CN112881704A - Cit-h3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CIT‑H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用,本发明的提供了一种用于评估肝癌患者预后以及复发风险的免疫组化检测试剂盒,该试剂盒利用免疫组化原理,对“中性粒细胞胞外诱捕网”标志物CIT‑H3(瓜氨酸化组蛋白H3)进行检测,具有客观准确、简便、直观、易于操作等特点,由普通技术人员在医院病理室即可完成操作,无需借助复杂仪器;可以有效评估肝癌患者预后以及复发风险进行评估,从而更好地帮助医生对患者病情进行监控,并及时调整合适的治疗手段,帮助提高治疗效果和延长患者生存时间。
Description
技术领域
本发明涉及生命科学技术领域,具体地,涉及CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一,发病率与致死率分居我国恶性肿瘤的第五和第二位。目前肝癌最常用的治疗手段仍然是手术切除和肝脏移植。然而肝癌恶性程度高,且具有发展迅速、易转移等特点,导致了肝癌患者预后效果差,整体复发快,使得肝癌的总体五年生存率仍然处于较低水平。因此,通过寻找评价肝癌患者预后以及复发风险的相关标志物,能够为临床术后风险判断以及调整合适治疗手段提供重要的参考和帮助,也是实现肿瘤个体化精准治疗的关键步骤之一。
目前在肝癌诊疗过程中实际应用的肿瘤标志物有两类,一类是用于临床诊断的标志物,如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等。这些标志物除用于肝癌发生诊断外,也能在一定程度上对患者预后情况进行评估。然而,这些标志物对于患者预后以及复发评估敏感性低、相关性差,参考价值不大。而另一类是用于靶向药物筛选的标志物,如血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)等。这类标志物的表达与患者预后相关性好,但需通过基因检测等方式进行,检测成本较高,且具有一定技术门槛。
目前在肝癌临床诊疗过程尚无专门用于患者预后及复发评估的标志物检测方案,常用的诊断以及靶向药物筛选标志物检测分别存在敏感性低以及成本和技术门槛过高等缺点。因此,寻找高敏感、低成本、易检测的肝癌预后标志物以及检测方法势在必行,
影响肝癌预后以及复发的因素有很多,其中大量文献报道,中性粒细胞在促进肿瘤转移以及复发过程中起到了重要的作用。《Citrullinated histone H3,a biomarker ofneutrophil extracellular trap formation,predicts the risk of venousthromboembolism in cancer patients》公开了瓜氨酸化的组蛋白H3(H3Cit)-NET形成的一个生物学标志物,其在外周血中的含量可以用于预测可预测癌症患者静脉血栓栓塞的风险,并不能直接预测相关癌症的预后及复发情况。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足,提供CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用。肝癌中“中性粒细胞胞外诱捕网”特异性表达的CIT-H3蛋白的与患者预后及复发风险的相关性较高,通过监测其表达水平来预测患者预后和复发风险,优于传统的诊断性肿瘤标记AFP等分子对患者预后和复发风险的预测。
本发明的第一个目的是提供CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种肝癌预后和/或复发预测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:
发明人研究发现中性粒细胞可以通过产生“中性粒细胞胞外诱捕网”来促进肿瘤侵袭能力增强等方式共同促进肝癌的恶性进展。同时,中性粒细胞胞外诱捕网产生会特异性表达CIT-H3蛋白,肝癌肿瘤组织中“中性粒细胞胞外诱捕网”的产生情况(CIT-H3蛋白的量)和患者较差的预后以及较高的复发率呈显著正相关关系:肝癌肿瘤中“中性粒细胞胞外诱捕网”的产生情况(CIT-H3蛋白的量)与肝癌患者预后以及复发风险具有较强的相关性;肝癌肿瘤中“中性粒细胞胞外诱捕网”产生(CIT-H3蛋白的量)越多,患者预后水平越差,总体生存时间越短,反之亦然;肝癌肿瘤中“中性粒细胞胞外诱捕网”产生(CIT-H3蛋白的量)越多,患者术后复发风险越大,反之亦然。这显示“中性粒细胞胞外诱捕网”(CIT-H3蛋白的量)可以作为肝癌预后以及复发评估的标志物,为临床诊疗提供参考意义。
因此本发明要求保护CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用。
以及,CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂盒中的应用。
优选地,所述CIT-H3蛋白的检测试剂为CIT-H3抗体。
优选地,所述CIT-H3蛋白的检测试剂检测肝癌肿瘤区域的CIT-H3蛋白。
本发明还要求保护一种肝癌预后和/或复发预测试剂盒,含有CIT-H3蛋白的检测试剂。
优选地,所述CIT-H3蛋白的检测试剂为CIT-H3抗体。
优选地,还含有辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
更优选地,所述第二抗体为抗兔IgG。
优选地,所述肝癌预后和/或复发预测试剂盒为免疫组化试剂盒。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的提供了一种用于评估肝癌患者预后以及复发风险的免疫组化检测试剂盒,该试剂盒利用免疫组化原理,对“中性粒细胞胞外诱捕网”标志物CIT-H3(瓜氨酸化组蛋白H3)进行检测,具有客观准确、简便、直观、易于操作等特点,由普通技术人员在医院病理室即可完成操作,无需借助复杂仪器;可以有效评估肝癌患者预后以及复发风险进行评估,从而更好地帮助医生对患者病情进行监控,并及时调整合适的治疗手段,帮助提高治疗效果和延长患者生存时间。
附图说明
图1为中性粒细胞胞外诱捕网可促进肝癌细胞侵袭能力增强。
图2为CIT-H3在肝癌患者组织中的表达情况。
图3为CIT-H3表达与患者总体生存时间以及复发率的生存曲线分析。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1中性粒细胞产生“中性粒细胞胞外诱捕网”促进肝癌的恶性进展
一、实验方法
本实施案例首先从健康人外周血中分离得到中性粒细胞,通过加入肿瘤细胞培养上清进行体外培养,诱导并提纯了中性粒细胞胞外诱捕网。再利用Transwell小室实验,加入提纯的中性粒细胞胞外诱捕网,检测人肝癌细胞系HepG2细胞在Transwell小室中侵袭能力的变化,从而评估中性粒细胞胞外诱捕网对肿瘤细胞恶性进展的影响。
二、实验结果
结果如图1所示,相比于对照组,在加入“中性粒细胞胞外诱捕网”之后,人肝癌细胞侵袭至Transwell小室下表面的数量增多,且具有统计学显著差异,表明中性粒细胞胞外诱捕网能增强人肝癌细胞恶性进展的能力。
实施例2一种肝癌患者较差以及复发率预测试剂盒
本实施例选用CIT-H3抗原作为肿瘤组织中“中性粒细胞胞外诱捕网”产生的标记,并利用传统的免疫组化染色建立对其产生水平进行检测的试剂盒。
一、组成
第一抗体CIT-H3(购自Abcam公司,货号为ab5103)和带辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG第二抗体(购自Dako公司,货号为P044801-2)。
二、使用方法
1、标本检测
(1)选取包含肿瘤区域的肝癌石蜡切片,并确保无大片坏死;
(2)获取4μm的石蜡切片8片,在60℃烤片2小时,取出,略冷;
(3)室温下用二甲苯脱蜡2次,每次10分钟;
(4)在100%乙醇中洗去二甲苯,再依次经过95%酒精、80%酒精、70%酒精,每次5分钟;
(5)双蒸水中洗5分钟;
(6)用0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶活性,室温10分钟;
(7)双蒸水中洗4次,每次5分钟;
(8)抗原修复:10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0),微波热修复20min;
(9)室温自然冷却30分钟;
(10)PBS缓冲液中洗4次,每次3分钟;
(11)将第一抗体CIT-H3(购自Abcam公司,货号为ab5103)滴加在组织切片上,4℃孵育12小时;
(12)PBS缓冲液冼4次,每次5分钟;
(13)滴加带辣根过氧化物酶标记的第二抗体,37℃孵育30分钟;
(14)PBS洗4次,每次5分钟;
(15)双蒸水中洗3次,每次5分钟;
(16)滴加苏木素细胞核染料,染色3分钟;
(17)双蒸水中洗3次,每次5分钟;
(18)风干后,中性树脂封片剂封片。
2、图像分析
(1)在光学显微镜的高倍视野(200倍)下获取癌巢区域的图片5张;
(2)采用分析软件分别识别CIT-H3组化染色信号(如图2);
(3)分析CIT-H3染色信号数量及面积;
(4)最终结果为5个高倍视野的平均值。
3、结果判读
(1)将CIT-H3染色信号数量根据中位值分为高比例和低比例两种。当高倍视野(200倍,615μm×460μm)图片中,CIT-H3染色信号数量多于10个时,划分为高比例组(记为“CIT-H3高”);CIT-H3染色信号数量少于10个时,划分为低比例组(记为“CIT-H3低”)
(2)判断患者治疗效果:当患者为“CIT-H3高”时,认为患者预后较好、总体生存时间较长、复发风险较低;当患者为“CIT-H3低”时,认为患者预后较差、总体生存时间较短、复发风险较高。
实施例3“中性粒细胞胞外诱捕网”特异性表达的CIT-H3与患者较差预后以及复发率高相关
一、实验方法
本实施案例收集了80例肝癌患者手术切除肝癌样本切片及临床相关病理信息,利用实施2的试剂盒对这批患者肝癌组织中CIT-H3的表达进行了检测,统计分析后结合患者的预后生存数据进行了COX风险回归分析,以及结合复发情况等病理信息进行了卡方相关性检验分析。
二、实验结果
结果显示,利用CIT-H3表达高低来进行分组能够有效地对患者的总体生存以及复发时间进行预测且具有显著性差异。(总体生存P=0.023;复发率P=0.004,如表1)并且其风险预测的显著性高于传统的检测标记AFP(如表1)。同时,CIT-H3蛋白的表达高低还与患者的复发情况显著正相关(P=0.001,如表2)。
表1 COX单因素风险回归分析
表2 CIT-H3表达与肝癌患者复发情况相关性分析:
实施例4临床患者的检测
一、实验方法
使用实施例2的试剂盒检测了肝癌临床患者术后肝癌组织切片中CIT-H3蛋白的表达,利用图片分析软件对其进行统计及分组,并结合患者的总体生存时间以及复发时间进行了生存时间分析。
二、实验结果
结果显示,两组患者(CIT-H3高和CIT-H3低)在总体生存水平和复发率上有显著差异(总体生存P=0.012;复发率P=0.005,如图3),其中CIT-H3高组的患者总体生存时间约长,复发率越低。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂中的应用。
2.CIT-H3蛋白的检测试剂在制备肝癌预后和/或复发预测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1或2任一所述应用,其特征在于,所述CIT-H3蛋白的检测试剂为CIT-H3抗体。
4.根据权利要求1或2任一所述应用,其特征在于,所述CIT-H3蛋白的检测试剂检测肝癌肿瘤区域的CIT-H3蛋白。
5.一种肝癌预后和/或复发预测试剂盒,其特征在于,含有CIT-H3蛋白的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的肝癌预后和/或复发预测试剂盒,其特征在于,所述CIT-H3蛋白的检测试剂为CIT-H3抗体。
7.根据权利要求6所述的肝癌预后和/或复发预测试剂盒,其特征在于,还含有辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
8.根据权利要求7所述的肝癌预后和/或复发预测试剂盒,其特征在于,所述第二抗体为抗兔IgG。
9.根据权利要求5所述的肝癌预后和/或复发预测试剂盒,其特征在于,所述肝癌预后和/或复发预测试剂盒为免疫组化试剂盒。
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