CN116699137B - 一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法，涉及肿瘤标志物技术领域。本发明提供的用于非诊断目的的评估患有肿瘤风险的方法，包括如下步骤：以循环肿瘤‑免疫嵌合细胞为标志物，检测外周血样本中所述标志物；所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。本发明通过对检测样本中的目的标志物循环肿瘤‑免疫嵌合细胞进行分离鉴定计数，可以辅助医生对癌症疑似患者评估筛查，减少临床癌症漏诊或误诊的出现。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物技术领域，具体为一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法。
背景技术
肿瘤转移是肿瘤恶性化发展的重要环节，也是肿瘤治疗失败的主要原因，血行转移是肿瘤转移的重要方式。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)被认为是肿瘤散播的“种子”，以单个或集群的形式出现在外周血中。液体活检基于非侵入式微创，可动态监测等优势成为肿瘤检测诊断的重要手段，CTC检测作为液体活检的重要标记物，目前在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的诊疗中有广泛的研究。为了成功形成转移，CTC需要克服多种障碍，包括穿过组织-血液屏障，失巢凋亡，克服剪切应力，逃避免疫攻击等。因此，常规的CTC很难形成转移灶，临床研究也出现很多相互矛盾的观点，美国临床肿瘤学会(ASCO)专家小组也并不坚决推荐CTC作为监测全身治疗反应的有效生物标志物。临床亟需对肿瘤转移复发进展过程进行更加深入、***、客观的阐述，尤其是探索在转移过程中免疫***功能的异质性与肿瘤恶性转移的关联，发掘敏感、可靠、规范、微创的新型肿瘤转移进展、疗效评估和预后预测的生物标志物。
循环肿瘤-免疫嵌合细胞(CTC in cell，CIC)是在循环***或骨髓液等样本中发现的具有肿瘤和免疫细胞双重特性的一类细胞，表达肿瘤和免疫相关标志性蛋白，形态学表现为单个细胞核，双层细胞膜结构，在肿瘤发生发展过程具有重要意义。通过免疫荧光染色发现，CIC外层膜为免疫细胞外壳，CD45免疫标志蛋白表达阳性，内层包裹肿瘤细胞，表达肿瘤CK、EpCAM、BCL、SSEA3等标志蛋白，部分内层细胞发生上皮-间质转换(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)导致一些肿瘤Marker表达下降。为进一步阐释CIC形成的分子机制，通过免疫荧光、免疫组化等分子生物学方法，结合单细胞组学分析，初步阐明CIC的形成确实与大部分免疫细胞密切相关：如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞，髓源性抑制细胞MDSC，以及一些淋巴细胞，这些免疫细胞在特定情形下将细胞核向细胞外排出，而细胞膜保存完整形态，形成具有趋化和吞噬功能的无核白细胞，无核白细胞进一步吞噬、包裹肿瘤细胞，形成双层膜结构的循环肿瘤-免疫嵌合细胞。CIC的免疫细胞外层膜结构，使循环肿瘤-免疫嵌合细胞具备一定趋化功能，并且保护肿瘤细胞逃避免疫***的识别监视，同时克服循环***中的流体剪切力，有利于肿瘤细胞的存活和定植，导致远端转移的发生。目前，基于CIC作为新型肿瘤标志物尚未报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于循环肿瘤-免疫嵌合细胞为目标标志物，能够准确评估患有肿瘤或特定肿瘤，减少临床癌症漏诊或误诊的出现。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种评估患有肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，以循环肿瘤-免疫嵌合细胞为标志物，检测外周血样本中所述标志物，所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。
优选地，对于治疗中的个体，所述标志物不变或升高表明治疗效果差。
优选地，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35，表明患者体内发生潜在的复发转移。
优选地，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35表明患者危险系数大，预后不良。
优选地，检测外周血样本中所述标志物的方法为使用微流控细胞分选仪。
本发明提供了一种评估患有特定肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：按照上述方法检测外周血样本中所述标志物后，分别检测所述标志物中是否含有所述特定肿瘤的抗体，所述标志物出现特异性抗原表达，表明肿瘤恶性风险高。
优选地，对于治疗中的个体，所述标志物数目出现下降，说明治疗有效；所述标志物数目上升或长时间维持较高水平，则表明临床疗效不佳或出现肿瘤耐药。
优选地，对于治疗后的个体，所述标志物的数目超过阈值，则表明个体具有肿瘤复发转移风险或生存预后不良。
优选地，所述特定肿瘤包括神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、淋巴瘤、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肺癌、结直肠癌和乳腺癌中的一种。
优选地，所述抗体包括CD45、Bcl-xl、SSEA1、SSEA3、SSEA、GD2、PHOX2A、PHOX2B、AFP、CD56、CD99、GFAP、MyoD1、Nkx2.2、CK、EpCAM中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明选择病患的外周血或骨髓液作为检测样本，使用微流控细胞分选仪处理样本，获得循环肿瘤-免疫嵌合细胞，针对不同疑似肿瘤类型搭配对应的抗体组合，通过免疫荧光技术对捕获的细胞进行标记，进而通过荧光显微镜对捕获的细胞进行鉴定。非肿瘤样本中无法检测到CIC，而在肿瘤患者有效检出CIC。因此，术前通过对检测样本中的目的标志物CIC进行分离鉴定计数，可以辅助医生对癌症疑似患者评估筛查，减少临床癌症漏诊或误诊的出现。针对肿瘤疗效评估，获取临床治疗中的患者外周血样本，选择患者肿瘤对应的特异性抗体，通过检测CIC数目变化来评估治疗疗效，如果CIC数目出现下降，说明治疗有效，反之，如果在治疗过程中CIC数目上升或长时间维持相对较高水平，则临床疗效不佳或出现肿瘤耐药，考虑及时干预，调整用药方案，防止贻误治疗时机。针对肿瘤复发转移监测和肿瘤生存预后评估，随访病人患者外周血样本经过芯片分离铺板后，选择患者肿瘤对应的特异性抗体，检测标志物循环肿瘤-免疫嵌合细胞的数目，如果CIC数目超过阈值，则考虑患者具有肿瘤复发转移风险，生存预后不良，应该及时采取治疗措施进行干预，在疾病发生早期抑制病情恶化。
(2)由于肿瘤细胞的高度异质性，本发明根据针对不同的肿瘤类型，特异性的抗体组合来对循环肿瘤-免疫嵌合细胞进行标记，对肿瘤初筛通过多种抗体的组合避免误诊，同时也避免了因为个体化差异蛋白分子表达类型不同而导致的漏诊。相比于已经报道的通过基于单一抗体分子检测CTC诊断肿瘤的技术，多抗体联合诊断从理论上有效降低误诊率与漏诊率。
(3)相比于现有的影像学诊断及穿刺活检技术，影像学诊断无法发现微小残留病灶及早期转移，容易造成漏诊，而穿刺活检取样困难，对病人造成较大痛苦，特异性高但灵敏度相对较低，且容易造成潜在的炎症和肿瘤散播，无法动态监测肿瘤病人的发展变化。本发明通过微流控细胞分选平台，选择单一的外周血为检测样本，降低了医生的取样难度，同时减少待测者的痛苦与创口。以新型循环肿瘤-免疫嵌合细胞作为肿瘤早期筛查，肿瘤疗效评估，肿瘤复发转移监测，肿瘤生存预后评估的诊断标志物。检测样本以及目的检测物都容易获取，方便进行后期的各项研究诊断，稳定可靠易获取的诊断标志物CIC在肿瘤发生发展，侵袭转移过程中具有重要意义，对于临床检验意义重大，能为医生的临床决策提供更加动态及时的指示。
附图说明
图1为循环肿瘤-免疫嵌合细胞荧光显微观察结果图；
图2为不同肿瘤类型的循环肿瘤-免疫嵌合细胞荧光显微观察结果图；
图3为本发明评估患有特定肿瘤风险方法的流程图；
图4为本发明方法对76例临床确诊肺结节患者外周血样本的检测结果；
图5为76例肺结节患者外周血中CIC评估良恶性数据与临床实际结节良恶性数据统计的ROC曲线图及AUC大小；
图6为CIC预测早期肺癌的特异性和灵敏度统计图；
图7为本发明方法对278例临床肿瘤患者外周血样本检测结果；
图8为278例临床肿瘤患者的CIC数目与临床疗效评估结果的统计图；
图9为209例临床肿瘤患者外周血样本中CIC数目的检测结果；
图10为本发明方法对161例临床肿瘤患者外周血样本进行检测的结果与患者无进展生存期统计曲线图；
图11为本发明方法对161例临床肿瘤患者外周血样本进行检测的结果与患者总生存期统计曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种评估患有肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，以循环肿瘤-免疫嵌合细胞为标志物，检测外周血样本中所述标志物，所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。在本发明的具体实施例中，选择病患的外周血或骨髓液作为检测样本，使用微流控细胞分选仪处理样本，获得循环肿瘤-免疫嵌合细胞，针对不同疑似肿瘤类型搭配对应的抗体组合，通过免疫荧光技术对捕获的细胞进行标记，进而通过荧光显微镜对捕获的细胞进行鉴定。非肿瘤样本中无法检测到CIC，而在肿瘤患者有效检出CIC。因此，术前通过对检测样本中的目的标志物CIC进行分离鉴定计数，可以辅助医生对癌症疑似患者评估筛查，减少临床癌症漏诊或误诊的出现。
在本发明中，对于治疗中的个体，所述标志物不变或升高表明治疗效果差。在本发明中，基于CIC的肿瘤疗效评估，通过监测肿瘤治疗过程中外周血样本中CIC数目的动态变化，及时发现化疗耐药的产生，并考虑调整治疗方案，能够显著提高病患的治疗效果，达到缩小肿瘤原发病灶，降低肿瘤分期，消除肿瘤微转移，迅速改善肿瘤相关症状，提高手术切除率，减少术中播散与术后复发，最终保障和提升病人的术后生活质量。
在本发明中，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35，表明患者体内发生潜在的复发转移。在本发明中，所述标志物数目大于35指所述标志物数目超出阈值范围。当CIC≤35表明患者体内存在潜在复发转移风险较小，治疗效果好；CIC>35时表明患者体内发生潜在复发转移风险更大，治疗效果差。手术切除后，在肿瘤患者原位灶可能存在微小残余病灶，在肿瘤患者的其他组织中也可能存在休眠的肿瘤散播的种子。癌症患者在术后存在转移复发的风险，在一些应激条件或炎症感染的诱导下，这些休眠的种子可能被唤醒进而形成转移灶。因此，术后定期随访动态监控CIC数目的变化，有利于在肿瘤复发转移的早期及时发现及时介入干预，阻断肿瘤的发展进程。选择术后随访病患的外周血或骨髓液作为检测样本，通过对检测样本进行微流控细胞分选，对目的标志物CIC进行检测鉴定计数，可以辅助医生对患者肿瘤复发转移进行动态监测，进而综合提高患者的长期生存率。
在本发明中，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35表明患者危险系数大，预后不良。在本发明中，所述标志物数目大于35指所述标志物数目超出阈值范围。即当CIC≤35表明患者预后良好；CIC>35时表明患者危险系数大，预后不良。肿瘤患者预后，特别是恶性肿瘤预后判断仍是医学面临的巨大挑战，现阶段多数恶性肿瘤预后还无法完全达到个体化评估。基于CIC标志物，动态监测并定期回访患者，稳定评估患者预后状态，及时阻断肿瘤恶化进程；建立生存期预测模型，指导肿瘤临床治疗，保障和提升患者的无进展生存期和总生存期。
在本发明中，检测外周血样本中所述标志物的方法为使用微流控细胞分选仪。在本发明的具体实施例中，使用PBS溶液稀释新鲜的外周血样本，稀释比为1:1；将稀释后的样本，使用ZigZag的微流控CIC分选仪及配套分离微流控芯片，收集循环肿瘤-免疫嵌合细胞；收集所得细胞，4℃低温，1200rpm离心5min，弃上清；细胞平铺于96孔细胞培养板底，细胞粘附液多聚赖氨酸室温孵育5分钟，等待细胞贴壁后使用4％组织固定液固定细胞；针对不同肿瘤类型，加入荧光素标记的抗体CD45/Ab1/Ab2，4℃避光过夜孵育；DAPI染细胞核10min。荧光显微镜下观察循环肿瘤-免疫嵌合细胞(CIC形态似肿瘤细胞或其他细胞包裹在另一个细胞，肿瘤MarkerAb1/Ab2抗体一般为阳性，同时表达CD45)，根据铺板量定量计算患者外周血中的CIC浓度。根据免疫荧光观察到的目的标志物CIC是否存在以及数目评估待测者病情。在本发明中，所述微流控CIC分选仪及配套分离微流控芯片是基于专利CN 108753572A和CN 107723207A得以实现。
本发明提供了一种评估患有特定肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：按照上述方法检测外周血样本中所述标志物后，分别检测所述标志物中是否含有所述特定肿瘤的抗体，所述标志物出现特异性抗原表达，表明肿瘤恶性风险高。
在本发明中，对于治疗中的个体，所述标志物数目出现下降，说明治疗有效；所述标志物数目上升或长时间维持较高水平，则表明临床疗效不佳或出现肿瘤耐药。
在本发明中，对于治疗后的个体，所述标志物的数目超过阈值，则表明个体具有肿瘤复发转移风险或生存预后不良。
在本发明中，所述特定肿瘤包括神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、淋巴瘤、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肺癌、结直肠癌和乳腺癌中的一种。
在本发明中，所述抗体包括CD45、Bcl-xl、SSEA1、SSEA3、SSEA、GD2、PHOX2A、PHOX2B、AFP、CD56、CD99、GFAP、MyoD1、Nkx2.2、CK、EpCAM中的一种或几种。不同类型肿瘤对应的抗体组合，见表1。
表1不同类型肿瘤对应的抗体组合
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)采样：使用临床常规外周血采集方法，获取约3-5mL的外周血样本。
(2)标志物分离：
使用PBS溶液稀释新鲜的外周血样本，稀释比为1:1；将稀释后的样本，使用ZigZag的微流控CIC分选仪及配套分离微流控芯片，收集循环肿瘤-免疫嵌合细胞；收集所得细胞，4℃低温，1200rpm离心5min，弃上清；细胞平铺于96孔细胞培养板皿底，细胞粘附液室温孵育5分钟，等待细胞贴壁后使用4％组织固定液固定细胞；加入荧光素标记的抗体CD45/Ab1/Ab2，4℃避光过夜孵育；DAPI染细胞核10min。
(3)标志物检测：荧光显微镜下观察循环肿瘤-免疫嵌合细胞(CIC形态似肿瘤细胞或其他细胞包裹在另一个细胞，肿瘤MarkerAb1/Ab2抗体为阳性，同时表达CD45)，见图1和图2；根据铺板量定量计算患者外周血中的CIC浓度。根据图1可以看出，免疫细胞如中性粒细胞，单核细胞，吞噬细胞等通过快速囊泡出芽的方式，将细胞核向细胞外排出，而细胞膜保存完整生理活性，形成具有趋化和吞噬功能的无核白细胞，无核白细胞进一步吞噬肿瘤细胞，形成形态学表现为单个细胞核，双层细胞膜结构的循环肿瘤-免疫嵌合细胞。根据图2可以看出，各种肿瘤类型的循环肿瘤-免疫嵌合细胞，包括鼻咽癌，横纹肌肉瘤，尤文肉瘤，神经母细胞瘤，肺癌，乳腺癌，结直肠癌等癌症患者的外周血中均捕获到CIC，CIC外层膜为免疫细胞外壳，CD45免疫标志蛋白表达阳性，内层包裹肿瘤细胞，不同癌种表达特异性的肿瘤标志蛋白，通过多抗体组合可用于肿瘤相关检测和筛查。
(4)报告评估：根据免疫荧光观察到的目的标志物CIC是否存在以及数目评估待测者病情。1.在肿瘤早期筛查中，若出现循环肿瘤-免疫嵌合细胞，根据CIC特异性肿瘤蛋白的表达情况，对病人的是否罹患癌症进行确诊；2.对于肿瘤疗效评估，针对治疗中的患者，标志物不变或升高说明治疗效果差，需要针对病情及时调整治疗方案；3.对于肿瘤复发转移监测，随访病人的CIC标志物数目超出阈值范围，说明患者体内可能发生潜在的复发转移；4.对于肿瘤生存预后评估，标志物如果超出阈值范围说明患者危险系数大，预后不良。评估流程见图3。
实施例2
采用实施例1的方法对76例临床确诊肺结节患者外周血样本(3mL)进行检测，其中荧光素标记的抗体为CK/EpCAM,CD45，其余步骤与实施例1相同。
根据图4所示，其中32例患者结节为良性(benign)，均未检测到CIC；44例患者结节为恶性，恶性肿瘤患者外周血中检测到的CIC均值为3个/3mL。
根据图5所示，根据外周血中CIC评估肺结节良恶性具有较高预测价值。
根据图6所示，基于CIC预测肺癌的统计结果可以看出，诊断肺癌特异性高达100％，具备区分临床肺结节良恶性的优势。外周血中检出CIC一定为恶性，特异性达到100％，但部分恶性肿瘤患者早期中也检测不到CIC，灵敏度为50％。
实施例3
采用实施例1的方法对278例临床肿瘤患者外周血样本(5mL)进行检测，其中结直肠癌，胰腺癌，肺癌，头颈鳞癌，乳腺癌荧光素标记的抗体为CK/EpCAM,CD45；神经母细胞瘤荧光素标记的抗体为PHOX2B/GD2，CD45，其余步骤与实施例1相同。
根据图7和图8的结果显示，结直肠癌62例，胰腺癌1例，肺癌38例，头颈鳞癌28例，乳腺癌88例，神经母细胞瘤61例。对上述中单独的结直肠癌、肺癌、头颈鳞癌、乳腺癌、神经母细胞瘤的CIC数目与临床疗效评估结果的进行统计。统计结果显示，该类肿瘤患者外周血中CIC数目与临床疗效结果相关性显著，基于CIC可以有效的评估肿瘤患者的治疗效果。
实施例4
采用实施例1的方法对209例临床肿瘤患者外周血样本(5mL)进行检测，其中结直肠癌，胰腺癌，肺癌，头颈鳞癌，乳腺癌荧光素标记的抗体为CK/EpCAM，CD45；神经母细胞瘤荧光素标记的抗体为PHOX2B/GD2，CD45，其余步骤与实施例1相同。
根据图9的结果显示，其中对结直肠癌76例(非转移9例)，肺癌40例(非转移1例)，乳腺癌93例(非转移60例)。统计结果显示，CIC数目与肿瘤转移相关性显著，发生肿瘤转移的患者CIC数目与未发生转移的患者CIC数目有统计学差异(p<0.0001)，基于CIC可以有效提示临床肿瘤患者的转移复发。
实施例5
采用实施例1的方法对161例临床肿瘤患者外周血样本进行检测，其中结直肠癌，胰腺癌，肺癌，头颈鳞癌，乳腺癌荧光素标记的抗体为CK/EpCAM，CD45；神经母细胞瘤荧光素标记的抗体为PHOX2B/GD2，CD45，其余步骤与实施例1相同。
根据图10和图11结果显示，CIC＞35的患者进展风险系数是CIC≤35的患者近5倍，风险比(Hazard ratio，HR)为0.1953(95％置信区间)；CIC＞35的患者死亡风险系数是CIC≤35的患者近12倍，风险比HR为0.08564(95％置信区间)。根据生存预测模型所提供阈值，能够有效指导患者的生存预后，基于CIC数目的临床肿瘤患者预后评估意义重大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.微流控CIC分选仪和荧光素标记的抗体在制备评估患有肿瘤风险产品中的应用，其特征在于，
所述微流控CIC分选仪用于从外周血样本中收集循环肿瘤-免疫嵌合细胞，所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞形态学表现为单个细胞核、双层细胞膜结构，所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞外层膜为免疫细胞外壳，CD45免疫标志蛋白表达阳性，内层包裹肿瘤细胞；
所述荧光素标记的抗体用于对细胞进行孵育；所述抗体包括CD45抗体、Ab1抗体和Ab2抗体，所述Ab1抗体和Ab2抗体为肿瘤Marker抗体；
所述产品用于以所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞为标志物，检测外周血样本中所述标志物，所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对于治疗中的个体，所述标志物不变或升高表明治疗效果差。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35，表明患者体内发生潜在的复发转移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对于治疗后的个体，所述标志物数目大于35表明患者危险系数大，预后不良。
5.微流控CIC分选仪和荧光素标记的抗体在制备评估患有肿瘤风险产品中的应用，其特征在于，
所述微流控CIC分选仪用于从外周血样本中收集循环肿瘤-免疫嵌合细胞，所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞形态学表现为单个细胞核、双层细胞膜结构，所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞外层膜为免疫细胞外壳，CD45免疫标志蛋白表达阳性，内层包裹肿瘤细胞；
所述荧光素标记的抗体用于对细胞进行孵育；所述抗体包括CD45抗体、Ab1抗体和Ab2抗体，所述Ab1抗体和Ab2抗体为肿瘤Marker抗体；
所述产品用于以所述循环肿瘤-免疫嵌合细胞为标志物，所述标志物出现特异性抗原表达，表明肿瘤恶性风险高。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，对于治疗中的个体，所述标志物数目出现下降，说明治疗有效；所述标志物数目上升或长时间维持较高水平，则表明临床疗效不佳或出现肿瘤耐药。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，对于治疗后的个体，所述标志物的数目超过阈值，则表明个体具有肿瘤复发转移风险或生存预后不良。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、淋巴瘤、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肺癌、结直肠癌和乳腺癌中的一种。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Ab1抗体选自Bcl-xl、SSEA1、SSEA3、SSEA中的一种，所述Ab2抗体选自GD2、PHOX2A、PHOX2B、AFP、CD56、CD99、GFAP、MyoD1、Nkx2.2、CK、EpCAM中的一种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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