CN116694683A - 靶向猪COL1A1基因下游序列的CRISPR-Cas9***及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向猪COL1A1基因下游序列的CRISPR‑Cas9***及其应用。该***包含特异性识别猪COL1A1基因3`侧翼区的gRNA以及用于将外源序列整合到该位点的供体载体。本发明提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因3`侧翼区如SEQ ID NO：1所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使该区域特定位置产生双链断裂，切割效率可达38.2％，通过同时转入本发明提供的Donor‑1、Donor‑2或者Donor‑3载体，可实现外源序列在该位置的定点整合。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种靶向猪COL1A1基因下游序列的CRISPR-Cas9***及其应用。
背景技术
转基因技术在基因功能研究、生物医学研究和农业领域中具有重要的价值，但传统转基因技术伴随着随机整合的问题，会造成很多不利的影响，如基因沉默等。研究人员一直在努力寻找可以解决这些问题的方法，其中一个解决方法是将外源基因序列定点整合到基因组中可以介导外源基因稳定、高效表达的转录活化区域即基因组安全位点。
猪作为重要的经济动物，不仅在农业畜牧业中具有重要地位，而且猪还是重要的医学模型动物。但是目前猪基因组中鉴定出的基因组安全位点数量还较少，难以满足猪育种以及医学用转基因猪模型的开发需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向猪COL1A1基因下游序列的CRISPR-Cas9***及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9***的猪COL1A1基因下游序列打靶载体，所述打靶载体为含有gRNA的pX330载体。
所述gRNA识别位点的DNA序列为：5′-ACGACCCTCCAGTTCGCCTAGGG-3′(SEQ ID NO：2)，位于猪COL1A1基因3`侧翼区。猪COL1A1基因在NCBI中的登录号为100738123。
gRNA为向导RNA，是CRISPR基因敲除敲入***中重要的组成部分，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。本发明提供的特异性识别猪COL1A1基因3`侧翼区的gRNA，其中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为5′-ACGACCCUCCAGUUCGCCUA-3′(SEQ IDNO：8)。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因3`侧翼区产生双链断裂，切割效率可达38.2％，进而实现对该位点进行编辑，如碱基替换，或者在该位点***外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。
第二方面，本发明提供一种供体载体I，包含顺次连接的猪COL1A1基因下游序列打靶区域左同源臂-外源基因表达框-猪COL1A1基因下游序列打靶区域右同源臂；或者，
包含顺次连接的猪COL1A1基因下游序列打靶区域左同源臂-绝缘子-外源基因表达框-绝缘子-猪COL1A1基因下游序列打靶区域右同源臂。
本发明中，所述外源基因表达框包含启动子、外源基因序列和终止子。
优选地，猪COL1A1基因下游序列打靶区域左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQID NO：6、7所示。
第三方面，本发明提供一种供体载体II，包含上述gRNA和外源基因表达框。
第四方面，本发明提供一种供体载体III，包含顺次连接的gRNA-外源基因表达框-gRNA。
前述的供体载体，骨架载体可以是pUC57。
第五方面，本发明提供一种靶向猪COL1A1基因3`侧翼区的CRISPR-Cas9***，包括所述打靶载体和所述供体载体(I、II或III)。
第六方面，本发明提供所述CRISPR-Cas9***在猪基因编辑中的应用。
第七方面，本发明提供一种靶向猪COL1A1基因3`侧翼区定点整合外源基因的方法，将所述打靶载体和所述供体载体(I、II或III)共同转染猪胚胎成纤维细胞，筛选获得阳性克隆。
转染猪胚胎成纤维细胞并筛选获得定点整合克隆后，通过体细胞克隆技术和胚胎移植技术，获得定点整合外源基因的猪。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的特异性识别猪COL1A1基因下游序列的gRNA能够识别猪COL1A1基因3`侧翼区如SEQ ID NO：1所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组12号染色体上COL1A1基因3`侧翼区特定位置并产生双链断裂，切割效率可达38.2％。同时配合本***中的Donor-1、Donor-2或者Donor-3载体，可将外源基因序列定点整合到该位点，实现外源基因序列在猪的多种组织中的稳定、高效表达。
附图说明
图1为本发明实施例1中gRNA效率检测PCR产物直接测序峰图。
图2为本发明实施例1中gRNA效率检测T7E1酶切图。
图3为本发明实施例2中利用gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor-1载体实现外源基因定点整合的示意图。
图4为本发明实施例2中对转染gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor-1载体后的PEF细胞进行流式分选，检测GFP阳性细胞的比例。
图5为本发明实施例2中对流式分选到的GFP阳性PEF细胞进行单克隆细胞鉴定的PCR引物位置示意图。
图6为本发明实施例2中对流式分选到的GFP阳性PEF细胞进行单克隆细胞鉴定的部分结果，M泳道代表DNA marker；1～22泳道代表单克隆PEF细胞；WT泳道代表野生型PEF细胞；水泳道代表未添加模版的阴性对照；a，GFP片段扩增，目的条带大小为135bp；b，左侧Junction PCR，条带大小为1240bp；c，右侧Junction PCR，条带大小为1290bp。
图7为本发明实施例3中Donor-2载体整合示意图，GOI代表外源基因表达框。
图8为本发明实施例3中Donor-3载体整合示意图，GOI代表外源基因表达框。
图9为本发明实施例3中Donor-2载体整合后的Junction PCR鉴定示意图，a代表正向整合，b代表反向整合。
图10为本发明实施例3中Donor-3载体整合后的Junction PCR鉴定示意图，a代表正向整合，b代表反向整合。
图11为本发明实施例2中Donor-1载体结构。
图12为本发明较佳实施例3中Donor-2载体结构。
图13为本发明较佳实施例3中Donor-3载体结构。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中实验的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)按照如下方法制备：将大白猪35～37日龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，6～8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。
实施例1特异性识别COL1A1基因3`侧翼区靶位点的Cas9/gRNA表达载体的构建以及gRNA活性检测
1、Cas9/gRNA表达载体的构建
首先选择猪COL1A1基因3`侧翼区靶位点的一段序列为靶序列，该靶序列如SEQ IDNO：1所示。
根据靶序列设计gRNA中负责识别靶片段区域的序列，根据本研究团队的经验对其序列进行评分，选择评分最高的三个负责识别靶片段区域的gRNA，并根据其5`端序列进行优化，分别命名为F-sg1、F-sg2和F-sg3，其中F-sg1序列如SEQ ID NO：3所示，F-sg2序列如SEQ ID NO：4所示，F-sg3序列如SEQ ID NO：5所示。
F-sg1：5′-ACGACCCTCCAGTTCGCCTA-3′(SEQ ID NO：3)；
F-sg2：5′-AGTTCTCTCCCTAGGCGAAC-3′(SEQ ID NO：4)；
F-sg3：5′-AGGCGAACTGGAGGGTCGTC-3′(SEQ ID NO：5)。
2、gRNA打靶载体的构建
根据上述三条gRNA序列，将其连接到BbsI酶切后的pX330载体中，得到pX330-gRNA载体。
3、将构建好的pX330-gRNA载体5μg电转染到PK15细胞中，转染48h后提取细胞DNA，使用以下的引物进行PCR反应，扩增猪COL1A1基因3`侧翼区打靶区域。PCR引物序列如下(扩增产物长度562bp)：
F-562：5′-CGATGCCACCAACTCTCTC-3′；
R-562：5′-CAGAGGGTGAGCGAAAAGG-3′。
4、PCR产物测序检测gRNA活性
将PCR扩增产物进行一代测序，检测在gRNA打靶位点处是否出现杂峰，出现杂峰表明该gRNA具有切割靶位点双链DNA的活性。结果如图1所示，F-sg1样本的打靶位点测序峰图出现明显杂峰，F-sg2和F-sg3均未出现杂峰。
5、T7E1酶切法检测gRNA活性
将PCR扩增产物变性退火后，加入T7E1酶及缓冲液进行酶切反应，将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过ImageJ软件计算切割效率。结果如图2所示，经过T7E1酶切后，gRNA-1的PCR产物出现被切割开的条带，说明F-sg1使打靶区域产生了序列突变，通过ImageJ软件计算条带亮度得出F-sg1的切割效率为38.2％左右。F-sg2和F-sg3未检测到发生突变。
从上述实验可以看出，F-sg1介导Cas9蛋白的敲除效果最好。
实施例2通过Donor-1实现外源基因的定点整合
Donor-1载体结构如图3所示，该载体pUC57为骨架，在多克隆位点依次***左同源臂序列(LA)、外源基因表达框(表达框一般包含启动子、编码序列和转录终止信号等元件。为了更好的实现特异性表达宿主启动子的干扰，也可以在外源基因表达框上下游加上绝缘子(insulator))和右同源臂序列(RA)。
猪COL1A1基因左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6、7所示。
转染前一天将原代猪胚胎成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70％～80％汇合度时即可进行细胞转染。细胞转染方法为基于核转仪的电转染，使用Basic PrimaryFibroblasts Nucleofector(Lonza)在Amaxa Nucleofector(Lonza)单孔核转染***下进行电转。
具体操作流程如下：
a.收集细胞，将细胞数量调整至1×106/管，200g离心5min，将培养液尽量去除干净。
b.加入100μL电转染试剂重悬细胞，并添加5μg Cas9/F-sg1表达载体质粒和5μg线性化后的Donor-1质粒(含有COL1A1基因3`侧翼区同源臂序列以及GFP表达框)，将电转染体系(包括细胞、转染试剂、质粒)沿壁缓慢加入电转杯中，避免产生气泡而降低转染效率。PEF细胞最佳的转染程序为U-023，在此预设程序下细胞的存活率和转染效率都比其他程序高。
c.转染完成后向电转杯中加入500μL完全培养基(20％FBS+DMEM)，轻柔吹打细胞，然后转移至预热的装有5mL培养液的6cm培养皿中于37℃，5％CO2培养箱中培养。电转染72h后，将空白对照组细胞(未进行转染)和实验组细胞吸除培养基，加入PB S冲洗两次，加入适量胰蛋白酶消化2min。将消化好的细胞移入15mL离心管1000g离心6min，去除原培养基，加入500μL新培养基重悬细胞。重悬好的细胞用细胞筛去除细胞团块后，收集到流式管中，准备上机分选。准备1.5mL离心管加入500μL培养基，用作收集分选后的阳性细胞。
用流式分选技术分选GFP阳性细胞操作步骤：
a、GFP选用488nm激光激发，将空白对照组细胞上机，确定阴性细胞的所在区域。
b、实验组细胞上机分选，首先通过SSC-A和FSC-A选取活细胞区域，之后通过FSC-W和FSC-H及SSC-W和SSC-H去除黏连细胞部分，通过PerCP和FITC-A进一步去除死细胞自发荧光部分，通过FSC-A和FITC-A选取阳性细胞区域，最后进行阳性细胞分选和收集(图4)。
c、将GFP阳性分选到96孔培养板，每孔最多分入1个细胞，5～6天后观察细胞状态和发光情况。标记形成单细胞克隆且GFP阳性的孔。对流式分选获得的细胞提取DNA进行PCR以及Junction PCR鉴定(图5和图6)。
首先使用引物GFP2F：5′-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3′和GFP2R：5′-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3′(扩增产物135bp)鉴定含有GFP表达框的单克隆细胞；然后分别使用跨左同源臂引物L3F：5′-GACTGACCGCTCTGTTCCTT-3′和L3R：5′-GATCCCGTGCCACCTTCC-3′(扩增产物1240bp)以及跨右同源臂引物R3F：5′-GTGTCTGCAGGCTCAAAGAG-3′和R3R：5′-AGCGTGTTGAATTTGCCAGT-3′(扩增产物1290bp)进行鉴定，共鉴定了404株单克隆细胞，GFP阳性克隆42株，Junction PCR阳性克隆10株，无富集定点整合的效率为2.5％，GFP富集后的定点整合效率为23.8％。
实施例3通过Donor-2或者Donor-3实现外源基因的定点整合
外源基因定点整合的流程示意图如图7(Donor-2)和图8(Donor-3)所示。
Donor-2载体结构如图7所示，该载体以pUC57为骨架，在外源基因表达框(GOI)的单侧***F-sg1序列。Donor-3载体结构如图8所示，该载体以pUC57为骨架，在外源基因表达框(GOI)的双侧***同向的F-sg1序列。
1、细胞转染
转染前一天将原代猪胚胎成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70％-80％汇合度时即可进行细胞转染。细胞转染方法为基于核转仪的电转染，使用Basic PrimaryFibroblasts Nucleofector(Lonza)在Amaxa Nucleofector(Lonza)单孔核转染***下进行电转。
具体操作流程如下：
a.收集细胞，将细胞数量调整至1×106/管，200g离心5min，将培养液尽量去除干净。
b.加入100μL电转染试剂重悬细胞，并添加5μgCas9/F-sg1表达载体质粒和5μg线性化后的Donor-2质粒或者Donor-3，将电转染体系(包括细胞、转染试剂、质粒)沿壁缓慢加入电转杯中，避免产生气泡而降低转染效率。PEF细胞最佳的转染程序为U-023，在此预设程序下细胞的存活率和转染效率都比其他程序高。
c.转染完成后向电转杯中加入500μL完全培养基(20％FBS+DMEM)，轻柔吹打细胞，然后转移至预热的装有5mL培养液的6cm培养皿中于37℃，5％CO2培养箱中培养。电转染72h后，将空白对照组细胞(未进行转染)和实验组细胞吸除培养基，加入PBS冲洗两次，加入适量胰蛋白酶消化2min。将消化好的细胞移入15mL离心管1000g离心6min，去除原培养基，加入500μL新培养基重悬细胞。重悬好的细胞用细胞筛去除细胞团块后，收集到流式管中，准备上机分选。准备1.5mL离心管加入500μL培养基，用作收集分选后的阳性细胞。
2、用流式分选技术分选GFP阳性
具体操作步骤：
a、GFP选用488nm激光激发，将空白对照组细胞上机，确定阴性细胞的所在区域。
b、实验组细胞上机分选，首先通过SSC-A和FSC-A选取活细胞区域，之后通过FSC-W和FSC-H及SSC-W和SSC-H去除黏连细胞部分，通过PerCP和FITC-A进一步去除死细胞自发荧光部分，通过FSC-A和FITC-A选取阳性细胞区域，最后进行阳性细胞分选和收集。
c、将GFP阳性分选到96孔培养板，每孔最多分入1个细胞，5～6天后观察细胞状态和发光情况。标记形成单细胞克隆且GFP阳性的孔。对流式分选获得的GFP阳性细胞提取DNA进行PCR以及junction PCR鉴定。
首先使用引物GFP2F：5′-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3′和GFP2R：5′-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3′(扩增产物135bp)鉴定含有GFP表达框的单克隆细胞；然后分别使用特异性引物打靶进行鉴定，引物位置见图9和图10，引物序列如下：
鉴定结果表明，在转染Donor-2组中，共筛选到382株PEF单克隆细胞，JunctionPCR阳性的克隆有19株，定点整合的效率为5.0％，所有定点整合克隆均为正向整合。在Donor-3组中，共筛选到429株克隆，Junction PCR阳性克隆18株，定点整合效率为4.2％。所有定点整合克隆均为正向整合。
本发明中，Donor-1结构如图11所示，Donor-1通过sgRNA、Cas9蛋白以及细胞的同源重组机制将外源基因表达框定点整合到猪12号染色体的目标位点，具有整合位置和整合方向精准的优点。
Donor-2结构如图12所示，Donor-2通过sgRNA、Cas9蛋白以及细胞的非同源末端连接机制将外源基因表达框定点整合到猪12号染色体的目标位点，具有不依赖于同源重组机制，能够在不***细胞中实现定点整合，且整合效率高于无筛选标记的同源重组机制。
Donor-3结构如图13所示，Donor-3同样通过sgRNA、Cas9蛋白以及细胞的非同源末端连接机制将外源基因表达框定点整合到猪12号染色体的目标位点，但不同于Donor-2，Donor-3有2个F-sg1位点，可以避免载体骨架整合到目标位点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.基于CRISPR-Cas9***的猪COL1A1基因下游序列打靶载体，其特征在于，所述打靶载体为含有gRNA的pX330载体；
所述gRNA识别位点的DNA序列为：5′-ACGACCCTCCAGTTCGCCTAGGG-3′，位于猪COL1A1基因3`侧翼区。
2.供体载体I，其特征在于，包含顺次连接的猪COL1A1基因下游序列打靶区域左同源臂-外源基因表达框-猪COL1A1基因下游序列打靶区域右同源臂；或者，
包含顺次连接的猪COL1A1基因下游序列打靶区域左同源臂-绝缘子-外源基因表达框-绝缘子-猪COL1A1基因下游序列打靶区域右同源臂；
其中，所述外源基因表达框包含启动子、外源基因序列和终止子。
3.根据权利要求2所述的供体载体，其特征在于，猪COL1A1基因下游序列打靶区域左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6、7所示。
4.供体载体II，其特征在于，包含gRNA和外源基因表达框；
其中，所述gRNA识别位点的DNA序列为：5′-ACGACCCTCCAGTTCGCCTAGGG-3′，位于猪COL1A1基因3`侧翼区；
所述外源基因表达框包含启动子、外源基因序列和终止子。
5.供体载体III，其特征在于，包含顺次连接的gRNA-外源基因表达框-gRNA；
其中，所述gRNA识别位点的DNA序列为：5′-ACGACCCTCCAGTTCGCCTAGGG-3′，位于猪COL1A1基因3`侧翼区；
所述外源基因表达框包含启动子、外源基因序列和终止子。
6.根据权利要求2-5任一项所述的供体载体，其特征在于，骨架载体为pUC57。
7.靶向猪COL1A1基因3`侧翼区的CRISPR-Cas9***，其特征在于，包括权利要求1所述打靶载体和权利要求2-6任一项所述供体载体。
8.权利要求7所述CRISPR-Cas9***在猪基因编辑中的应用。
9.靶向猪COL1A1基因3`侧翼区定点整合外源基因的方法，其特征在于，将权利要求1所述打靶载体和权利要求2-6任一项所述供体载体共同转染猪胚胎成纤维细胞，筛选获得阳性克隆。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，转染猪胚胎成纤维细胞并筛选获得定点整合克隆后，通过体细胞克隆技术和胚胎移植技术，获得定点整合外源基因的猪。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154003A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-15 | 温氏食品集团股份有限公司 | 提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合*** |
| CN111647604A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用 |
| CN111699256A (zh) * | 2017-11-28 | 2020-09-22 | 米瑞莫斯公司 | RNAi模型遗传介导工程的方法 |
| CN112852877A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-05-28 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 质粒载体及其在靶向猪col1a1位点定点整合外源基因中的应用 |
| CN114231533A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-03-25 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法 |
| WO2022082070A1 (en) * | 2020-10-15 | 2022-04-21 | Northeastern University | Engineered cells for increased collagen production |
| CN114525304A (zh) * | 2020-11-23 | 2022-05-24 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种基因编辑的方法 |
| TW202227625A (zh) * | 2020-08-28 | 2022-07-16 | 美商建南德克公司 | 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除 |
| WO2023004430A1 (en) * | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Mammoth Biosciences, Inc. | Vectors encoding gene editing systems and uses thereof |
| CN116064541A (zh) * | 2022-10-21 | 2023-05-05 | 华南农业大学 | 一种基于CRISPR/Cas9***敲除猪细胞Y染色体的方法 |
-
2023
- 2023-06-02 CN CN202310650994.0A patent/CN116694683B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111699256A (zh) * | 2017-11-28 | 2020-09-22 | 米瑞莫斯公司 | RNAi模型遗传介导工程的方法 |
| CN111154003A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-15 | 温氏食品集团股份有限公司 | 提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合*** |
| CN111647604A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用 |
| CN113278618A (zh) * | 2020-06-29 | 2021-08-20 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用 |
| TW202227625A (zh) * | 2020-08-28 | 2022-07-16 | 美商建南德克公司 | 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除 |
| WO2022082070A1 (en) * | 2020-10-15 | 2022-04-21 | Northeastern University | Engineered cells for increased collagen production |
| CN114525304A (zh) * | 2020-11-23 | 2022-05-24 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种基因编辑的方法 |
| CN112852877A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-05-28 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 质粒载体及其在靶向猪col1a1位点定点整合外源基因中的应用 |
| WO2023004430A1 (en) * | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Mammoth Biosciences, Inc. | Vectors encoding gene editing systems and uses thereof |
| CN114231533A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-03-25 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法 |
| CN116064541A (zh) * | 2022-10-21 | 2023-05-05 | 华南农业大学 | 一种基于CRISPR/Cas9***敲除猪细胞Y染色体的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KI-EUN PARK 等: "Targeted gene knock-in by CRISPR/ Cas ribonucleoproteins in porcine zygotes", 《NATURE》, 14 February 2017 (2017-02-14) * |
| XIANG MA 等: "Validation of reliable safe harbor locus for efficient porcine transgenesis", 《FUNCTIONAL & INTEGRATIVE GENOMICS》, 12 April 2022 (2022-04-12) * |
| 刘燕;任卫红;王绿娅;张晓萍;高诗娟;武威;李凤娟;杜杰;: "CRISPR/Cas9基因编辑***中两种gRNA活性检测方法比较", 心肺血管病杂志, no. 07, 26 July 2016 (2016-07-26) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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