CN116710124A - 包封蛋白质的微凝胶的制造 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用碳氟化合物包烃(hydrocarbon‑in‑fluoro‑carbon)乳液来制造包封蛋白质的微凝胶的方法。基于非水性乳液的微凝胶制造方法可以用于包封多种蛋白质和肽，包括抗体和抗体融合蛋白，以用于治疗用途且易于施用。

Description

包封蛋白质的微凝胶的制造

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年12月17日提交的美国临时专利申请第63/127,033号的优先权和权益，该申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及药物微凝胶、含有药物微凝胶的制剂以及使用非水性乳液体系制备药物微凝胶的方法。

背景技术

治疗性蛋白质向生物学相关靶标的延长或持续释放递送对于如癌症、心血管疾病、血管病状、矫形病症、牙科病症、伤口、自身免疫性疾病、胃肠病症和眼部疾病等医学病状的治疗是期望的，因为它使得低频率施用较大剂量成为可能。减少注射的次数或延长注射间隔对于患者的依从性来说可能是期望的，尤其是在需要医生进行注射的情况下，如在眼内治疗的情况下。

生物相容性和可生物降解的聚合物以及用于药物的受控和持续递送的其他可植入递送装置已经在使用中，包括例如基于聚合物的递送装置，其中聚合物随着时间降解，治疗性药物缓慢释放。然而，当使用聚合物和基于聚合物的递送装置，特别是用于递送蛋白质治疗剂时，在维持药物稳定性方面存在各种挑战。

如抗体和受体Fc融合蛋白等治疗性大分子必须以如此方式配制，即不仅使分子适合施用于患者，而且在储存期间和在施用部位处时保持其稳定性。例如，除非正确地配制溶液，否则水溶液中的治疗性蛋白质(如抗体或融合蛋白)易于降解、聚集和/或发生不期望的化学改质。

当配制用于持续释放的治疗性蛋白质时，必须非常小心以获得在储存和生理温度下随时间变化保持稳定、含有足够浓度的治疗性蛋白质(例如抗体)并且具有使制剂能够方便地施用于患者的其他性质的制剂。

一些延长或持续释放制剂使用包封方法来生产，包封方法包含多重乳液的形成、内部相分离、界面聚合、聚电解质的逐层吸附和软模板技术。例如，最常见的多重乳液类型是水包油包水(W/O/W)。W/O/W中的多重乳液使得能够将水性/亲水性核直接包封在水性悬浮液中；然而，当用于将生物活性剂包封到延长或持续释放制剂中时，存在特定的问题。例如，可能在水性有机界面处发生蛋白质的沉淀，伴随着蛋白质免疫反应性的降低。

在其他水性乳液体系中，水可以扩散到有机相中并且水解蛋白质。在水解之后，蛋白质液滴开始合并，并且逃逸到水性环境中，聚集或沉淀。在硬化之后，在蛋白质曾经存在但逃逸到水性环境中的地方可能出现空隙和水通道。

在另一实例中，水凝胶微粒(在本文中被称为“微凝胶”)可以用于提供治疗性蛋白质的延长或持续释放制剂。微凝胶是可以包括被大量水水合的交联亲水性聚合物网络的微结构。连接聚合物的交联(crosslink)可以使用共价、离子、亲和力和/或物理基础形成。与需要手术植入的本体(bulk)水凝胶相比，微凝胶是柔软可变形的，并且可以用针或导管施用，其侵入性较小，并且可以实现更好的治疗结果。

几种合成路线可用于制备微凝胶。间歇乳液或沉淀聚合是目前最常用的基于油包水性乳液或反相水包油乳液的方法。在这些方法中，水相的存在限制了亲水性有效载荷(payload)的包封效率。

尽管在微凝胶的制造中有许多不混溶的溶剂对可供选择，但通常选择一种极性溶剂和一种非极性溶剂。然而，寻找一对适于合成聚合物微凝胶(在本文中有时被称为微球)的溶剂可能是个挑战，因为典型的可生物降解的聚合物，包括例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)或聚(原酸酯)(POE)，大多可溶于如氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯等具有中等极性的溶剂中。这限制了连续相的选择。此外，与工艺的相容性、毒性、安全性和残留溶剂是使用这些有机溶剂时要考虑的问题，并且用作药物产品时，应该考虑到这些问题。

其他制造方法，如光刻(lithography)、微流体聚合和电喷雾，通常用作小型实验室规模的方法，当在临床或商业制造环境中按比例放大时可能会遇到挑战。已经通过微流体方法制备了各种含有碳氟化合物的乳液体系，如碳氟化物包水(W/F)、水包碳氟化合物包水(W/F/W)双重乳液、水/碳氟化合物/油/水(W/F/O/W)三重乳液、碳氟化合物/烃/水(F/H/W)双重乳液和烃/碳氟化合物/水(H/F/W)双重乳液。这些乳液中的一些已经用于合成聚合物微球。然而，它们仍是使用水作为分散相或连续相的水基乳液体系。

因此，对使用非水性乳液体系来生产微凝胶的方法存在需求。

因此，对改善的聚合物和基于聚合物的递送装置存在未满足的需求，所述聚合物和基于聚合物的递送装置提供延长释放或持续释放制剂以通过尽可能少的注射随时间有效地递送药物。在其他疾病(例如癌症和炎症疾病)的情况下，对含有稳定和有效的蛋白质治疗剂的改善的可植入的延长释放或持续释放制剂存在需求。

因此，期望的是提供非水性乳液体系来生产药物制剂及其使用方法。还期望的是提供具有改善的蛋白质稳定性、稳定的延长或持续释放(持续释放)以及易于施用的延长释放制剂。

在不希望有水存在的情况下，非水性乳液可以替代常规的水性乳液。两种类型的基于烃的非水性乳液体系是：(1)通过嵌段共聚物稳定的两种不混溶的有机溶剂(例如，己烷/二甲基甲酰胺)；以及(2)使用现有的表面活性剂代替水的油不混溶的极性溶剂(例如甲酰胺、乙腈)。全氟化油包水(W/F)乳液已经被应用于基于液滴的微流体中，用于单细胞或单分子生物测定，其中PFPE-PEG-PFPE用作含氟表面活性剂(FS)，用于稳定碳氟化合物溶剂中的水滴。

因此，根据本发明的一些实施方案使用碳氟化合物作为非水性乳液体系中的连续相，因为它们具有若干期望的性质。首先，碳氟化合物既不是疏水性的也不是亲水性的：它们与大多数有机(烃)溶剂不混溶，这使得它们成为烃液滴乳液的理想连续相。其次，碳氟化合物是蛋白质和其他亲水性分子、基于烃的聚合物和有机赋形剂的非溶剂；换句话说，这些类型的分子将不溶于碳氟化合物。第三，碳氟化合物的粘度低。第四，碳氟化合物是化学惰性的，并且与常用的烃类溶剂相比，可以具有相对较小的毒性或腐蚀性。最后，碳氟化合物是挥发性的并且可回收。

发明内容

开发了一种使用非水性乳液体系来生产微凝胶的方法。所述方法包括将至少一种可生物降解和/或可生物溶蚀的可交联聚合物和至少一种交联调节剂与烃溶剂组合，以形成非水性第一溶液或分散相悬浮液。将第一溶液或分散相悬浮液加入到含有碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的第二溶液或连续相溶液中。通过乳化方法将溶液混合物乳化。通过首先去除烃溶剂，然后去除碳氟化合物液体，可以回收微凝胶颗粒的粉末。通过将包含治疗活性剂(例如治疗性蛋白质)的粉末悬浮在分散相悬浮液中，可以产生缓慢释放或持续释放的治疗或药物微粒。

在一些示例性的实施方案中，根据本公开提供的药物微粒包含被交联的聚合物微凝胶皮层包围的活性成分(如例如，蛋白质)。通过所公开的方法生产的药物微粒可以具有没有孔或通道并且未被穿孔的交联的聚合物微凝胶皮层。在一些示例性的实施方案中，药物微粒可以具有在约1μm和约200μm之间的直径。

根据本公开，使用非水性乳液体系通过以下来制备药物微粒：将活性成分(例如，干燥蛋白质粉末)、一种或多种可生物降解和/或可生物溶蚀的可交联聚合物或聚合物前体以及交联调节剂组合到烃溶剂中以形成非水性第一溶液或分散相悬浮液，并将第一溶液或分散相悬浮液加入到包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的第二溶液或连续相溶液中。通过乳化方法将溶液混合物乳化。通过首先去除烃溶剂，然后去除碳氟化合物液体，可以回收药物微粒。

根据本公开，还提供了含有药物微粒的制剂。

在特定方面，本公开涉及一种生产微粒的方法，其包含将活性成分(例如，干燥蛋白质粉末)和一种或多种可交联聚合物前体与烃溶剂组合以形成非水性第一溶液的步骤。

所述方法进一步包含将第一溶液加入到第二溶液中，其中第二溶液包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂。所述方法进一步包含搅动组合的第一溶液和第二溶液以在碳氟化合物液体中形成具有多个乳液烃液滴的非水性乳液。所述方法进一步包括去除烃溶剂并去除碳氟化合物液体以分离微凝胶，其中微凝胶包含包封在交联的聚合物的基质内的活性成分。

在示例性的实施方案中，第二溶液可以含有全氟C5-C18化合物。在其他实施方案中，第二溶液可以含有FC-70。活性成分(例如干燥蛋白质粉末)和一种或多种可交联聚合物前体可以与选自二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合的烃溶剂组合。在又其他实施方案中，活性成分和一种或多种可交联聚合物前体与选自二氯甲烷、乙酸乙酯或其组合的烃溶剂组合。

在示例性的实施方案中，将第一溶液加入到第二溶液中的步骤包含将第一溶液加入到含有全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚的第二溶液中。

在其他实施方案中，与烃溶剂组合的一种或多种可交联聚合物前体包含选自聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-共-聚氧化丙烯、共-聚环氧乙烷嵌段或无规共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氨基酸)、葡聚糖或其任何组合的核。

在示例性的实施方案中，与烃溶剂组合的一种或多种可交联聚合物前体包含有包含亲核官能团的第一可交联聚合物前体以及包含亲电官能团的第二可交联聚合物前体。与烃溶剂组合的一种或多种可交联聚合物前体可以包含PEG-NH第一前体和PEG-NHS第二前体。与烃溶剂组合的PEG-NH第一前体或PEG-NHS第二前体中的至少一者可以是4臂化合物或8臂化合物中的一者。

在示例性的实施方案中，与烃溶剂组合的含活性物质的粉末是蛋白质粉末。与烃溶剂组合的蛋白质粉末可以含有抗体、其抗原结合片段、融合蛋白、重组蛋白质或其片段或截短形式。在其他实施方案中，与烃溶剂组合的蛋白质粉末含有VEGF-Trap蛋白质。与烃溶剂组合的VEGF-Trap蛋白质可以是VEGF-Trap蛋白质的截短形式。在又其他实施方案中，可以通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合将与烃溶剂组合的蛋白质粉末微粉化。

在示例性的实施方案中，搅动组合的第一溶液和第二溶液的步骤可以包含均质化、涡旋、超声处理、空化、搅动或其组合。分离的微粒可以是持续释放微粒。形成的第一非水性溶液可以包含悬浮在烃溶剂中的1.0％w/v至30％w/v的喷雾干燥的蛋白质和5.0％w/v至35％w/v的一种或多种可交联聚合物前体。向其中加入第一非水性溶液的第二溶液可以包含0.1％w/v至5.0％w/v的含氟表面活性剂。

在示例性的实施方案中，所述方法可以进一步包含将微粒悬浮在药学上可接受的赋形剂中的步骤。微粒可以悬浮在pH缓冲盐水中。

在另一实施方案中，本公开涉及一种用于生产聚合物或聚合物涂覆的微球的方法，其包含以下步骤：将包含悬浮在第一非水性烃溶液中的1.0％w/v至30.0％w/w的总固体喷雾干燥的蛋白质的分散相组合到连续相中以形成分散相的乳液液滴，其中第一非水性烃溶液包含5.0％w/v至35％w/v的PEG-NH和1.0％w/v至15％w/v的PEG-NH。连续相可以包含包括0.1％w/v至5.0％w/v含氟表面活性剂的第二非水性碳氟化物溶液。所述方法进一步包含通过去除烃液体以形成硬化的聚合物或聚合物涂覆的微球来使乳液液滴硬化的步骤。

在一些示例性的实施方案中，根据本公开的生产水凝胶微粒的方法包括(a)将至少一种可交联聚合物、至少一种交联调节剂和包括至少一种蛋白质的粉末与烃溶剂组合，以形成分散相悬浮液；(b)将所述分散相悬浮液加入到连续相溶液中，其中所述溶液包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂，以形成组合的分散相悬浮液和连续相溶液；(c)向所述组合的分散相悬浮液和连续相溶液施加混合力，以在碳氟化合物液体中形成具有多个烃液滴的非水性乳液，所述烃液滴包含所述至少一种可交联聚合物和进一步包含至少一种蛋白质的所述粉末；以及(d)从所述非水性乳液中去除烃溶剂和碳氟化合物液体以形成分离的水凝胶微粒，其中所述水凝胶微粒包含包封在所述交联的聚合物的基质内的所述至少一种蛋白质。

在一个方面，所述至少一种交联调节剂为非官能化的线性PEG聚合物。在另一方面，分散相中至少一种交联调节剂的浓度在约5.0％w/v和约35％w/v之间。

在一个方面，碳氟化合物液体为高粘度碳氟化合物。在另一方面，连续相溶液包括全氟C5-C18化合物。在又一方面，连续相溶液包括FC-70或全氟三戊胺。

在一个方面，烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃及其组合组成的群组。在另一方面，连续相溶液包括全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。

在一个方面，所述至少一种可交联聚合物包含选自由聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-共-聚氧化丙烯、共-聚环氧乙烷嵌段或无规共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氨基酸)、葡聚糖及其任何组合组成的群组的核。

在一个方面，所述至少一种可交联聚合物包括包含至少一个亲核官能团的第一可交联聚合物以及包含至少一个亲电官能团的第二可交联聚合物。在一个具体的方面，至少一个亲核官能团与至少一个亲电官能团的摩尔比为约1:1至约1:2。在另一个具体方面，所述至少一种可交联聚合物包括PEG-NH第一前体和PEG-NHS第二前体。在进一步的具体方面，PEG-NH第一前体或PEG-NHS第二前体是4臂化合物或8臂化合物。

在一个方面，所述至少一种蛋白质是抗体、其抗原结合片段、融合蛋白、重组蛋白质或其片段或截短形式。在一个具体的方面，所述至少一种蛋白质是VEGF-Trap蛋白质。在进一步的具体方面，VEGF-Trap蛋白质是VEGF-Trap蛋白质的截短形式。

在一个方面，所述至少一种蛋白质选自由阿柏西普(aflibercept)、利纳西普(rilonacept)、阿利库单抗(alirocumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、抗Ebola抗体和抗SARS-CoV-2抗体组成的群组。

在一个方面，分离的水凝胶微粒具有在约1μm和约200μm之间的直径。在另一个方面，通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合将粉末微粉化。在进一步的方面，混合力包括均质化、涡旋、超声处理、空化、搅动或其组合。

在一个方面，水凝胶微粒为持续释放微粒。

在一个方面，分散相悬浮液中粉末的浓度在约1.0％w/v和约30％w/v之间。在另一方面，分散相悬浮液中至少一种可交联聚合物的浓度在约5.0％w/v和约35％w/v之间。在又一方面，连续相溶液中含氟表面活性剂的浓度在约0.1％w/v和约5.0％w/v之间。

在一个方面，所述方法进一步包括将分离的水凝胶微粒悬浮在药学上可接受的制剂中。在另一方面，制剂包括pH缓冲盐水、水溶液或非水性溶液。

在一个方面，粉末进一步包括至少一种赋形剂。

本公开还提供了一种水凝胶微粒。在一些示例性的实施方案中，水凝胶微粒通过前述方法中的任何一种生产。

当结合以下描述和附图考虑时，将更好地了解和理解本发明的这些和其他方面。以下描述虽然表明了各种实施方案及其许多具体细节，但是，是以说明而非限制性的方式给出。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

附图说明

通过结合附图参考以下描述，可以获得对本发明公开的概念和说明性实施方案的更完整的理解。

图1A示出了根据示例性的实施方案的用于经由基于碳氟化合物中烃(H/F)的(非水性)本体乳液来生产空白交联的PEG微凝胶的工艺。

图1B示出了根据示例性的实施方案的Fluorinert^TMFC-70(Millipore Sigma)(全氟三戊胺)的化学结构。

图1C示出了根据示例性的实施方案的含氟表面活性剂PFPE-PEG-PFPE(SphereFluidics，Pico-Surf^TM 1)，一种全氟聚醚/聚(乙二醇)三嵌段共聚物的化学结构。

图2示出了根据示例性的实施方案的空白交联的PEG微凝胶的合成路线。

图3示出了根据示例性的实施方案的制备具有包封在交联的PEG微凝胶中的喷雾干燥的蛋白质(SDP)的药物微粒的工艺。

图4A示出了悬浮在FC-70中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的明视场显微图像。

图4B示出了悬浮在FC-70中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的荧光显微图像。

图5A示出了悬浮在FC-70中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的明视场显微图像。

图5B示出了悬浮在FC-70中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的荧光显微图像。

图6A示出了悬浮在水中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的明视场显微图像。

图6B示出了悬浮在水中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的荧光显微图像。

图7示出了悬浮在水中的根据示例性的实施方案的包封交联的PEG微凝胶的VEGF-Trap的荧光显微图像。

具体实施方式

应当理解，本公开不限于本文所述的材料、组合物和方法或所述的实验条件，因为此类材料、组合物、方法和/或条件可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述某些实施方案的目的而不旨在进行限制。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。与本文描述的组合物、方法和材料类似或等同的任何组合物、方法和材料可以用于本文描述的实施方案的各个方面的实践或测试。

除非本文另有说明或与上下文明显相矛盾，否则在描述本文所述的实施方案的各个方面的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)，术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”、“所述(the)”和类似指示物的使用应被理解为涵盖单数和复数两者。

除非本文中另有说明，否则本文中对值的范围的引述仅旨在用作个别地提及属于所述范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中个别地引用一样。

术语“约”旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所陈述值的值；在其他示例性的实施方案中，这些值可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所陈述值的值的范围内；在其他示例性的实施方案中，这些值可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所陈述值的值的范围内；在其他示例性的实施方案中，这些值可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所陈述值的值的范围内。前述范围旨在通过上下文明确，并且不暗示进一步的限制。

除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本文描述的实施方案的各个方面，并且不对本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的要素指示为对本文描述的实施方案的各个方面的实践是必不可少的。

术语“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且还可以包含修饰，如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学或商业意义，包含基于蛋白质的药物，并且蛋白质包含酶、配体、受体、抗体以及嵌合或融合蛋白等等。蛋白质可以通过各种类型的重组细胞使用众所周知的细胞培养方法来生产，并且通常可以通过基因工程技术(例如，编码嵌合蛋白质的序列，或密码子优化的序列，无内含子序列等)被引入到细胞中，在其中它可以作为附加体存在或被整合到细胞的基因组中。

术语“抗体”是指由四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重链(H链)和两条轻链(L链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链都具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链均具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的区，称为构架区(FR)。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含提及任何同型或亚类的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白两者。术语“抗体”包含通过重组方式制备、表达、创建或分离的抗体分子，如从被转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。术语抗体还包含双特异性抗体，所述双特异性抗体包含可以结合至多于一个不同的表位的异源四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体在美国专利第8,586,713号中进行了总体描述，所述美国专利通过引用并入本申请中。

术语“Fc融合蛋白”包含两种或更多种蛋白质的部分或全部，其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分，所述两种或更多种蛋白质的部分或全部在自然界中不会一起发现。在以下中已经描述了包含与源自抗体的多肽的不同部分(包含Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备：例如，Ashkenazi等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:10535,1991；Byrn等人,《自然(Nature)》344:677,1990；以及Hollenbaugh等人，“免疫球蛋白融合蛋白的构建(Construction of ImmunoglobulinFusion Proteins)”,《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》，增刊4，第10.19.1-10.19.11页，1992。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施方案中，所述Fc部分包含免疫球蛋白的铰链区，随后是CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白包括与一种或多种配体结合的两条或更多条不同的受体链。例如，Fc融合蛋白可以是trap，如例如IL-1trap或VEGF-Trap。在一些示例性的实施方案中，用于本发明的Fc-融合蛋白可以是VEGF-Trap，如阿柏西普。

术语“微粉化的蛋白质颗粒”或“蛋白质颗粒”是指含有多个蛋白质分子且具有低、极低或接近于零的量的水(例如，按重量计<3％的水)的颗粒。如本文所使用的，微粉化的蛋白质颗粒的形状通常为球形并且具有在约2微米至约35微米范围内的等效圆直径(ECD)。微粉化的蛋白质颗粒不限于任何特定的蛋白质实体，并且适用于治疗性蛋白质的制备和递送。常见的治疗性蛋白质尤其包含抗原结合蛋白，如例如，可溶性受体片段、抗体(包含IgG)和抗体的衍生物或片段、包含Fc融合蛋白在内的其它含有Fc的蛋白质和包含如例如VEGF-Trap等trap型蛋白质在内的受体-Fc融合蛋白(Huang,C.,《生物技术的当前观点(Curr.Opin.Biotechnol.)》20:692-99(2009))。

术语“水凝胶微粒”(微凝胶)是指包括亲水性聚合物网络的微结构。聚合物的网络通过交联连接，交联可以具有共价、离子、亲和力或物理基础。微凝胶已经成为用于治疗性蛋白质的受控释放的潜在递送媒介物。与需要手术植入的本体水凝胶相比，柔软可变形的微凝胶可以用针或导管递送至患者，侵入性较小的并且可以实现更好的治疗结果。使用本文所述的制造工艺，微粉化的蛋白质颗粒(即微粉化形式的蛋白质粉末，例如喷雾干燥的VEGF-Trap粉末)可以悬浮在含有可交联聚合物的烃溶液中。经历用于交联的化学反应的可交联聚合物也可以被称为聚合物前体。在加入交联剂之后，悬浮液(本文中也被称为第一溶液或分散相悬浮液)可以立即加入到含有含氟表面活性剂的碳氟化合物连续相中。烃相通过乳化方法快速分散。由于碳氟化合物连续相将可交联聚合物和喷雾干燥的蛋白质粉末限制在烃液滴内，因此乳液液滴中的聚合物被交联，然后被硬化成单独的微凝胶。

使用烃-碳氟化合物乳液生产水凝胶微粒

油和水基乳液体系经常用于聚合物微粒或纳米颗粒的合成，其中疏水性聚合物材料溶解在有机相中并分散在水性连续相中。然而，对于水溶性聚合物，例如PEG或羧甲基纤维素(CMC)和在水的存在下容易水解的聚合物，例如聚酸酐、具有短中间嵌段的脂肪族聚酯如聚乳酸和某些聚(氨基酸)如聚(谷氨酸)，常规的水基乳液体系并不理想。除了水溶性聚合物溶解在水性连续相中的不良效果之外，官能化的交联聚合物如PEG-NHS可能与水反应，导致交联的反应动力学变得非常不利于微凝胶的形成。

此外，使用水性乳液体系生产的药物制剂可能会在生产期间将药物(例如蛋白质药物)从乳液液滴中泄漏到水性连续相中。这种药物从乳剂微滴中的泄漏导致包封效率低。水溶性药物如蛋白质药物可能溶解在水性连续相中，妨碍药物从微凝胶中逐渐持续释放。

提供了使用无水的乳液体系或非水性的乳液体系配制药物组合物的体系和方法。所公开的无水乳液方法克服了上述现有水性乳液体系的问题。

本文所述的非水基乳液方法包封药物分子，包含但不限于亲水性药物如蛋白质，具有相对于水性乳液体系增加的包封效率，增加的原始蛋白质颗粒结构的保留，或其组合。所公开的无水乳液体系和方法可以通过本体方法(例如，搅动、均质化或超声处理)和其他常规方法生产包封的药物制剂。本文公开的体系和方法也可以应用于多种聚合物材料、固态有效载荷和乳化方法。

碳氟化合物包烃包固体(S/H/F)乳液

示例性的非水性S/H/F乳液方法包含以下步骤：将干燥蛋白质粉末、一种或多种可生物降解和/或可生物溶蚀的可交联聚合物或聚合物前体以及一种或多种交联调节剂组合到烃溶剂中，以形成非水性第一溶液或分散相悬浮液，并将第一溶液或分散相悬浮液加入到含有碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的第二溶液或连续相溶液中。第一溶液或分散相悬浮液和第二溶液或连续相溶液的组合是以在碳氟化合物液体中形成含有多个乳液烃液滴的非水性乳液的方式进行的，例如通过施加混合力如搅动、超声处理、空化、均质化或涡旋进行的。

本发明的方法进一步包括去除烃溶剂和去除碳氟化合物液体，以分离具有微粉化蛋白质的一个或多个核和交联的可生物降解聚合物的皮层的水凝胶微粒。

在一些示例性的实施方案中，搅拌乳液，并在环境条件下或在真空下使烃和碳氟化合物液体蒸发。在一些示例性的实施方案中，氢氟醚(HFE)可以加入到碳氟化合物中，以帮助将烃从分散相提取到碳氟化合物连续相中。可以任选地洗涤所得到的微粒以去除烃溶剂、碳氟化合物液体、含氟表面活性剂或其组合。可以使用本体乳液技术形成乳液。去除烃和碳氟化合物液体使微粒***，然后可以收获微粒。

在一些示例性的实施方案中，可以通过过滤收获微粒。通过本发明的非水性乳液方法生产的持续释放微粒含有包封在交联的可生物降解和/或可生物溶蚀的聚合物的基质内的蛋白质。在一些示例性的实施方案中，微粒具有单个核-壳结构。在其他示例性的实施方案中，微粒具有分散在聚合物中的多个核。

在仍其他示例性的实施方案中，微粒群包含具有由聚合物皮层包封的单核结构的微粒以及在聚合物皮层中具有多核结构的微粒。碳氟化合物液体可以是高粘度碳氟化合物，如全氟C5-C18化合物，包括但不限于FC-40或FC-70(全氟三戊胺)，并且烃溶液可以包含选自乙酸乙酯、氯仿、甲苯、四氢呋喃和二氯甲烷或其组合的烃溶剂。在一些示例性的实施方案中，含氟表面活性剂是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，可作为Pico-Surf^TM 1商购获得。

在一些示例性的实施方案中，连续相溶液中含氟表面活性剂的浓度可以在约0.1％w/v和10％w/v之间、在约0.1％w/v和5％w/v之间、在约1％w/v和10％w/v之间、在约1％w/v和5％w/v之间、约0.1％w/v、约0.2％w/v、约0.3％w/v、约0.4％w/v、约0.5％w/v、约0.6％w/v、约0.7％w/v、约0.8％w/v、约0.9％w/v、约1％w/v、约1.5％w/v、约2％w/v、约2.5％w/v、约3％w/v、约3.5％w/v、约4％w/v、约4.5％w/v、约5％w/v或约10％w/v。

可交联聚合物和聚合物前体

适合于生产本发明的水凝胶微粒的交联的聚合物皮层的前体通常是多官能的，这意味着它们包含两个或更多个亲电或亲核官能团，使得一个前体上的亲核官能团可以与另一个前体上的亲电官能团反应以形成共价键。前体可以包含多于两个官能团，因此，作为亲电-亲核反应的结果，前体组合以形成交联的聚合物产物。此类反应被称为“交联反应”。在一些示例性的实施方案中，可以使用多于一种前体，其中第一前体是聚合物前体(含有例如亲电基团)，第二前体是低分子量化合物(含有例如亲核基团)。应当理解，取决于皮层的期望的特性，可以使用一种、两种、三种、四种或更多种不同的前体，条件是前体中的至少一种是聚合物。

在一些示例性的实施方案中，每种前体仅包含亲核官能团或仅包含亲电官能团，只要在交联反应中使用亲核前体和亲电前体两者。因此，例如，如果交联剂(具有相对低的分子量)具有亲核官能团如胺，则官能聚合物(具有相对高的分子量)可以具有亲电官能团如N-羟基琥珀酰亚胺。在另一方面，如果交联剂具有亲电官能团如磺基琥珀酰亚胺，则官能聚合物可以具有亲核官能团如胺。因此，可以使用官能聚合物，如蛋白质、聚(烯丙基胺)或胺封端的二官能或多官能的聚(乙二醇)(“PEG”)。

在一些示例性的实施方案中，第一前体中亲核基团的数量可以为约2-30、约2-25、约2-20、约2-15、约2-10、约5-30、约5-20、约5-15、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。

在一些示例性的实施方案中，第二前体中亲电基团的数量可以为约2-30、约2-25、约2-20、约2-15、约2-10、约5-30、约5-20、约5-15、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。

可交联聚合物或聚合物前体可以具有生物惰性和水溶性的核。在支化聚合物的情况下，核是指连接到从核延伸的臂的分子的连续部分，其中每个臂的末端具有官能团。当核是水溶性的聚合物区域时，可以使用的合适的聚合物包含聚醚，例如聚环氧烷，如聚乙二醇(“PEG”)；聚环氧乙烷(“PEO”)；聚环氧乙烷-共-聚环氧丙烷(“PPO”)；共-聚环氧乙烷嵌段或无规共聚物，和聚乙烯醇(“PVA”)；聚(乙烯基吡咯烷酮)(“PVP”)；聚(氨基酸)；葡聚糖；等等。当核本质上是小分子时，多种亲水性官能团中的任何一种都可以用于使前体是水溶性的。例如，水溶性的官能团如羟基、胺、磺酸盐和羧酸盐可以用于使前体是水溶性的。此外，辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺(“NHS”)酯不溶于水，但是通过在琥珀酰亚胺环上添加磺酸盐基团，可以使辛二酸的NHS酯是水溶性的，而不影响其与胺基团的反应性。

为了提供可生物降解或可吸收的生物相容***联聚合物，可以使用一种或多种在官能团之间存在可生物降解的键的前体。可生物降解的键任选地也可以用作一种或多种前体的水溶性核。替代地，或者另外地，可以选择前体的官能团，使得它们之间的反应的产物产生可生物降解的键。对于每种方法，可以选择可生物降解的键，使得所得到的可生物降解的、生物相容的交联聚合物将在期望的时间段内降解或被吸收。可以选择在生理条件下降解成无毒产物的可生物降解的键。

可生物降解的键可以是化学或酶促可水解的或可吸收的。可化学水解的可生物降解的键的实例包括乙交酯、dl-丙交酯、l-丙交酯、己内酯、对二氧环己酮(dioxanone)和三亚甲基碳酸酯的聚合物、共聚物和低聚物。可促酶水解的可生物降解的键的实例包括可被金属蛋白酶和胶原酶切割的肽键。可生物降解的键的另外的实例包括聚(羟基酸)、聚(原碳酸酯)、聚(酸酐)、聚(内酯)、聚(氨基酸)、聚(碳酸酯)和聚(膦酸酯)的聚合物和共聚物。

某些官能团，如醇或羧酸，在生理条件下(例如，pH 7.2-11.0，37℃)通常不与其他官能团(如胺)反应。然而，通过使用活化基团如N-羟基琥珀酰亚胺，可以使此类官能团更具反应性。用于活化此类官能团的几种方法是本领域中已知的。合适的活化基团包括羰基二咪唑、磺酰氯、芳基卤化物、磺基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺酯、环氧化物、醛、马来酰亚胺、亚胺酯等。N-羟基琥珀酰亚胺酯基团或N-羟基磺基琥珀酰亚胺基团是用于蛋白质或胺官能化聚合物如氨基封端的聚乙二醇(“APEG”)的交联的合适基团。

例如，在美国专利申请第8,535,70号(其通过引用并入本文)中公开了由水溶性前体形成的合适的生物相容***联聚合物及其制备和使用方法，所述水溶性前体具有能够原位反应和交联的亲电和亲核基团。在一些示例性的实施方案中，可生物溶蚀的、可交联聚合物前体是PEG-NHS。

在一些示例性的实施方案中，可以使用利用物理相互作用交联的可交联聚合物，而不是利用化学反应交联的聚合物前体。如本文所使用的，术语“可交联聚合物”涵盖聚合物前体和物理相互作用的可交联聚合物，它们中的任何一种都可以适合于本发明的方法。

治疗剂的释放持续时间和释放曲线取决于如聚合物皮层中的交联密度、蛋白质向基质外的扩散和基质本身的溶解等因素。聚合物皮层的性质可以通过几个因素来调节，包括可交联聚合物的分支(4臂或8臂)、可交联聚合物的臂的长度以及-NHS基团与-NH基团的摩尔比(MR)。

亲核基团与亲电基团的摩尔比可以决定交联密度。1摩尔比导致最高的交联密度。大于或小于1的摩尔比可以导致比1摩尔比低的交联密度。交联密度随着摩尔比的增加而增加，直到它达到1，然后交联密度随着摩尔比增加超过1而降低。当交联密度较低时，包埋在水凝胶中的药物可以更快地释放。结果是，通过调节亲核基团与亲电基团的摩尔比，可以调节药物的释放动力学。

摩尔比可以有效地调节水凝胶基质内的交联密度(形成网络的共价交联的数量)和网络孔径两者。通过降低交联密度，可以增加基质的有效孔径，使得药物更快地扩散通过基质。此外，降低交联密度可以增加水凝胶中的微区(domain)，其中围绕蛋白质颗粒的交联聚合物的局部浓度不足以在水合时将蛋白质保持为固态，导致突释(burst release)以及基于质量的扩散速率增加。因此，随着摩尔比的增加，扩散控制模式下的突释和释放动力学两者都可能增加。

此外，Chen等人(美国专利申请公开号US2020/0038328A1，其通过引用并入本文)观察到，随着摩尔比的增加，在溶解控制模式中释放曲线的斜率增加。这可以通过随着摩尔比的增加交联程度的降低来解释，因为在可用于反应和交联的亲核基团和亲电基团的数量之间存在更大的不匹配。生长速率由交联的水解速率决定，导致水凝胶溶胀的增加，伴随交联聚合物的局部浓度降低，这导致蛋白质颗粒的额外溶解。水凝胶的溶胀也与水凝胶的孔隙率相关，水凝胶的孔隙率随着蛋白质溶解的发生而增加。随着摩尔比的增加和水合时蛋白质溶解的增加，水凝胶的有效孔隙率也将增加，导致更多的溶胀、更快的水解和在溶解控制模式下更快的生长速率。此外，识别扩散和溶解控制模式之间的转变的拐点将与摩尔比负相关。因有效扩散速率随摩尔比的增加而增加，扩散增加到不再是限速步骤所花费的时间减少，从而将拐点移动到更早的时间点。综合考虑，仅改变摩尔比可以允许根据期望的结果将释放曲线从接近线性调节到s形。

在一些示例性的实施方案中，亲核基团与亲电基团的摩尔比大于1。在其他示例性的实施方案中，亲核基团与亲电基团的摩尔比小于1。在其他示例性的实施方案中，亲核基团与亲电基团的摩尔比可以在约0.1至3.0的范围内，例如约0.1至0.9、约0.1至0.8、约0.1至0.7、约0.1至0.6、约0.2至0.9、约0.2至3.0、约0.2至2.8、约0.2至2.5、约0.5至2.5、约0.5至2.0、约0.8至2.5、约0.8至2.0、约1.1至2.0、约1.1至2.5、约1.1至3.0、约1.5至3.0、约1.5至2.5、约1.5至2.0或约1.3至1.8。在一些示例性的实施方案中，亲核基团与亲电基团的摩尔比可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0。

与摩尔比相关，第一前体中亲核基团的数量和/或第二前体中亲电基团的数量也可以决定交联密度。通常，在给定的摩尔比下，亲核基团或亲电基团的数量越多，交联密度越高。在一些实施方案中，所述方法包括选择释放期为60天或更长的8臂PEG NH和8臂PEGNHS试剂。在一些实施方案中，所述方法包括选择释放期少于60天的4臂PEG NH和4臂PEGNHS试剂。

可以用于调节水凝胶微粒的释放动力学的另一参数是第一可交联聚合物和/或第二可交联聚合物的分子量。在给定的摩尔比下，可交联聚合物的分子量越低，网络孔径越小。第一可交联聚合物和第二可交联聚合物的分子量对释放曲线具有非连续的或离散的影响。如本文所使用的，术语“非连续的”或“离散的”意味着不能在水平之间进行插值。例如，具有预定分子量的第一可交联聚合物和第二可交联聚合物(例如，PEG试剂)的组合可以限定可能的释放期范围。其他因素如摩尔比可以用于微调释放曲线或释放期。

可以用于调节释放动力学的另一个参数是药物和赋形剂与水凝胶的重量比。药物和赋形剂与水凝胶的重量比在本文中也被称为“固体负载量(solid loading)”。这是指药物和赋形剂与包括载药水凝胶的药物、赋形剂和聚合物的总重量的重量比。增加固体负载量可以改变释放曲线的形状，这主要是因为在拐点之前的初始扩散阶段期间更快的释放。在溶解阶段的开始(拐点)和固体负载量之间也可能存在反比关系。不希望受理论的束缚，随着固体负载量的增加，预期在初始扩散阶段期间更快的释放，因为在相对低的可交联聚合物浓度的微环境中将存在更大量的药物，其中药物溶解度较少受到限制。此类区域中的药物可以在基质的初始水合时溶解，从而增加浓度依赖性扩散的速率。此外，对于蛋白质颗粒形式的药物，在初始水合时溶解的蛋白质颗粒的增加将在基质内产生空隙，并且导致基质孔隙率的增加。更多孔的基质也将增加扩散通过本体基质的有效速率，并且当其到达表面时被释放。不希望受理论的束缚，拐点和固体负载量之间的反相关性也可以通过观察到的扩散速率随着固体负载量的增加而增加来进行假设性解释。拐点表示扩散控制模式和溶解控制模式之间的转变。随着固体负载量的增加，扩散速率开始更高并且更快速地增加，导致扩散不再受速率限制之前的持续时间更短。在扩散控制模式下，溶解的药物扩散通过基质是药物释放的限速步骤。随着更多的蛋白质颗粒溶解，在基质中产生空隙，并且基质的孔隙率增加，导致扩散速率增加。在溶出控制模式下，扩散通过基质不再是限速步骤。随着固体负载量的增加，这一点更快速地达到。

在一些示例性的实施方案中，分散相悬浮液中可交联聚合物或聚合物前体的浓度可以在约1％w/v和50％w/v之间、在约1％w/v和35％w/v之间、在约1％w/v和20％w/v之间、在约5％w/v和50％w/v之间、在约5％w/v和35％w/v之间、在约5％w/v和20％w/v之间、约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、约10％w/v、约15％w/v、约20％w/v、约25％w/v、约30％w/v、约35％w/v、约40％w/v、约45％w/v或约50％w/v。

在一些示例性的实施方案中，本公开提供了一种用于通过将(1)分散相与(2)连续相组合以形成分散相的乳液液滴来生产聚合物涂覆的微球的方法，所述分散相具有悬浮在烃溶液中的1.0％w/v至30.0％w/v的喷雾干燥的蛋白质，其中所述烃溶液包括在烃溶剂中的5.0％w/v至35％w/v的一种或多种可交联聚合物，其中所述连续相包括含有0.1％w/v至5.0％w/v含氟表面活性剂的碳氟化合物溶液。所述方法进一步包含通过去除烃溶液来使乳液液滴硬化，以形成硬化的交联聚合物涂覆的微球。

在一些示例性的实施方案中，碳氟化合物溶液可以为高粘度碳氟化合物，如全氟C5-C18化合物，包含但不限于FC-40或FC-70，并且烃溶液可以选自包含乙酸乙酯、氯仿、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷或其组合的群组。在一些示例性的实施方案中，含氟表面活性剂可以是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，可作为Pico-Surf^TM 1商购获得。所述方法还可以包括在真空下搅拌乳液以去除烃，加入氢氟醚(HFE)以加速微球的硬化，和/或过滤以去除碳氟化合物溶液。

在其他示例性的实施方案中，喷雾干燥的蛋白质可以被包封在交联的聚乙二醇微凝胶中。PEG的交联可以通过将含有亲核基团的PEG前体(如例如PEG-NH)与含有亲电基团的PEG前体(如例如PEG-NHS)混合来实现。在一些示例性的实施方案中，向反应混合物中加入非官能化的PEG可以用于调节交联反应速度，因为非官能化的PEG保持烃相粘度，同时降低官能化的PEG前体的浓度。因此，改变官能化的PEG前体与交联调节剂(纯的非官能化的PEG)的比率可以用于实现期望的胶凝时间。

在一些示例性的实施方案中，分散相悬浮液中交联调节剂的浓度可以在约1％w/v和50％w/v之间、在约1％w/v和35％w/v之间、在约1％w/v和20％w/v之间、在约5％w/v和50％w/v之间、在约5％w/v和35％w/v之间、在约5％w/v和20％w/v之间、约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、约10％w/v、约15％w/v、约20％w/v、约25％w/v、约30％w/v、约35％w/v、约40％w/v、约45％w/v或约50％w/v。

仍其他示例性的实施方案提供了用于通过制备含有溶解的可交联聚合物和喷雾干燥的蛋白质粉末的烃溶液以生产分散相来生产交联聚合物涂覆的微粒的方法。所述方法进一步包括将分散相与连续相组合以在连续相中产生分散相的乳液液滴，其中连续相包括碳氟化合物液体和0.1％w/v至5.0％w/v的含氟表面活性剂；以及收获聚合物涂覆的微粒。烃溶液可以包含选自包含乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或其组合的群组的烃溶剂。碳氟化合物溶液可以是高粘度的碳氟化合物。在示例性的实施方案中，碳氟化合物溶液可以含有FC-40或FC-70，并且含氟表面活性剂可以是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，可作为Pico-Surf^TM 1商购获得。

烃溶剂

在一些示例性的实施方案中，选择烃溶剂(也被称为烃液体)，使得聚合物材料(例如，可生物降解或可生物溶蚀的可交联聚合物)可溶于烃中。在一些实施方案中，烃溶剂选自包含二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合的群组。在一些实施方案中，烃溶剂可以含有乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、乙醇、甲醇、戊烷、丙醇、己烷或其组合。

含氟液体

示例性的含氟液体为碳氟化合物液体，包含但不限于Flourinert^TM FC-40(平均MW＝650g/mol)1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺、Fluorinert^TM FC-70(平均MW＝821g/mol)(全氟三戊胺)或其组合。在一些示例性的实施方案中，碳氟化合物液体是或包括氢氟醚(HFE)。示例性的HFE包含但不限于NOVEC^TM 7000(1-甲氧基七氟丙烷)、NOVEC^TM 7100(甲氧基-九氟丁烷)、NOVEC^TM 7200(乙氧基-九氟丁烷)或NOVEC^TM 7500(2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷)。在仍其他示例性的实施方案中，碳氟化合物液体包括FC-40、FC-70、Novec^TM 7500、Novec^TM 7100、Novec^TM 7000或其组合。在某些实施方案中，除了含氟液体之外，第二溶液或连续相溶液还包括含氟表面活性剂(FS)。示例性的FS是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚(PFPE-PEG-PFPE)三嵌段共聚物，其可作为Pico-Surf^TM 1商购获得。在一些示例性的实施方案中，碳氟化合物液体或第二溶液或连续相溶液包括FC-40和Pico-Surf^TM 1。

在一些示例性的实施方案中，FS为：

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其中

其中：n～37，x+z～6.0，y～12.5，或者其中n＝3.7，x+z～3.6，y～9.0。(参见Lee,M.等人，《芯片实验室(Lab Chip.)》，7:14(3):509-13(2014))。

在一些示例性的实施方案中，HFE具有以下化学结构，对应于2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷：

在其他示例性的实施方案中，碳氟化合物液体或第二溶液或连续相溶液包括FC-70，具有如图1B所示的结构。

适用于根据本公开的方法的其他HFE包括这样的一类分子，其中所有氢原子位于没有氟取代的碳上并通过醚氧(即RfORh)与氟化的碳分离。HFE具有可以是直链、支链或环状或其组合的分子结构(如烷基环脂肪族)，并且优选地不含烯属不饱和基团(unsaturation)，具有总共约4至约20个碳原子。此类HFE是已知的并且可容易地以基本上纯的化合物或混合物的形式获得。由于HFE的亲油性和亲氟性，它们可与碳氟化合物和烃两者混溶。当加入到烃/碳氟化合物乳液中时，HFE可以充当共溶剂以将烃提取到碳氟化合物相中并且加速硬化过程。

在一些示例性的实施方案中，通过在搅拌乳液的同时任选地在真空下蒸发来去除烃溶剂、碳氟化合物或两者。在一些示例性的实施方案中，通过过滤，任选地在真空下过滤来收获微粒。

碳氟化合物相中HFE的百分比可以为0v/v至40％v/v，这取决于不同HFE的亲油性和亲氟性。增加HFE的百分比增加了烃提取率。然而，HFE的百分比不应太高，因为微粒的大小和形态可能变得更难控制。

可溶蚀或可生物降解的聚合物交联调节剂

为了在降低官能化的可交联聚合物浓度的同时保持烃相粘度，可以向烃相中加入交联调节剂。这将降低交联反应速度并延长胶凝时间。在一些示例性的实施方案中，交联调节剂是非官能化的可溶蚀或可生物降解的聚合物。

在示例性的实施方案中，交联调节剂是聚合物，所述聚合物选自包括以下的群组：支链或直链聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷富马酸酯、酯化为聚乙二醇1000的PLGA-α-生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酸酐聚[1,6-双(对羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟基丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚氰基丙烯酸烷基酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚氰基丙烯酸异丁酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚-β-R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DOPC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、海藻酸盐、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔豆胶、壳聚糖、甲壳素、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚准轮烷(polypseudorotaxane)、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、聚赖氨酸、亮氨酸-谷氨酸盐共聚物、聚丁二酸丁二醇酯、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、并入潜酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物及其组合和共聚物。

如本文所使用的，术语“聚合物”是指含有通过共价化学键连接的重复单体的大分子。在一些示例性的实施方案中，聚合物可以是生物相容的、可生物降解的和/或可生物溶蚀的。生物相容的和/或可生物降解的聚合物可以是天然的或合成的。

在一些示例性的实施方案中，可溶蚀的聚合物或可生物降解的聚合物可以为通过交联连接的聚合物网络的一部分。交联可以具有共价、离子、亲和力或物理基础。根据本公开的示例性的实施方案中存在的共价交联可以利用具有多个反应性官能团的聚合物或聚合物前体，所述聚合物或聚合物前体被混合并被触发以彼此反应，形成基质。对于使用H/F乳液制备水凝胶微粒(微凝胶)，交联反应应该主要在乳化过程之后开始，并在烃乳液液滴中进行，以形成稳定交联的和独特的微凝胶颗粒。因此，控制交联反应动力学或胶凝化速率有助于生产具有期望的特性的独特的交联微凝胶颗粒。

蛋白质药物

通常，可以将任何活性成分并入到本公开的微粒中。在一些示例性的实施方案中，活性成分是药物。在具体的示例性实施方案中，活性成分是蛋白质。此类蛋白质可以包含但不限于抗体、受体、融合蛋白、拮抗剂、抑制剂、酶(如用于酶替代疗法的酶)、因子和辅因子、细胞因子、趋化因子、阻遏物、激活剂(activator)、配体、报告蛋白、选择蛋白、蛋白质激素、蛋白质毒素、结构蛋白质、储存蛋白质、转运蛋白、神经递质和收缩蛋白质。通常，蛋白质被微粉化，例如通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合被微粉化。在一些示例性的实施方案中，蛋白质是VEGF-Trap蛋白质或其截短形式。下文描述了可以用于所公开的方法的蛋白质的其他实例。

在一些示例性的实施方案中，通过所公开的无水乳液方法和体系生产的微粒制剂包含药物。示例性的药物包含但不限于蛋白质、融合蛋白及其片段、抗体及其抗原结合片段。在一些示例性的实施方案中，蛋白质是VEGF-Trap蛋白质(例如，阿柏西普，其含有与融合到hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，例如如美国专利第7,087,411号、第7,279,159号和第8,144,840号中所述，这些专利通过引用以其整体并入本文)。在一些示例性的实施方案中，VEGF-Trap蛋白质是如美国专利第7,396,664号中所述的截短形式的VEGF-Trap，该专利通过引用以其整体并入。

抗体(也被称为“免疫球蛋白”)是具有多个多肽链和广泛翻译后修饰的蛋白质的实例。典型的免疫球蛋白蛋白质(例如IgG)包括四条多肽链——两条轻链和两条重链。每条轻链经由半胱氨酸二硫键与一条重链相连，两条重链经由两个半胱氨酸二硫键彼此结合。在哺乳动物体系中产生的免疫球蛋白也在不同的残基处(例如，在天冬酰胺残基处)用不同的多糖糖基化，并且可能因物种而异，这可能影响治疗性抗体的抗原性。Butler和Spearman，“哺乳动物细胞宿主的选择和糖基化工程的可能性(The choice of mammaliancell host and possibilities for glycosylation engineering)”，《生物技术的当前观点》，30:107-112(2014)。

抗体重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中被缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的区，称为构架区(FR)。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链CDR可以被缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以被缩写为LCDRl、LCDR2和LCDR3。术语“高亲和力”抗体是指对其靶标具有至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M的结合亲和力的抗体，所述结合亲和力如通过表面等离子体共振，例如BIACORE^TM或溶液亲和力ELISA所测量的。

抗体轻链包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(VL)结构域通常包括三个轻链CDR和四个框架(FR)区。通常，全长轻链从氨基末端到羧基末端包含VL结构域和轻链恒定结构域，所述VL结构域包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可以用于这些发明的轻链包含例如不选择性地结合由抗原结合蛋白选择性结合的第一或第二抗原的轻链。合适的轻链包括可以通过在现有抗体文库(湿文库或计算机)中筛选最常用的轻链被鉴定的那些轻链，其中轻链基本上不干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。合适的轻链包含可以结合抗原结合蛋白的抗原结合区所结合的一个或两个表位的那些轻链。

抗体可变结构域包含免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(根据需要进行修饰)，其包括从N末端到C末端的序列中的下列氨基酸区域(除非另有说明)：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“可变结构域”包含能够折叠成具有双β折叠结构的典型结构域(VH或VL)的氨基酸序列，其中β折叠通过第一β折叠和第二β折叠的残基之间的二硫键连接。

抗体互补决定区(“CDR”)包含由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如种系序列或重排或未重排的序列编码，并且例如由原初或成熟的B细胞或T细胞编码。在一些情况下(例如，对于CDR3)，CDR可以由不连续(例如，在尚未重排的核酸序列中)但在B细胞核酸序列中连续的两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，例如，作为剪接或连接序列的结果(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。

可以根据本发明的方法生产抗体的上述组分中的每一种。

双特异性抗体包含能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，其中每条重链特异性地结合两种不同的分子(例如抗原)上或者相同分子上(例如相同抗原上)的不同的表位。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以在同一或不同的靶标上(例如，在同一或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条重链具有三个重链CDR，接着是(N末端到C末端)CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域；以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但是可以与每条重链缔合，或者可以与每条重链缔合并且可以结合一个或多个由重链抗原结合区结合的表位，或者可以与每条重链缔合并使一条或两条重链与一个或两个表位结合，并且可以根据本发明生产。

例如，对于抗体实施方案，本发明适用于基于所有主要抗体类别(即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)的诊断和治疗的研究和生产用途。IgG是优选的类别，如IgG1(包括IgG1λ和IgG1κ)、IgG2和IgG4。根据本发明生产的示例性的抗体包括阿利库单抗、阿替韦单抗(Atoltivimab)、玛替韦单抗(Maftivimab)、奥西韦单抗(Odesivimab)、奥西韦单抗-ebgn、卡斯瑞韦单抗(Casirivimab)、依米得韦单抗(Imdevimab)、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度匹鲁单抗、依维苏单抗(Evinacumab)、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗(Fasimumab)、奈伐苏单抗(Nesvacumab)、曲戈卢单抗(Trevogrumab)、利努苏单抗(Rinucumab)和沙利鲁单抗。

在一些示例性的实施方案中，微粒制剂中的蛋白质是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体、被称为双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IG)的双特异性四价免疫球蛋白G样分子、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一些示例性的实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一些示例性的实施方案中，抗体是IgG2抗体。在仍其他示例性的实施方案中，抗体是IgG4抗体。在其他示例性的实施方案中，抗体包含嵌合铰链。在仍其他示例性的实施方案中，抗体包含嵌合Fc。在其他示例性的实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在其他示例性的实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一些示例性的实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。

在一些示例性的实施方案中，抗体选自包括以下的群组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，如在美国专利第9,987,500号中描述的抗PD1抗体)、抗程序性细胞死亡配体-1抗体(例如，如在美国专利第9,938,345号中描述的抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素-2抗体(例如，如在美国专利第9,402,898号中描述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如在美国专利第9,018,356中描述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板源性生长因子受体抗体(例如，如在美国专利第9,265,827号中描述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如在美国专利第9,302,015中描述的抗PRLR抗体)、抗补体抗体(例如，如在美国专利第9,795,121号中描述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如在美国专利第9,132,192中描述的抗EGFR抗体或者如在美国专利第9,475,875号中描述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如，如在美国专利第8,062,640号或美国专利第9,540,449号中描述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子-8抗体(例如，抗GDF8抗体，也被称为抗肌肉生长抑制素抗体，如在美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所描述的)、抗胰高血糖素受体抗体(例如，如在美国专利第9,587,029号或第9,657,099号中描述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗白细胞介素4受体抗体(例如，如在美国专利申请公开第US2014/0271681A1号或美国专利第8,735,095或第8,945,559号中描述的抗IL4R抗体)、抗白细胞介素6受体抗体(例如，如在美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中描述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白细胞介素33(例如，如在美国专利第9,453,072号或第9,637,535号中描述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞体病毒抗体(例如，如在美国专利第9,447,173号和第10,125,188号以及美国专利申请公开第US2019/0031741A1号中描述的抗RSV抗体)、抗分化簇3抗体(例如，如在美国专利第9,657,102号中描述的抗CD3抗体)、抗分化簇抗体(例如，如在美国专利第9,657,102号和第US20150266966A1号以及美国专利第7,879,984号中描述的抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇-48抗体(例如，如在美国专利第9,228,014号中描述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如在美国专利第9,079,948号中所描述的)、SARS-CoV-2治疗(REGN-COV^TM，包括抗SARS-CoV-2抗体卡斯瑞韦单抗和依米得韦单抗)、抗SARS-CoV-2抗体、抗中东呼吸综合征病毒抗体(例如，如在美国专利第9,718,872号中描述的抗MERS抗体)、抗Ebola的抗体混合物(REGN-EB3，包括阿替韦单抗、玛替韦单抗和奥西韦单抗-ebgn)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如在美国专利第9,771,414号中所描述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞激活基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如在美国专利申请公开第US2016/0017029号和美国专利第8,309,088号和第9,353,176号中描述的抗NGF抗体)、抗激活素A抗体以及抗蛋白质Y抗体。

在一些示例性的实施方案中，双特异性抗体可以选自包括以下的群组：抗CD3 x抗CD20双特异性抗体(如在美国专利第9,657,102号和第US20150266966A1号中所描述的)、抗CD3 x抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3 x抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3 x抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3 x抗PSMA双特异性抗体)。

在一些示例性的实施方案中，蛋白质可以选自包括以下的群组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿柏西普、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、柏达鲁单抗(brodalumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡普罗单抗潘代肽(capromab pendetide)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库丽单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗-kxwh(emicizumab-kxwh)、恩美阿利库单抗(emtansinealirocumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、法司努单抗、戈利木单抗(golimumab)、古赛奇尤单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、艾达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda、英夫利昔单抗-dyyb、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努苏单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗、苏金单抗(secukinumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托珠单抗、曲妥单抗(trastuzumab)、曲戈卢单抗(trevogrumab)、优特克单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。

抗体衍生物和片段适于根据本发明生产，并且包含但不限于：抗体片段(例如，ScFv-Fc、dAB-Fc、半抗体(half antibody))、多特异性(例如，IgG-ScFv、IgG-dab、ScFV-Fc-ScFV、三特异性)和Fc融合蛋白(例如，Fc融合蛋白(N末端)、Fc融合蛋白(C末端)、单Fc融合蛋白、双特异性Fc融合蛋白)。短语“含Fc的蛋白质”包含抗体、双特异性抗体、含Fc的抗体衍生物、含Fc的抗体片段、Fc融合蛋白、免疫粘附素和包括免疫球蛋白CH2和CH3区域的至少一个功能部分的其他结合蛋白质。“功能部分”是指可以结合Fc受体(例如，FcyR、或FcRn(新生儿Fc受体)和/或可以参与补体激活的CH2和CH3区域。如果CH2和CH3区域包含使其不能结合任何Fc受体并且也不能激活补体的缺失、取代和/或***或其他修饰，则CH2和CH3区域是没有功能的。

具有非天然形式的抗原结合分子(ABM)和ABM缀合物，如非天然构型中的Fab结构域，可以根据本发明表达并且公开在WO 2021/026409 A1中。多特异性结合分子(MBM)和MBM缀合物可以根据本发明生产，并且公开在WO 2021/091953A1和WO 2021/030680A1中。

含Fc的蛋白质可以包括免疫球蛋白结构域中的修饰，包含影响结合蛋白质的一种或多种效应子功能的修饰(例如，影响FcyR结合、FcRn结合并因此影响半衰期和/或CDC活性的修饰)。参照免疫球蛋白恒定区的EU编号，此类修饰包括但不限于以下修饰及其组合：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。

例如并且不限于，结合蛋白质可以是含Fc的蛋白质，并且表现出增强的血清半衰期(与没有所述修饰的相同的含Fc的蛋白质相比)，并且具有在位置250处的修饰(例如，E或Q)；在250和428处的修饰(例如L或F)；在252处的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254处的修饰(例如S或T)、在256处的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或者在428和/或433处的修饰(例如，L/R/SI/P/Q或K)和/或在位置434处的修饰(例如，H/F或Y)；或者在250和/或428处的修饰；或者在307或308处的修饰(例如，308F、V308F)和在434处的修饰。在另一个实例中，修饰可以包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L，2591(例如V259I)，308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；307和/或308修饰(例如，308F或308P)。

如上所述，本发明也适用于生产其他分子，包含融合蛋白。这些蛋白质可以包括两种或更多种蛋白质的部分或全部，其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分，所述两种或更多种蛋白质在其天然状态下不融合。Fc融合蛋白包含Fc融合体(Fc-Fusion)(N末端)、Fc融合体(C末端)、单一Fc融合体和双特异性Fc融合体。包括与抗体衍生的多肽的不同部分(包含Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已经由例如以下描述：Ashkenazi等人，《美国国家科学院院刊》，88:10535-39(1991)；Byrn等人，《自然》344:677,1990；以及Hollenbaugh等人，“免疫球蛋白融合蛋白的构建(Construction of ImmunoglobulinFusion Proteins)”,《当代免疫学实验指南》，增刊4，第10.19.1-10.19.11页，1992。含受体Fc的蛋白质还在C.Huang，“受体-Fc融合体治疗剂trap和MFMETIBODY技术(Receptor-Fcfusion therapeutics,traps,and MFMETIBODY technology)”，20(6)《生物技术的当前观点》，692-9(2009)中有所描述。

受体Fc-融合蛋白包括与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域中的一个或多个，在一些实施方案中，Fc部分包括免疫球蛋白的铰链区，随后是CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc-融合蛋白含有结合至单个配体或多于一个配体的两个或更多个不同的受体链。一些受体Fc融合蛋白可能含有多种不同受体的配体结合结构域。

在一些示例性的实施方案中，蛋白质可以是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白质(例如，Fc融合蛋白)。在其他示例性的实施方案中，Fc-融合蛋白是受体Fc-融合蛋白，其含有一个或多个与Fc部分偶联的受体的胞外结构域。在其他示例性的实施方案中，Fc部分包括IgG的铰链区，随后是CH2和CH3结构域。在还其他示例性的实施方案中，受体Fc-融合蛋白含有两条或更多条不同的受体链，这些受体链结合至单个配体或多个配体。

例如，Fc-融合蛋白可以是TRAP蛋白质，如例如IL-1trap(例如，利纳西普，其含有与融合到hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利第6,927,004号，其通过引用以其整体并入本文)，或VEGF-Trap(例如，阿柏西普或ziv-阿柏西普，其包括与融合到hIgG10的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2)。在其他示例性的实施方案中，Fc-融合蛋白可以是ScFv-Fc-融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域，如可变重链片段和可变轻链片段。

小型trap蛋白质是使用多聚化组分(MC)而非Fc部分的trap蛋白质，并在例如美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中公开，并且可以根据本发明生产。

在示例性的实施方案中，初始蛋白质为干燥粉末的形式，例如微粉化的干燥粉末。在一些示例性的实施方案中，蛋白质是喷雾干燥的粉末(SDP)。使用喷雾干燥的蛋白质代替蛋白质溶液的优点是微粒中的蛋白质负载量更高和包封过程期间蛋白质稳定性更好。

在一些示例性的实施方案中，在整个包封过程和储存条件期间，干燥蛋白质分子保持固态，并被稳定剂或其他赋形剂包围。蛋白质粉末中的赋形剂可以包含任何已知在储存期间改善蛋白质稳定性的赋形剂，例如山梨醇、甘油、甘露醇、海藻糖、蔗糖、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸、组氨酸、氯化钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇或磷酸盐缓冲液。

在示例性的实施方案中，包封的喷雾干燥的蛋白质表现出高回收率和低聚集，这可能归因于最小化的表面相互作用，因为只有一小部分表面蛋白质被暴露于界面。在还其他示例性的实施方案中，蛋白质在包封前被微粉化。

水凝胶微粒(微凝胶)

在其他示例性的实施方案中，提供了使用所公开的非水性乳液体系生产的药物组合物。在其他示例性的实施方案中，药物组合物包括具有聚合物皮层和微粉化的蛋白质核的微凝胶。在还其他示例性的实施方案中，微凝胶包括形状为大致球形的微粒。

一些微粒和蛋白质核将接近球形，而其他微粒和蛋白质核的形状将更加不规则。因此，如本文所使用的，术语“直径”意指以下中的每一个或任何一个：(a)包围微粒或蛋白质核的球体的直径，(b)适合在微粒或蛋白质核的限定内的最大球体的直径，(c)在(a)的包围球体与(b)的限定球体之间的任何测量值，包含两者之间的平均值；(d)微粒或蛋白质核的最长轴线的长度；(e)微粒或蛋白质核的最短轴线的长度；(f)长轴线的长度(d)与短轴线的长度(e)之间的任何测量值，包含两者之间的平均值；以及/或(g)如由微流成像(MFI)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)或通过光散射方法(如静态光散射(SLS)、动态光散射(DLS)或激光衍射分析)获得的体积或数均直径确定的等效圆直径(“ECD”)。直径通常以微米(μm或um)表达。直径可以通过光学测量或扫描电子显微术测量来确定。

通过所公开的非水性乳液方法生产的微粒包含具有低、非常低或接近于零的量的水(例如，按重量计少于3％的水)的多个蛋白质分子。在一些示例性的实施方案中，微粉化的蛋白质颗粒可以具有在2微米至约35微米、或2.0μm至50μm、或5.0μm至15.0μm的范围内、或约10μm的ECD。微粉化的蛋白质颗粒不限于任何特定蛋白质实体，并且适用于包含上文所描述的蛋白质的治疗性蛋白质的制备和递送。

例如，可以通过喷雾干燥、冻干和研磨、喷射研磨、在非溶剂中的可逆沉淀、制粒、逐渐沉淀(参见美国专利第7,998,477号)、超临界流体沉淀(参见美国专利第6,063,910号)或高压二氧化碳诱导的颗粒形成来将蛋白质颗粒微粉化(Bustami等人，《药物研究(Pharma.Res.)》17:1360-66(2000))。如本文所使用的，短语“喷雾干燥”是指通过使用喷雾干燥器从浆料或悬浮液中生产包含微米级颗粒的干燥粉末的方法。喷雾干燥器采用雾化器或喷嘴将悬浮液或浆料分散成受控的液滴尺寸喷雾。

可以通过喷雾干燥产生10μm至500μm的液滴尺寸。随着溶剂(水或有机溶剂)干燥，蛋白质物质干燥成微米级颗粒，形成粉末状物质；或者在蛋白质-聚合物悬浮液的情况下，在干燥期间，聚合物使蛋白质负载量周围的壳硬化。

在一些示例性的实施方案中，悬浮在分散相悬浮液(例如包括烃溶液的分散相)中的微粉化的蛋白质粉末的浓度在约1％w/v和50％w/v之间、在约1％w/v和30％w/v之间、在约1％w/v和20％w/v之间、在约1％w/v和10％w/v之间、在约1％w/v和5％w/v之间、在约5％w/v和30％w/v之间、在约5％w/v和20％w/v之间、在约5％w/v和10％w/v之间、约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、约10％w/v、约15％w/v、约20％w/v、约25％w/v、约30％w/v、约35％w/v、约40％w/v、约45％w/v或约50％w/v。

在一些实施方案中，微粉化的蛋白质为VEGF-Trap蛋白质。用于形成微粉化的VEGF-Trap蛋白质颗粒的药物制剂可以含有约10mg/mL至约100mg/mL VEGF-Trap蛋白质、约1.0mg/mL至约50mg/mL蛋白质、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或约100mg/mL VEGF Trap蛋白质。在一些示例性的实施方案中，VEGF-Trap蛋白质可以是适于玻璃体内施用至眼睛的眼用制剂，基本上类似于美国专利第8,092,803号中公开的制剂，该专利通过引用并入本申请中。

在示例性的实施方案中，使用所公开的非水性乳液体系制备的微粒可以具有约1μm至约200μm、约1μm至约150μm、约1μm至约100μm、约2μm至约70μm、约5μm至约65μm、约10μm至约60μm、约15μm至约55μm、约10μm至约50μm、约1.0μm至15μm、约20μm、约25μm或约30μm、约的直径范围。尺寸变化在很大程度上反映了聚合物皮层的厚度，尽管蛋白质核的直径在一定程度上可能会导致尺寸变化。

在一些示例性的实施方案中，通过所公开的非水性乳液方法形成的微粒是可流动的微粒组合物。所公开的可流动的微粒组合物可以与药学上可接受的赋形剂一起悬浮在药学上可接受的制剂中，例如悬浮在包括pH缓冲盐水、水溶液或非水性溶液的制剂中。

术语“赋形剂”包括加入到药物组合物中以提供期望的稠度或稳定效果的任何非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。可流动的微粒组合物可以例如使用注射器(如带有27G针头的注射器)被肠胃外施用。微粒可用于蛋白质治疗剂的延时释放或延长释放。

术语“制剂”包含药物或治疗剂(例如本发明的微粒)与可用于治疗剂的应用的任何额外的组分、赋形剂或媒介物的任何组合。在一些示例性的实施方案中，制剂可以包含微粒和pH缓冲盐水、水溶液或非水性溶液。在一些示例性的实施方案中，微粒制剂被玻璃体内、脉络膜上或皮下注射。例如，设想VEGF-Trap微粒可用于在例如玻璃体中延长或持续释放VEGF-Trap治疗性蛋白质以用于治疗血管性眼部病症，或者可用于皮下植入以用于延长或持续释放VEGF-Trap以治疗其他病症。

根据本公开的微粒在约37℃的生理水性环境中以相对恒定的速率在至少60、90、120或150天的延长的时间段内释放蛋白质(持续释放)。

在一些示例性的实施方案中，提供了含有使用本文公开的非水性乳液方法生产的微粒的组合物，其中所述组合物包含大于100mg的喷雾干燥的蛋白质。在一些示例性的实施方案中，非水性乳液方法具有大于90％的产率，并且生产具有大于99％的纯度和大于10％w/w负载量且对于50-100μL注射体积具有大于10％的爆裂的微粒。

包含根据本公开制备的微粒的药物制剂可以容纳在任何适合于储存药物和其他治疗组合物的容器中。例如，示例性的药物制剂可以容纳在具有限定容积的密封和灭菌的塑料或玻璃容器(如小瓶、安瓿、注射器、药筒或瓶子)中。可以使用不同类型的小瓶容纳本公开的制剂，包括例如透明和不透明(例如琥珀色)的玻璃或塑料小瓶。同样，可以使用任何类型的注射器容纳或施用本公开的药物制剂。

包含根据本公开制备的微粒的药物制剂可以容纳在“普通钨”注射器或“低钨”注射器中。如本领域普通技术人员将理解的，制造玻璃注射器的过程通常涉及使用热钨棒，所述热钨棒用于刺穿玻璃，从而形成孔，从中可以抽出液体，并且将其从注射器中排出。这一过程导致微量的钨沉积在注射器的内表面上。随后的洗涤和其他处理步骤可以用于减少注射器中的钨含量。如本文所使用的，术语“普通钨”意指注射器含有大于或等于十亿分之500(ppb)的钨。术语“低钨”意指注射器含有少于500ppb的钨。例如，根据本公开，低钨注射器可以含有少于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更少ppb的钨。

可以对注射器中使用的橡胶柱塞和用于封闭小瓶开口的橡胶塞进行涂覆，以防止污染注射器或小瓶的药物成分或保持其稳定性。因此，根据某些实施方案，本公开的药物制剂可以容纳在包括涂覆的柱塞的注射器内，或者容纳在用涂覆的橡胶塞密封的小瓶内。例如，柱塞或塞子可以涂覆有碳氟化合物膜。适用于容纳有本公开的药物制剂的小瓶和注射器的涂覆的塞子或柱塞的实例在例如美国专利第4,997,423号、第5,908,686号、第6,286,699号、第6,645,635号和第7,226,554号中提及，这些专利的内容通过引用以其整体并入本文。

可以用于本公开的上下文中的示例性的涂覆的橡胶塞和柱塞可从WestPharmaceutical Services,Inc.(宾夕法尼亚州狮城(Lionville,Pa.))以商品名商购获得。/>是用于最小化或防止药物产品粘附到橡胶表面的碳氟化合物涂层的实例。

示例性药物制剂可以容纳在低钨注射器内，该注射器包括碳氟化合物涂覆的柱塞。

示例性的药物制剂可以通过肠胃外途径如注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)或经皮、粘膜、鼻、肺或口服施用被施用于患者。许多可重复使用的笔或自动注射器递送装置可以用于皮下递送本公开的药物制剂。实例包括但不限于(OwenMumford,Inc.,英国伍德斯托克(Woodstock,UK))、Disetronic Pen(Disetronic MedicalSystems，瑞士伯格多夫(Bergdorf,Switzerland))、/>笔、/>笔、/>70/30笔(Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,Ind.))、/>I、II和III(Novo Nordisk，丹麦哥本哈根(Copenhagen,Denmark))、Junior(Novo Nordisk，丹麦哥本哈根)、BD^TM笔(Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,N.J.))、/>OptiPen/>和OptiPen Starlet^TM以及(Sanofi-Aventis，德国法兰克福(Frankfurt,Germany))。

在皮下递送本公开的药物组合物中具有应用的一次性笔或自动注射器递送装置的实例包括但不限于笔(Sanofi-Aventis)、/>(Novo Nordisk)和KwikPen^TM(Eli Lilly)、SureClike^TMAutoinjector(Amgen，加利福尼亚州千橡树市(Thousand Oaks,Calif.))、/>(Haselmeier，德国斯图加特(Stuttgart,Germany))、(Dey,L.P.)和/>笔(Abbott Labs,伊利诺斯州雅培科技园(Abbott Park,Ill.))。

本文也预期了使用微灌注器来递送包含根据本公开制备的微粒的药物制剂。如本文所使用的，术语“微灌注器”意指一种皮下递送装置，其被设计成在延长的时间段内(例如约10、15、20、25、30分钟或更长时间)缓慢地施用大体积(例如高达约2.5mL或更多)的治疗制剂。参见，例如，美国专利第6,629,949号；美国专利第6,659,982号；和Meehan等人，《受控释放杂志(J.Controlled Release)》，46:107-116(1996)。微灌注器特别可用于递送高浓度(例如，约100、125、150、175、200或更高mg/mL)或粘性溶液内所含的大剂量治疗性蛋白质。

实施例

以下非限制性实施例旨在说明空白微凝胶、药物微凝胶、含有药物微凝胶的制剂的合成，以及使用非水性乳液体系制备药物微凝胶的方法。表1包含以下实施例中使用的材料。在示例性的实施方案中，喷雾干燥的荧光标记的VEGF-Trap的固体组合物包括69.8％w/w VEGF-Trap、0.7％w/w Alexa 488标记的VEGF-Trap、13.1％w/w的在VEGF-Trap上的糖基化、2.1％w/w磷酸钠、14.1％w/w蔗糖和0.2％w/w聚山梨醇酯80。应当理解，喷雾干燥的粉末中赋形剂的浓度可以变化而不影响本发明的方法的有效性，并且本发明的方法可以用于包括任何蛋白质和赋形剂的任何组合的喷雾干燥的粉末。

表1.用于水凝胶微粒制造的材料

实施例1：使用非水性乳液体系合成空白交联的PEG微凝胶

如图1A所示，经由H/F本体乳液(一种非水性乳液体系)合成空白交联的PEG微凝胶可以通过在1.5mL的微管中混合比率为20μL:20μL:260μL的NHS:NH:PEG8k的储备溶液来进行，所述储备溶液包含在二氯甲烷(DCM)中的40kDa PEG-NHS 32％w/v、在DCM中的PEG-NH12％w/v和在DCM中的8kDa(非官能化的线性)PEG 35％w/v。然后可以将1.5mL微管的内容物快速转移到含有0.5％w/w的含氟表面活性剂Pico Surf^TM 1的6mL FC-40中。然后，FC-40溶液中的DCM可以通过涡旋或均质化来乳化。交联反应在单独的液滴中继续并完成，并且在去除DCM之后，乳液液滴最终硬化成PEG微凝胶。

在收集空白交联的PEG微凝胶时，可以形成大的聚合物聚集体并从乳液中沉淀出来。较小的液滴可以保持形状，而较大的液滴(约>10μm)在交联反应完成和微凝胶硬化之前倾向于絮凝和合并在一起。

为了防止微凝胶的絮凝和随后的聚集，可以使用更粘稠的连续相来代替上文描述的方案中的FC-40。根据斯托克斯定律(Stokes'law)，已知降低相分离速率的一种方法是增加连续相的粘度。因此，具有高得多的粘度24cP(与FC-40相比，具有4.1cP)的另一种商业上可获得的碳氟化合物Fluorinert^TM FC-70(全氟三戊胺)可以用于微凝胶制造。使用更粘稠的碳氟化合物实现更少的聚集和微凝胶的成功形成(数据未示出)。

实施例2.使用交联调节剂优化胶凝化速率

如实施例1中所述，可以通过将含有亲核基团的前体(PEG-NH)与含有亲电基团的前体(PEG-NHS)混合来实现交联。由于在混合时反应将立即开始，因此应该抑制反应速率，以允许为随后的乳化过程留出足够的时间。发明人发现15kDa PEG-NHS和40kDa PEG-NH在混合时的反应是浓度依赖性的。在高PEG浓度下，胶凝速度非常快，并且在混合之后不久，反应混合物可能不再能够被微粉化。稀释聚合物浓度降低了交联的速率。然而，它也降低了分散相的粘度，这可能导致形成更小的微凝胶，其在包封喷雾干燥的蛋白质(SDP)中效率更低。

因此，本发明的方法的示例性实施方案包含控制交联反应速率，同时保持分散相的粘度足够高以在乳化期间产生更大的液滴，从而生产更大的微凝胶并确保有效的蛋白质包封。在一些示例性的实施方案中，通过优化交联调节剂的量来实现期望的性质平衡。在一些示例性的实施方案中，交联调节剂是线性的非官能化的PEG，其可以被加入到反应混合物中以保持烃相粘度，同时降低官能化的PEG前体的浓度。

为了优化官能化的前体与纯非官能化的交联调节剂的比率，进行实验以评估胶凝速度，提供足够的数据点来推断我们的发现。首先，制备以下储备溶液：在DCM中的40kDaPEG-NHS 32％w/v、在DCM中的PEG-NH 12％w/v和在DCM中的8kDa(非官能化的线性)PEG35％w/v。然后通过涡旋将PEG-NH和8kDa PEG溶液在1.5mL Eppendorf微管中混合。最后，加入各种PEG-NHS溶液以制成300μL混合物。在涡旋以使混合物均质化并开始反应之后，持续倾斜微管以检查混合物是否停止流动，这将表明形成了凝胶。各种比率的PEG-NHS:PEG-NH:PEG 8kDa的胶凝时间在表2中示出。

如下表2中所示，降低官能化的可交联聚合物或聚合物前体的浓度并用交联调节剂(纯非官能化的线性PEG链)替换官能化的可交联聚合物或聚合物前体可以延长胶凝时间，以允许随后的乳化过程。

表2.改变PEG前体和非官能化PEG以优化胶凝时间

PEG-NHS:PEG-NH:PEG 8k(v:v:vμL)	近似的胶凝时间
		150:150:0	<1秒，混合后立即
100:100:100	<1秒，混合后立即
		50:50:200	在混合后5秒内
30:30:240	在约10-20秒内胶凝化
		20:20:260	在>300秒内逐渐胶凝化

实施例3.将喷雾干燥的蛋白质包封在交联的PEG微凝胶中

在一些示例性的实施方案中，可以实现将喷雾干燥的蛋白质包封在交联的PEG微凝胶中，如图3所示。通过首先制备在DCM中的20kDa PEG 35％w/v、在DCM中的HGEO-400GS(PEG-NHS)32％w/v和在DCM中的HGEO-150PA(PEG-NH)12％w/v的储备溶液来进行微凝胶的生产。然后将260μL的20kDa PEG和20μL的PEG-NH混合成溶液，然后在1.5mL微管中加入10mg微粉化的蛋白质粉末(例如VEGF-Trap SDP)，涡旋并超声处理10分钟以制成悬浮液。然后将20μL的PEG-NHS加入到悬浮液中，然后涡旋以均质化。然后将1.5mL微管的内容物加入到6mL含有0.5％w/w PS-1的FC-70中。然后通过涡旋或均质化将混合物乳化。将乳液置于真空下，并轻轻搅拌持续超过3小时，以完成交联反应并去除DCM。然后真空过滤微凝胶，并通过0.45μm PES膜洗涤。真空过滤可以用于在最终收集之前根据需要进一步干燥微凝胶。将产物在真空下进一步干燥持续延长的时间段以减少残留溶剂。

通过上述程序制造的微凝胶的粉末可以容易地悬浮和分散在含有表面活性剂如0.1％ PVA的PBS中，或悬浮在非水性液体媒介物如中链甘油三酯中。为了识别和可视化装载的蛋白质颗粒的位置，VEGF-Trap(例如阿柏西普)可以通过非特异性缀合用Alexa488TFP酯染料标记。然后可以将含有1％ Alexa 488标记的蛋白质的VEGF-Trap喷雾干燥成SDP，以便使用荧光显微镜可以看到SDP颗粒。

如上所述生产包封包括荧光标记的VEGF-Trap的SDP颗粒的交联PEG微凝胶，并悬浮在含有0.1％ PVA(一种用于防止聚集并促进在水溶液或FC-70中分散的表面活性剂)的PBS缓冲液中，并在显微镜下成像。

图4A和4B示出了重悬浮在FC-70中的载有SDP的微凝胶的明视场显微镜图像和荧光显微镜图像。(通过使用徕卡LAS X软件的图像分析)观察到尺寸从15μm至60μm的微凝胶的分布，其中平均尺寸为约26μm，同时还观察到细颗粒群(<5μm)。来自SDP的荧光信号与明视场通道中的颗粒图像很好地吻合，证实了SDP颗粒在微凝胶中的有效包封。如图5A和5B所示的较高倍放大图像显示，微凝胶接近球形，其中SDP颗粒(尺寸2-5μm)均匀地分布在微凝胶内部。微凝胶中的SDP颗粒保持其最初的葡萄干状形状，这表明根据本发明的方法的整个包封过程对SDP颗粒的完整性具有最小的影响。

图6A、6B和7示出了悬浮在PBS中的交联的PEG微凝胶的明视场显微镜图像和荧光显微镜图像。这些图像表明，尽管PEG是水溶性的，但交联的PEG微凝胶在水性缓冲液中保持其球形结构而不分解，表明PEG前体成功交联且微凝胶形成。来自SDP的荧光信号与微凝胶颗粒吻合，这表明尽管PEG基质可能被水性缓冲液的水溶胀，但蛋白质仍保留在微凝胶内。这些结果表明，所获得的包封VEGF-Trap的交联的PEG微凝胶具有潜在的持续释放应用所需的性质。

尽管在前述说明书中，已经针对本技术的某些实施方案对本技术的各个方面进行了描述，并且出于说明目的已经提出了许多细节，但对于本领域技术人员来说将显然的是，本文所公开的概念和原理可以延伸至另外的实施方案，并且本文所述的某些细节可以在不背离本公开的基本原理的情况下显著变化。

本文引用的所有参考文献，包括美国专利和申请，均通过引用以其整体并入。在不脱离本公开的精神或本质属性的情况下，本公开可以以其他特定形式体现，因此，应当参考所附的权利要求而不是前述说明书来指示本公开的范围。

Claims (28)

1.一种生产水凝胶微粒的方法，其包括：

(a)将至少一种可交联聚合物、至少一种交联调节剂和包含至少一种蛋白质的粉末与烃溶剂组合，以形成分散相悬浮液；

(b)将所述分散相悬浮液加入到连续相溶液中，其中所述溶液包含碳氟化合物液体和含氟表面活性剂，以形成组合的分散相悬浮液和连续相溶液；

(c)向所述组合的分散相悬浮液和连续相溶液施加混合力，以在所述碳氟化合物液体中形成具有多个烃液滴的非水性乳液，所述烃液滴包含所述至少一种可交联聚合物和进一步包含至少一种蛋白质的所述粉末；以及

(d)从所述非水性乳液中去除所述烃溶剂和所述碳氟化合物液体以形成分离的水凝胶微粒，其中所述水凝胶微粒包括包封在所述交联的聚合物的基质内的所述至少一种蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种交联调节剂是非官能化的线性PEG聚合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散相悬浮液中所述至少一种交联调节剂的浓度在约5.0％w/v和约35％w/v之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳氟化合物液体是高粘度碳氟化合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述连续相溶液包括全氟C5-C18化合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述连续相溶液包括FC-70或全氟三戊胺。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃及其组合组成的群组。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述连续相溶液包括全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种可交联聚合物包含选自由聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-共-聚环氧丙烷、共-聚环氧乙烷嵌段或无规共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氨基酸)、葡聚糖及其任何组合组成的群组的核。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种可交联聚合物包括包含至少一个亲核官能团的第一可交联聚合物以及包含至少一个亲电官能团的第二可交联聚合物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一个亲核官能团与所述至少一个亲电官能团的摩尔比在约1:1和约1:2之间。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种可交联聚合物包括PEG-NH第一前体和PEG-NHS第二前体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述PEG-NH第一前体或所述PEG-NHS第二前体是4臂化合物或8臂化合物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是抗体、其抗原结合片段、融合蛋白、重组蛋白质或其片段或截短形式。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是VEGF-Trap蛋白质。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述VEGF-Trap蛋白质是VEGF-Trap蛋白质的截短形式。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种蛋白质选自由阿柏西普(aflibercept)、利纳西普(rilonacept)、阿利库单抗(alirocumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、抗Ebola抗体和抗SARS-CoV-2抗体组成的群组。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离的水凝胶微粒具有在约1μm和约200μm之间的直径。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述粉末通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合进行微粉化。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合力包括均质化、涡旋、超声处理、空化、搅动或其组合。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶微粒是持续释放微粒。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散相悬浮液中所述粉末的浓度在约1.0％w/v和约30％w/v之间。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散相悬浮液中所述至少一种可交联聚合物的浓度在约5.0％w/v和约35％w/v之间。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述连续相溶液中所述含氟表面活性剂的浓度在约0.1％w/v和约5.0％w/v之间。

25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述分离的水凝胶微粒悬浮在药学上可接受的制剂中。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述制剂包括pH缓冲盐水、水溶液或非水性溶液。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述粉末进一步包括至少一种赋形剂。

28.一种通过根据权利要求1所述的方法制备的水凝胶颗粒。