物和具有阴离子基团的化合物，所述具有阴离子基团的化合物例如具有羧基基团、硫酸根基团、磺酸根基团或磷酸根基团的化合物。
特别地，核酸或蛋白质可被用作具有阴离子基团的化合物。
特别优选地，本发明涉及含有由核酸和含有上述式(I)、(II)和(III)的结构单元或式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的共聚物形成的复合物的颗粒。
在根据本发明的复合物和颗粒中，DNA和/或RNA及其修饰物可被用作核酸。
可以使用任何DNA类型。实例包括A-DNA、B-DNA、Z-DNA、mtDNA、反义DNA、细菌DNA和病毒DNA。
还可以使用任何RNA类型。实例包括hnRNA、mRNA、tRNA、rRNA、mtRNA、snRNA、snoRNA、scRNA、siRNA、miRNA、反义RNA、细菌RNA和病毒RNA。
在本发明的复合物和颗粒中，也可以使用DNA和RNA的组合。
假设根据本发明的颗粒含有核酸共聚物复合物，其分布在所述颗粒的整个体积上。与先前已知的具有明显核壳结构且在外壳中具有一定浓度的核酸-聚合物复合物的颗粒相反，在根据本发明的颗粒中，在所述纳米颗粒的内部和外部区域中都存在核酸-共聚物复合物。这样的颗粒在下文中也被称为“聚合复合物(polyplexes)”。
根据本发明的复合物和颗粒可通过它们的N/P比率来表征。这是指在所述共聚物中的碱性氮原子与在所述核酸中磷酸根基团的摩尔比率。
在根据本发明的颗粒中的N/P比率可在宽范围内变化。典型地，在根据本发明的颗粒中的N/P比率在1至200之间，优选在2.5至100之间，更优选在5至50之间，和最优选在10至30之间。
优选的根据本发明的颗粒具有通过DLS测定的最高至50μm的直径。优选的是具有借助于DLS测定的直径在50至1000nm之间的纳米颗粒。
优选的根据本发明的颗粒不含任何辅助物质或添加剂，特别是不含保护性胶体和/或表面活性剂。
根据本发明的含有聚合复合物的颗粒可通过沉淀来制备。为此目的，将由于存在极性基团而取决于pH值具有亲水性的根据本发明使用的阳离子共聚物溶解在水中或溶解在水性缓冲溶液中。将所述水溶液的pH值例如通过使用乙酸盐缓冲液或另一种合适的缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液调整为3至6.5。此外，将所述核酸溶解在水中，该核酸水溶液的pH优选被调整到6.5至8.5之间的值，特别优选调整到6.8至7.5之间的值。含有HEPES，TRIS或仅含有盐的缓冲溶液特别适用于此目的。将两种溶液合并，其中将核酸的量和阳离子共聚物的量选择为使得能够获得所需的N/P比率。在混合所述两种溶液后，将该混合物例如搅动短的时间，例如2至20秒之间。这可通过搅拌和/或通过涡旋来完成。优选地，将所得的颗粒在进一步使用前放置一段时间，例如5至20分钟，以允许在所述聚合物和核酸之间的键合。根据本发明的颗粒以精细分散的形式沉淀在所述分散介质中。
除了所述阳离子共聚物和所述核酸之外，一种或多种辅助物质和添加剂也可以在它们的沉淀过程中存在于所述分散介质中。或者，可以在将所述核酸-共聚物复合物分散在水相中之后添加这些辅助物质和添加剂。
将水用作分散介质。可以向其中添加缓冲物质、盐、糖或酸和碱以调节所需的pH或渗透压。
根据本发明的颗粒非常适合于从细胞进行基因转移，即将核酸引入到细胞中。为此目的，将含有核酸的颗粒添加到单个细胞、组织或细胞培养物中，并通过内吞作用被细胞吸收。
本发明还涉及上述颗粒用于将基因转移到细胞中，即用于将核酸引入到细胞中的用途。
以下实施例示例性说明了本发明，而不限制本发明。
材料
除非另有说明，否则所有化学品和溶剂均从商业供应商处购买，并且无需进一步纯化即可使用。2-乙基-2-噁唑啉(EtOx，99+％)和三乙胺(NEt3，99.7％)购自AcrosOrganics。将2-乙基-2-噁唑啉经氢化钙干燥，并在氩气气氛下蒸馏。甲苯磺酸甲酯(MeOTs，98％)得自Sigma Aldrich。甲苯磺酸甲酯经氧化钡干燥，并在氩气气氛下蒸馏。盐酸(37％)得自Fisher Chemicals。过氧化氢水溶液(30重量％)得自Carl Roth。乙酰氯(约90％)得自Merck Schuchardt。丙酰氯(>98.0％)购自Tokyo Chemical Industry(TCI)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈在溶剂纯化体系(得自M Braun的MB-SPS-800)中干燥。
测量的实施
质子(1H)核磁共振(NMR)光谱在Bruker AC 300MHz或Bruker AC 400MHz波谱仪上测量。在室温下使用D2O或d4-甲醇作为溶剂进行测量。化学位移(δ)以相对于剩余的非氘化溶剂共振信号的百万分率(ppm)报道。红外(IR)波谱法在Shimadzu IRAffinity-1CE***上进行，该***配备有用于扩展范围测量的Quest ATR单反射金刚石晶体比色皿。
尺寸排阻色谱法(SEC)使用Agilent 1200-系列***在N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中进行，所述***配备有PSS脱气器、G1310A泵、G1329A自动进样器、Techlab烘箱、G1362A折射率检测器(RID)和PSS GRAM-guard/30/柱(10μm颗粒尺寸)。使用含有0.21重量％LiCl的DMAc作为洗脱液。流速为1ml min-1，和烘箱温度为40℃。为了计算分子量，使用范围为400至1,000,000g mol-1的聚苯乙烯(PS)标准品。
通用合成方法
聚(2-乙基-2-噁唑啉)，PEtOx的合成。
通过EtOx的阳离子开环聚合(CROP)合成PEtOx。在放大批量方法中，在10L Normag反应器中将MeOTs(124g，0.665mol)和EtOx(3965g，40.00mol，60.2当量)在氩气气氛下溶解在干燥的MeCN(5860ml)中以实现60:1的单体与引发剂比率[M]:[I]。在回流条件下6.5小时的反应时间后，用270ml去离子水终止聚合。在移除等分试样以通过1H NMR波谱法测定单体转化率(99.7％)后，减压下除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(20L)中并用饱和碳酸氢钠水溶液(10L)和氯化钠水溶液(2×10L)洗涤。将有机相经硫酸钠(15kg)和硫酸镁(4kg)的混合物干燥并在减压下除去溶剂。最后，将产物真空干燥14天(产量：3848g)，并通过1H-NMR波谱法(300MHz，D2O)和SEC进行分析。
Mn,理论＝6000g mol-1；Mn,NMR＝6300g mol-1；DP＝60。
线性聚(亚乙基亚胺)，PEI的合成。
PEI的合成是通过基于先前发表的方法的经调整的程序进行的(Van Kuringen,H.P.；Lenoir,J.；Adriaens,E.；Bender,J.；De Geest,B.G.；Hoogenboom,R.Partialhydrolysis of poly(2-ethyl-2-oxazoline)and potential implications forbiomedical applications？Macromol.Biosci.2012,12,1114-1123；Tauhardt,L.；Kempe,K.；Knop,K.；E.；/>M.；Schubert,S.；Fischer,D.；Schubert,U.S.Linearpolyethyleneimine:Optimized synthesis and characterization-On the way to"pharmagrade"batches.Macromol.Chem.Phys.2011,212,1918-1924)。将PEtOx(80.0g，12.5mmol)溶解在盐酸水溶液(6M，600ml)中，并加热到90℃ 24小时。在减压下除去挥发物，并将残留物溶解在去离子水(1600ml)中。分批加入NaOH水溶液(3M，300mL)以使pH达到10，从而导致聚合物的沉淀。随后，过滤掉所述聚合物并通过在水(800mL)中重结晶进行纯化。获得的PEI为白色固体(产量：47.5g)。
1H NMR(300MHz,CD3OD)：水解程度(DH)＝99％。
聚(亚乙基亚胺-stat-甘氨酸)，oxPEI的合成。
oxPEI的合成是通过根据Englert等人的经调整的方法进行的(Englert,C.；Hartlieb,M.；Bellstedt,P.；Kempe,K.；Yang,C.；Chu,S.K.；Ke,X.；J.M.；Ono,R.J.；Fevre,M.；Wojtecki,R.J.；Schubert,U.S.；Yang,Y.Y.；Hedrick,J.L.Enhancing thebiocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine)throughcontrolled oxidation.Macromolecules 2015,48,7420-7427)。将PEI(45.0g，17.0mmol)在搅拌下溶解在甲醇(1100ml)中，并滴加过氧化氢水溶液(72ml，30重量％，每胺单位0.7当量)。在室温下搅拌3天后，减压除去溶剂，并将产物在室温下真空干燥7天，和在70℃下干燥1天。获得的oxPEI为棕色固体(产量：29.1g)。
1H NMR(300MHz,D2O)：氧化程度(DO)＝54％。
聚(2-正烷基-2-噁唑啉-stat-甘氨酸)，dP(AOx-co-EI)的通用合成方法。
将oxPEI在70℃下在真空下预干燥2小时，并然后在氩气气氛下溶解在干燥的DMF(每g聚合物6ml)中。添加三乙胺(每胺单位1当量)，然后滴加在干燥DMF(每g聚合物6mL)中的酰氯溶液(每胺单位0.5当量)。在此过程中，将混合物在冰浴中冷却。使用额外的干燥DMF(每g聚合物6mL)冲洗掉烧瓶壁上的残留物。在达到室温后，将反应混合物再搅拌24小时。根据产物的溶解度对纯化进行调整。制备单独dP(AOx-co-EI)的详细信息可以在下文的实验部分中找到。
水解程度的测定
由PEI的1H NMR光谱积分根据等式(1)计算水解程度DH。此处，D表示所述亚乙基亚胺单元的亚甲基基团的积分，和A表示其余EtOx单元的甲基基团的积分。
氧化程度的测定
根据等式(2)由oxPEI的1H NMR光谱的聚合物主链信号的积分计算氧化程度DO。此处，F表示所述甘氨酸单元的亚甲基基团的积分，A表示其余EtOx单元的甲基基团的积分，和D表示所述亚乙基亚胺单元的亚甲基基团的积分。
/>
滴定的实施
使用自动配对的Metrohm OMNIS滴定仪进行滴定以测定剩余的氨基基团，所述滴定仪配备有Metrohm Ecotrode plus pH电极。所有的测量均在动态滴定模式下进行，该模式根据滴定过程中的pH变化对滴定速度进行调整。典型的测量如下那样进行：将聚合物溶解在去离子水中，以得到浓度为3mg ml-1的聚合物溶液。将所述聚合物溶液通过滴加准浓HCl水溶液进行酸化，以达到pH为2。随后，在搅拌下用0.1M氢氧化钠水溶液将该溶液滴定至pH为12。当量点由滴定曲线的一阶导数确定。
降解研究的实施
为了在酸性条件下降解，将聚合物(20mg)溶解在6mol L-1HCl(2ml)中，并在90℃下搅拌48小时。将反应混合物用氢氧化钠水溶液中和，并在减压下除去水。
制备实施例H1：聚(2-甲基-2-噁唑啉-co-亚乙基亚胺-co-甘氨酸)，dP(MeOx-co-EI)的合成
根据所述通用过程，使用500mg oxPEI、614μl(446mg，4.41mmol，每胺单位1当量)三乙胺和157.2μl(173mg，2.20mmol，每胺单位0.5当量)乙酰氯制备P(MeOx-co-EI)6。在反应后滤除沉淀的三乙基铵盐，并将滤液减压浓缩。将粗产物溶解在甲醇中，并在冰冷的***(约-80℃)中沉淀三次。在去离子水中溶解，冷冻干燥和在40℃下真空干燥得到作为棕色固体的dP(MeOx-co-EI)(产量：406mg)。
制备实施例H2：聚(2-乙基-2-噁唑啉-co-亚乙基亚胺-co-甘氨酸)，dP(EtOx-co-EI)的合成
根据所述通用过程，使用500mg oxPEI、614μl(446mg，4.41mmol，每胺单位1当量)三乙胺，和192.2μl(204mg，2.20mmol，每胺单位0.5当量)丙酰氯制备P(EtOx-co-EI)。滤除在反应过程中形成的三乙基氯化铵，并在减压下浓缩溶液。将残余物溶解在甲醇中，并在冰冷的***(约-80℃)中沉淀八次。将粗产物溶解在去离子水中并进行冷冻干燥。在40℃下真空干燥后，获得作为棕色固体的dP(EtOx-co-EI)(产量：415mg)。
实施例C1：通过1H-NMR波谱法表征所述聚合物
第一步是通过CROP合成大量PEtOx作为明确限定的起始材料(参见通用合成方法，PEtOx的合成)。为此，在10L Normag反应器中进行一种合成方案，该方案产生近4kg PEtOx，其具有60的聚合度(DP)，和1.14的窄分散度如由SEC在DMAc中测定的。由于CROP是通过添加水终止的，因此得到的PEtOx含有两种异构的末端基团，其是由在噁唑啉环的2位或5位的亲核攻击产生的，但在这两种情况下，这在水解成线性聚(亚乙烷亚胺)(PEI)时都导致羟基末端基团。所述水解是在酸性条件下进行的(参见通用合成方法，PEI的合成)。为了获得完全的水解，用过量的6M HCl使反应进行过夜。由1H-NMR光谱证实了成功的合成，所述光谱清楚地表明分配给PEtOx的乙基取代基的信号消失了。另外，主链信号的明显高场位移证实了PEI的形成。水解程度(DH)被测定为99％，其是由1H NMR光谱中的积分比计算的(参见通用合成方法，dP(AOx-co-EI)的合成和表征，等式(1))。
随后，通过使用过氧化氢作为氧化剂将PEI氧化来制备oxPEI。在聚合物主链中发生氧化，因此形成无规分布的主链酰胺基团。所得oxPEI的结构对应于与未受影响的亚乙基亚胺单元相邻的聚(甘氨酸)重复单元。因此，所述聚合物也可被称为聚(亚乙基亚胺-stat-甘氨酸)共聚物。为了在PEI中通过氧化产生50％的氨基基团，使用每个氨基基团0.7当量过氧化氢。由在1H-NMR光谱中的积分比确定为54％的氧化程度(DO)(参见通用合成方法，dP(AOx-co-EI)的合成和表征，等式(2))证实了成功的合成。与所述亚乙基亚胺和甘氨酸重复单元相关的亚甲基基团信号在1H-NMR光谱中非常接近，并且彼此部分重叠。NH质子信号表明酰胺基团的形成，这也证实了甘氨酸单元的存在。
由于剩余的氨基基团可被进一步官能化，因此所得的oxPEI为合成各种可降解聚合物提供了平台。在此，随后用脂族酰氯乙酰氯和丙酰氯进行的再酰化被用于将酰胺单元等价物重新引入到PAOx中的N-酰基亚乙基亚胺结构中。所得的聚合物结构类似于PAOx，其具有额外的，无规分布的集成到聚合物主链中的聚(甘氨酸)单元和聚亚乙基亚胺单元。因此，它们也可以被认为是聚(2-正烷基-2-噁唑啉-stat-亚乙基亚胺-stat-甘氨酸)共聚物，或者由于甘氨酸单元的可降解性，被认为是可降解的聚(2-烷基-2-噁唑啉-stat-亚乙基亚胺)类似物。因此，所描述的合成方法使得仅使用作为可商购单体的EtOx就能够制备具有相同链长和DO的聚合物。
通过1H NMR波谱法对经纯化的dP(AOx-co-EI)的表征表明，归属于PEI重复单元的信号降低，而归属于烷基侧链的信号证实了它们部分转化为相应的N-酰基亚乙基亚胺结构。
实施例C2：通过IR-波谱法表征所述聚合物
通过IR波谱法获得另外的结构证据。图1显示了dP(MeOx-co-EI)和dP(EtOx-co-EI)在600至4000cm-1波数范围内的ATR-IR光谱，其包括主要波段的分配。PEtOx、PEI、聚(甘氨酸)以及oxPEI的IR波谱法之前在文献中已有描述，这些文献使得可以容易地分配振动谱带。在3235和3246cm-1处的谱带可归属于氨基基团的NH振动。在1647和1650cm-1处的振动谱带可归属于酰胺I谱带，这主要是由于羰基价键振动导致的。由于带有羰基基团的侧链断裂，该谱带在水解成PEI的过程中几乎完全消失。在氧化成oxPEI和随后再酰化成dP(EtOx-co-EI)的过程中，酰胺基团被重新引入，导致羰基振动谱带增加。在PEtOx中没有观察到在1543cm-1处的主要由NH键的变形振动引起的酰胺II带，PEtOx只有叔酰胺基团而没有NH键，并且显示出在PEtOx和dP(MeOx-co-EI)或dP(EtOx-co-EI)之间的结构差异。由于可能的降解产物，来自羧酸衍生物的信号预计在1710cm-1附近。然而，在oxPEI或dP(MeOx-co-EI)或dP(EtOx-co-EI)的光谱中分别不能观察到这些信号。
实施例C3：通过SEC表征所述聚合物
两种聚合物在DMAc中的SEC洗脱图的叠加如图2所示。与dP(MeOx-co-EI)(Mn＝2200,)相比，dP(EtOx-co-EI)(Mn＝2700，/>)被位移到更低的洗脱体积，并且因此到更高分子量。
实施例C4：通过滴定表征所述聚合物
两种聚合物在室温下都可溶解在水中。在水溶液中进行滴定以证实在聚合物主链中存在氨基基团。尽管氨基基团的滴定允许定性评估，但由于水残留物会影响结果，因此没有进行准确的定量分析。在图3和图4中，dP(MeOx-co-EI)和dP(EtOx-co-EI)的滴定曲线与它们各自的一阶导数一起显示。在滴定之前，用准浓HCl酸化聚合物溶液。还显示了当量点的相应pH值。
当用稀氢氧化钠溶液滴定时，在滴定之前用准浓HCl酸化聚合物水溶液导致含有氨基基团的聚合物出现两个等当量点(EP)。第一个EP对应于过量HCl的中和，而第二个EP涉及氨基基团的中和。在dP(MeOx-co-EI)和dP(EtOx-co-EI)的滴定曲线中观察到两个EP，这可归属于在oxPEI的成比例官能化后剩余的氨基基团。
实施例C5：借助于酸水解通过降解研究表征所述聚合物
与PAOx相比，dP(AOx-co-EI)的一个重要优势是它们由于额外的主链酰胺基团而具有潜在可降解的能力。为了证实这一点，将dP(MeOx-co-EI)和dP(EtOx-co-EI)在90℃下用6M HCl处理2天。这些条件类似于用于将PEtOx水解成PEI的那些条件，其中所述PEtOx或PEI聚合物主链没有降解。
图5和图6显示了dP(MeOx-co-EI)和dP(EtOx-co-EI)在用HCl处理之前(下谱图)和之后(上谱图)的1H NMR光谱的叠加。为了清楚，将单个光谱垂直叠加。
图5和图6显示了所述聚合物在这些条件下的成功降解。在用HCl处理之前，所述聚合物显示出聚合物典型的宽信号，而降解的聚合物的信号是尖锐的，如对于小分子常见的。
在1.34ppm和2.49ppm处的dP(EtOx-co-EI)的EtOx侧链信号分别***成三重或四重，表明侧链从聚合物主链断裂，产生丙酸。这并不一定证实聚合物链本身的降解，并且对于PEtOx在用HCl处理时也发现这一点。然而，虽然PEtOx的光谱在处理后仅显示剩余PEI的主链信号，但在之前的dP(EtOx-co-EI)主链的化学位移处出现了多个尖锐的信号。在3.67ppm的单重峰可归属于当降解时形成的甘氨酸的亚甲基单元，而在3.65ppm和3.21ppm范围内的三重峰可归属于剩余的亚乙基亚胺单元。此外，在8.77ppm处出现了一个尖锐的信号，这对于降解后的oxPEI已经被报道了，并且这可能是由于额外的降解产物导致的。同时，在约8.0ppm处，宽的酰胺信号消失，表明相关的主链酰胺基团的水解。在用HCl处理前后的dP(MeOx-co-EI)光谱的叠加表现出相似的行为。侧链断裂为乙酸，产生2.17ppm处的单重峰。另外，宽聚合物主链信号的断裂显示出在3.61ppm处的尖锐单重峰，这如上所述，可分配给甘氨酸。在3.58至2.95ppm范围内的几个三重峰是归属于亚乙基亚胺单元的降解产物的峰。

Claims (16)

1.含有5至75摩尔％的式(I)的结构单元、5至75摩尔％的式(II)的结构单元和20至90摩尔％的式(III)的结构单元的共聚物
-NR1-CHR3-CHR4-(I)，
-NH-CO-CHR7-(II)，
-NH-CHR9-CHR10-(III)，
或
含有5至75摩尔％的式(IV)的结构单元、5至75摩尔％的式(V)的结构单元和20至90摩尔％的式(VI)的结构单元的共聚物
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5-(IV)，
-NH-CO-CHR7-CHR8-(V)，
-NH-CHR9-CHR10-CHR11-(VI)，
其中
R1是式-CO-R2、式-CO-NH-R2，式-CH2-CH(OH)-R12或式-CH2-CH(NH2)-R12的残基，
R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10和R11彼此独立地是氢、甲基、乙基、丙基或丁基，
R2选自氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、-CmH2m-X或-(CnH2n-O)o-(CpH2p-O)q-R6，
R6是氢或C1-C6烷基，
R12选自氢、烷基、烯基、环烷基、芳基或芳烷基，
X选自羟基、烷氧基、氨基、N-烷基氨基、N,N-二烷基氨基、具有至少一个环氮原子的杂环基、胍基、羧基、羧酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基或氨基甲酸酯基，
m是1至18的整数，
n和p彼此独立地是2至4的整数，其中n不等于p，和
o和q彼此独立地是0至60的整数，o或q中的至少一个不等于0，
其中所述百分比是基于式(I)、(II)和(III)的结构单元或式(IV)、(V)和(VI)的结构单元的总量计的。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于这些共聚物含有15至60摩尔％的式(I)的结构单元、10至60摩尔％的式(II)的结构单元和25至75摩尔％的式(III)的结构单元。
3.根据权利要求1或2中至少一项所述的共聚物，其特征在于R1是式-CO-R2的残基。
4.根据权利要求1至3中至少一项所述的共聚物，其特征在于R2是C1-C18烷基，优选C1-C6烷基，和尤其优选C1-C2烷基。
5.根据权利要求1至4中至少一项所述的共聚物，其特征在于n＝2和p＝3。
6.制备根据权利要求1至5中至少一项所述的共聚物方法，该方法包括以下步骤：
i)使含有式(Ia)或式(IVa)的重复结构单元的聚亚烷基亚胺与氧化试剂反应，从而获得含有式(Ia)和式(II)的结构单元或含有式(IVa)和式(V)的结构单元的共聚物
-NH-CR3H-CR4H-(Ia)，
-NH-CO-CR7H-(II)，
-NH-CR3H-CR4H-CR5H-(IVa)，
-NH-CO-CR7H-CR8H-(V)，
其中R3、R4、R5、R7和R8具有在权利要求1中限定的含义，和
ii)使步骤i)的共聚物与式(VII)的酰基衍生物或与式(VIII)的异氰酸酯或与式(IX)的环氧化物或与式(X)的氮丙啶进行反应以形成根据权利要求1所述的共聚物
R2-CO-R13(VII)，
R2-NCO(VIII)，
其中R2和R12具有在权利要求1中限定的含义，并且
R13代表离去基团，特别是氟、氯、溴、碘或活化的羧酸。
7.制备根据权利要求1至5中至少一项所述的共聚物方法，该方法包括以下步骤：
iii)使含有式(I)的重复结构单元的聚噁唑啉或含有式(IV)的重复结构单元的聚噁嗪发生部分水解以形成含有式(I)和式(III)的重复结构单元或式(IV)和式(VI)的重复结构单元的共聚物
-NR1-CHR3-CHR4-(I)，
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5-(IV)，
-NH-CHR9-CHR10-(III)，
-NH-CHR9-CHR10-CHR11-(VI)，
其中R1、R3、R4、R5、R9、R10和R11具有在权利要求1中限定的含义，和
iv)使得自步骤iii)的共聚物与氧化试剂进行反应，由此获得含有式(I)、式(II)和式(III)的结构单元或含有式(IV)、式(V)和式(VI)的结构单元的共聚物
-NH-CO-CHR7-(II)，
-NH-CO-CHR7-CHR8-(V)，
其中R7和R8具有在权利要求1中限定的含义。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所使用的氧化试剂是过氧化物、氢过氧化物或过羧酸，优选过氧化氢。
9.根据权利要求6或8中至少一项所述的方法，其特征在于在步骤i)中使用的聚亚烷基亚胺是通过聚(噁唑啉)的酸水解获得的。
10.根据权利要求1至5中至少一项所述的共聚物用于制备含有药物或农用化学活性成分的配制剂的用途。
11.包含根据权利要求1至5中至少一项所述的共聚物的颗粒。
12.根据权利要求11所述的颗粒，其特征在于它们作为纳米颗粒存在，其具有小于1μm，优选20至500nm的平均直径D50。
13.复合物，其包含根据权利要求1至5中至少一项所述的共聚物和具有阴离子基团的化合物，优选核酸。
14.包含根据权利要求13所述的复合物的颗粒。
15.根据权利要求14所述的颗粒，其特征在于它们具有在1至200之间，优选在2.5至100之间，非常优选在5至50之间，和最优选在10至30之间的N/P比率。
16.根据权利要求14至15中至少一项所述的颗粒用于将基因转移到细胞的用途。
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