CN111699256A - RNAi模型遗传介导工程的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于产生诱导性和条件性CRISPR/Cas9和RNAi的***和方法。从动物模型的产生和基于CRISPR的靶向的效率来看，本发明包括开发能实现诱导型和可逆性基因沉默的RNAi模型，从而模拟新的治疗方案。

Description

RNAi模型遗传介导工程的方法
背景
本发明涉及在分子生物学和基因工程领域中用于基因靶向基因组编辑和瞬时基因沉默的方法和***。更具体地，本发明描述了使用CRISPR相关核酸酶来特异性地有效地编辑与RNA干扰偶联的DNA序列以模仿药物治疗。
“RNA干扰”，“转录后基因沉默”，“抑制”——这些不同的名称都描述了类似的效应，这些效应是由于编码双链RNA前体的转基因过表达或将双链RNA故意导入细胞所致。
动物模型是解剖疾病机制的金标准；然而，开发动物模型的成本和较长的前置时间阻碍了它们在药物发现过程中的常规使用。CRISPR/Cas9基因组编辑的出现以及RNA干扰技术的重大进步，使人们能够在小鼠上对人类疾病进行基因工程设计和研究。除了研究疾病的发展，可诱导的功能丧失遗传工具还提供了强大且可扩展的***，可以在药物开发之前探测候选治疗靶标。尽管有小鼠模型可实用，但对于许多科学家而言，大鼠仍是首选的啮齿动物，因为它们的体积更大，可以进行外科手术、重复采血，并且其认知和生理特征比小鼠更像人类3。在神经生物学、心脏生物学、免疫学和毒理学方面，它们仍然是研究中主要的啮齿动物模型4-7。尽管操作和培养小鼠胚胎干细胞的技术使小鼠成为基因改造模型的标准，但是CRISPR/Cas9技术现在提供了一条操作大鼠基因组的途径。当前的方法能够衍生出永久性基因敲除等位基因，但不允许进行时态基因调节，而我们已经证明时态基因调节对于探索新药靶点的治疗功效和毒性很重要。RNAi大鼠模型将通过对体内潜在药物反应和耐药机制的体内评估，改变临床前验证过程，最终指导开发更安全的、更有效的药物。
制药公司经常要求在第一阶段之前仍在大鼠中进行其化合物的大多数毒理学研究。作为药物发现中的主要啮齿动物模型，大鼠将再次受到欢迎。RNAi大鼠比永久性基因敲除更好地模拟小分子抑制的动力学。
本发明试图解决基因靶向和基因组编辑方面的问题。
发明内容
本文描述了开发诱导性和条件性CRISPR/Cas9和RNAi的***和方法。从小鼠模型的创建和CRISPR靶向的效率来看，本发明包括开发RNAi大鼠模型，实现诱导性、可逆性基因沉默以模拟新的治疗方案。
本发明公开了一种建立创始人敲入鼠株的方法，通常包括：利用包含一个启动子、一段报告序列和一个miRNA主链的一段核苷酸序列制备创始人鼠株；使用创始人鼠株敲入一段可变的shRNA序列，以生成随后的品系。
部分方法和***在下面的描述中阐述，并且部分方法和***在描述中很浅显，或者可以通过实践方法和***而获知。这些方法和***的优点将通过附加声明中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅是示例性和说明性的，并且如声明中所述，描述不限于这些方法和***。
附图说明
在附图中，在本发明的几个优选实施方案中，相同的元素由相同的参考标号标识。
图1A是从用强力霉素dox处理3天的双转基因shMkk4/CAG-rtTA3中获取的组织中GFP表达的显微照片；图1B是分离的肝细胞中GFP和Mkk4表达的显微照片和蛋白质表达；而图1A是RNAi小鼠中的转基因等位基因的示意图。
图2A是使用CRISPR/Cas9制备RNAi模型的两步法示意图，先通过敲入供体盒制作创始人动物，然后在第二次靶向事件中，使用ssODN的CRISPR介导HDR促进***一段独特的shRNA序列；图2B是根据一个实施方案将要生成的创始人鼠株的示意图。
图3是本发明替代实施方案的图。
图4是shRNA整合到UTS中的评估图，其中将从TRE-GFP-UTS/CAG-rtTA3杂交中获得一个细胞胚胎。将进行CRISPR试剂+ssODN供体DNA的微量注射。胚胎培养4-5天直到胚泡阶段，并进行准备以进行DNA PCR扩增，然后用T7核酸内切酶I进行处理。阳性克隆将通过直接DNA测序进一步进行分析。
图5A-5B是显示5'ColA1#261-284的PCR结果的图；图5C-5D是显示5'ColA1#285-300的PCR结果的图。
图6A-6B是显示3'ColA1#261-284的PCR结果的图。图6C-6D是显示3'ColA1#258-300的PCR结果的图。
图7A-7B是显示5'ColA1#701-724的PCR结果的图。图7C-7D是显示5'ColA1#725-748的PCR结果的图。和图。图7E-7G是显示5'ColA1#749-773的PCR结果的图。
图8A-8F是显示3'ColA1#701-773的PCR结果的图。
具体实施方式
通过以下结合附图对示例性实施方案的详细描述，本发明前述的以及其他的特征和优点将显而易见。本详细描述和这些附图仅是对本发明的解释而不是限制，本发明的范围由附加声明及其同等条款限定。
本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落在该范围内的每个单独数值的速记方法，除非本文另有说明，每个单独数值都被并入本说明书中，就如同其被分别在本文中列举一样。当带有数值时，单词“约”应理解为表示所述数值的偏差最大至10％，包括10％。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(“例如”或“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不构成对本发明范围的限制。本说明书中的任何语言都不应解释为表示任何未声明的要素对于实施本发明必不可少。
术语“多核苷酸”，“核苷酸”，“核苷酸序列”，“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，从连锁分析中定义的基因座，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微小RNA(miRNA)，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针，和引物。多核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分结合。
在本发明方面，术语“嵌合RNA”，“嵌合引导RNA”，“引导RNA”，“单链引导RNA”和“合成引导RNA”可互换使用，并且是指包含引导序列，tracr序列和tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“引导序列”是指引导RNA内约20对碱基对序列，它指定靶位点，并且可以与术语“引导”或“间隔子”互换使用。术语“tracr配对序列”也可以与术语“正向重复序列”互换使用。示例性的CRISPR-Cas***如下所示。
如本文所用，术语“野生型”是本领域技术人员所能理解的术语，是指与突变体或变体形式不同的自然发生的生物、品系、基因或特征的典型形式。
如本文所用，术语“变体”应理解为表示具有与自然发生的形式不同的模式的特性表现。
术语“非自然发生”或“基因工程”可互换使用，表示人为介入。当涉及核酸分子或多肽时，这些术语是指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一种与其在自然界中自然相关的以及存在于自然界中的其他成分。
“互补”是指核酸与另一核酸序列形成传统的沃森-克里克或其他非传统类型的氢键的能力。互补百分比表示可以与第二个核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的核酸分子中的残基的百分比(例如10对中有5、6、7、8、9、10对互补配对，其百分比为50％，60％，70％，80％，90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二段核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键结合。如本文所用，“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域至少达到60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％、98％、99％或100％的互补程度，或指在严格条件下有两个核酸杂交。
如本文所用，进行杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补作用的核酸主要与靶序列杂交而基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常依赖于序列，并且因许多因素而有所不同。通常，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性例子在蒂森(1993)《生物化学和分子生物学中的实验室技术——与核酸探针的杂交》，第1部分，第二章，“杂交原理和核酸探针分析策略综述”(纽约州爱思唯尔)中有详细介绍。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸发生反应形成复合物的反应，此复合物通过核苷酸残基的碱基之间形成氢键而变得稳定。氢键可通过沃森-克里克碱基配对、霍格斯坦结合或以任何其他序列特异性方式形成。此复合物可能包括形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、一条自17杂交单链、或其任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如PCR的启动或酶对多核苷酸的裂解。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。
如本文所用，“表达”是指从DNA模板转录为多核苷酸的过程(例如转录成RNA和mRNA或其他RNA转录物)和/或经转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中的mRNA剪接。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链，它可以包含修饰过的氨基酸，并且可以被非氨基酸打断。这些术语还涵盖已被修饰过的氨基酸聚合物。例如，二硫键的形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他处理，例如与标记组分的结合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和右或左旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。
术语“受试者”，“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指脊椎动物，哺乳动物更好，最好是人。哺乳动物包括但不限于鼠类，猿猴，人类，农场动物，运动型动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物体的组织、细胞及其衍生物。
术语“治疗药物”，“有治疗作用的药物”或“治疗药剂”可互换使用，是指对受试者给药时能带来一些有益效果的分子或化合物。有益效果包括实现确诊；改善疾病、症状、障碍或病理状况；减少或预防疾病、症状、障碍或病症的发作；以及通常可以抵抗疾病、症状、障碍或病理状况。
如本文所用，“物种”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，最好是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠类，猿猴，人类，农场动物，运动型动物和宠物。
如本文所用，“治愈”或“治疗”或“缓解”或“改善”可互换使用。这些术语是指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗效益和/或预防效益。治疗效益是指经过治疗后对一种或多种疾病、病症或症状有任何与治疗有关的改善或作用。至于了预防效益，对有风险可能发展某一特定疾病、病症或症状的受试者，或对报告有某种疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使疾病、病症或症状可能尚未显现，也可能给药治疗。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望结果的某一药剂的量。治疗有效量可以根据以下一项或多项情况而有所不同：受试者和疾病病症正在进行治疗，受试者的体重和年龄，疾病病病症的严重程度，给药方式等，可以很容易地通过本领域其中一种普通技术进行确定。该术语还适用于提供影像的一种剂量，影像可通过本文所述的任何一种成像方法进行检测。具体剂量可以根据以下一项或多项而有所不同：所选的特定药剂，要进行的给药方案，是否与其他化合物联合给药，给药时间，要成像的组织以及运输药物的物理运送***。
“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。为了公开本发明，“同源重组(HR)”是指这种交换的特殊形式，例如在细胞修复双链断裂期间发生。此过程需要核苷酸序列为同源，使用“供体”分子对“靶标”分子(即经历双链断裂的分子)进行模板修复，因此被称为“非交叉基因转换”或“短道基因转换”，因为它引起遗传信息从供体转移到靶标。我们不希望受到任何特定理论的束缚，这种转移可能涉及在断裂的靶标和供体之间形成的异源双链DNA的错配校正和/或“合成依赖单链的退火”，其中供体用于重新合成遗传信息，并将成为靶标和/或相关流程的一部分。这种专门的同源重组通常会导致靶分子序列发生改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列并入到靶标多核苷酸中。
“切割”是指DNA分子的共价主链发生断裂。裂解可通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链裂解和双链裂解都可能发生，并且两个不同的单链发生裂解可能引发双链裂解。DNA切割可导致生成平末端或交错末端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA切割。
“切割域”包含一个或多个具有对DNA切割具有催化活性的多肽序列。切割域可以包含在单个多肽链中，或者切割活性可以由两个(或多个)多肽的缔合产生。
术语“调节元件”旨在包括启动子，增强子，内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，例如聚腺苷酸化信号和poly-U序列)。例如，在Goeddel《基因表达技术：酶学方法》185，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1990，中描述了这种调节元件。内部核糖体进入位点可以代替P2A。调控元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些元件和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些元件(例如组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可以主要在所需的目标组织中指导表达，例如肌肉，神经元，骨骼，皮肤，血液，特定器官(例如肝脏，胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以以时间依赖性方式指导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达，也可以是或不是组织特异性或细胞类型特异性。在一些实施方案中，载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5或多个pol III启动子)，一个或多个polII启动子(例如1、2、3、4、5或多个pol II启动子)，一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5或多个pol I启动子)或其组合。pol III启动子的例子包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的例子包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选择带有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(可选择带有CMV增强子)[请参见，例如，Boshart等，《细胞》，41:521-530(1985)]，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。术语“调节元件”还包括增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5'片段(《分子细胞生物学》，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；和兔β-珠蛋白外显子2和3之间的内含子序列(《美国国家科学院院报》，第78卷(3)，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择，期望的表达水平等因素。可以将载体引入宿主细胞，从而产生如本文所述由核酸编码的转录物、蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽(例如，成簇的规则散布的短回文重复序列(CRISPR)转录物，蛋白质，酶，它们的突变体形式，它们的融合蛋白等等。)。
可用于控制shRNA构建体体内表达的启动子/增强子包括但不限于Pol III人或鼠U6和H1***，巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子，人β肌动蛋白启动子，大鼠和小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)中存在的糖皮质激素诱导型启动子，莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV LTR)的长末端重复序列，SV40早期或晚期区域启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)的3'长末端重复序列中包含的启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子/增强子和单纯疱疹病毒LAT启动子。哺乳动物宿主细胞中载体的转录受到例如启动子的控制，这些启动子来源于病毒基因组(例如多瘤病毒，鸡痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛***瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))，来源于异源哺乳动物启动子(例如免疫球蛋白启动子)以及来源于热休克启动子，但前提是这些启动子与宿主细胞***相容。可以使用诱导***，例如Tet启动子。另外，重组酶***，例如Cre/lox可用于允许在期望的时间切除shRNA构建体。Cre可对外部信号(例如他莫昔芬)产生响应(转录或转录后)。
“基因表达的抑制”是指不存在来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物或可观察到其水平在降低。“特异性”是指抑制靶基因而不对细胞的其他基因产生明显影响的能力。确认抑制的结果的方法可以是通过检查细胞或生物体的外在特性(如以下示例中所示)或通过生物化学技术，例如RNA溶液杂交，核酸酶保护，诺瑟杂交，逆转录，基因表达微阵列监测，抗体结合，酶联免疫吸附测定(ELISA)，蛋白质免疫印迹，放射免疫测定(RIA)，其他免疫测定和荧光激活细胞分析(FACS)。对于在细胞系或整个生物体中的RNA介导的抑制，可通过使用其蛋白质产物易于测定的报道基因或药物抗性基因来方便地测定基因表达。这些报告子包括乙酰羟酸合酶(AHAS)，碱性磷酸酶(AP)，β半乳糖苷酶(LacZ)，β葡萄糖苷酸酶(GUS)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，绿色荧光蛋白(GFP)，辣根过氧化物酶(HRP)，萤光素酶(Luc))，胭脂碱合酶(NOS)，章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。可获得多种可选标记物，这些标记物对氨苄青霉素，博来霉素，氯霉素，庆大霉素，潮霉素，卡那霉素，林可霉素，甲氨蝶呤，膦丝菌素，嘌呤霉素和四环素赋予抗性。
除非另有说明，否则本发明的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，它们在本领域技术范围内。参见Sambrook，Fritsch和Maniatis的《分子克隆：实验室手册》，第二版(1989)；《当代分子生物学实验手册》(F.M.Ausubel等编辑，1987)；《酶学方法》系列(学术出版社公司)：《PCR 2：一种实用方法》(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑，1995)，《抗体,实验室手册》(Harlow和Lane编辑，1988)和《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑，1987)。
“重组酶介导的盒式交换”(RMCE)基于位点特异性重组过程(SSR)的特征，该过程允许通过靶向整合对高等真核基因组进行***的、重复的修饰。对于重组酶介导的盒式交换，是通过将预先存在的基因盒完全替换为带有“目的基因”(GOI)的类似盒而实现的。酵母的重组酶(“Flp”)可实现基因盒的交换(“翻转”步骤)。B部分显示了天然存在的48对碱基对FRT位点(F)的突变体(Fn)。如果基因盒的两侧是一组这些位点(例如F和Fn)，它可以通过双向重组而与交换质粒的一部分即第二个盒发生位置改变。C部分显示了模型实验，其中“空”细胞通过标准转染方法或重组酶介导的盒式交换进行修饰。请注意，在第一种情况下，有多个基因组位点被击中，每个位点引起了不同的表达水平(参见绿点的广泛分布)。如果使用预定的基因组地址引入相同的基因报告子，则源自此类事件的每个克隆均显示出可比的表达特征。
“重组酶”是遗传重组酶。DNA重组酶广泛用于多细胞生物中，以操纵基因组的结构并控制基因表达。这些酶源自细菌和真菌，可催化对每个重组酶特异的短(30-40个核苷酸)靶位点序列之间的方向敏感的DNA交换反应。这些反应实现了四个基本功能模块，即切除/***，倒位，易位和盒式交换，它们已单独或以广泛的配置组合用于控制基因表达。
“tet诱导***”是一种诱导性基因表达的方法，其中在存在抗生素四环素或四环素的一种衍生物(例如多西环素)的情况下可逆地开启或关闭转录。在自然界中，Ptet启动子表达阻遏物TetR和将四环素抗生素泵出细胞的蛋白质TetA。Tet-On和Tet-Off之间的区别不在于反式激活因子是打开还是关闭基因，正如其名称所示。相反，两种蛋白质都能激活表达。不同之处在于它们各自对强力霉素(Dox，一种更稳定的四环素类似物)的反应；Tet-Off在Dox不存在时激活表达，而Tet-On在Dox存在时激活表达。Tet-On Advanced反式激活因子(也称为rtTA2S-M2)是另一种Tet-On版，能显示基础表达降低，它在Dox浓度比Tet-Off低10倍时起作用。另外，由于Tet-On Advanced被人密码子优化过并利用3个最小的转录激活结构域，因此其表达在真核细胞中被认为更稳定。Tet-On 3G(也称为rtTA-V16[克隆科技实验室公司，Clontech Laboratories])类似于Tet-On Advanced，但源自rtTA2S-S2而不是rtTA2S-M2。它也经人密码子优化过，由3个最小的VP16激活域组成。但是，Tet-On 3G蛋白与Tet-On Advanced相比有5个氨基酸差异，这似乎进一步提高了其对Dox的敏感性。Tet-On3G对Dox的敏感度降低了100倍，并且其活性比原来的Tet-On大了7倍。其他***(例如生命科技公司(Life Technologies)研发的T-REx***)则以不同的方式起作用。目的基因的两侧是一个上游CMV启动子和两个TetO2位点。在没有四环素的情况下，TetR同型二聚体与每个TetO2序列的高亲和力结合可抑制目的基因的表达。四环素的引入导致在每个TetR同型二聚体上结合一个四环素，然后由TetR同型二聚体释放TetO2。TetR同型二聚体和TetO2解除结合会引起目的基因的抑制。
“外源DNA材料的转导”是遗传材料(例如DNA或siRNA)被病毒***细胞的过程。分子生物学中的常用技术是使用病毒载体(包括噬菌体)、电穿孔或增加细胞通透性的化学试剂。转染和转化也是将DNA***细胞的常见方法。
“胚泡注射”产生嵌合大鼠，即源于ES细胞和源于宿主胚泡的组织混合物。目标是获得一个高贡献率的ES细胞源性组织嵌合体，包括生殖系。可以制备用于注射的ES细胞。胚泡(来自129源性ES细胞的C57BL/6鼠株；来自C57BL/6源性ES细胞的白化株C57BL/6)可以注入基因修饰过的ES细胞，然后植入受体母鼠中。然后可将嵌合雄性用于实验。
根据本发明可以使用从其他来源(例如，商业来源或细胞库)分离或获得的多种细胞。这种细胞的非限制性实例包括体细胞，例如免疫细胞(T细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞)，血细胞(红细胞和白细胞)，内皮细胞，上皮细胞，神经元细胞(来自中枢或周围神经***)，肌肉细胞(包括骨骼肌、平滑肌或心肌的肌细胞和成肌细胞)，***细胞(包括成纤维细胞，脂肪细胞，软骨细胞，成软骨细胞，骨细胞和成骨细胞)和其他基质细胞(例如巨噬细胞，树突状细胞，胸腺滋养细胞，施旺细胞等)。根据本发明，也可以使用真核生殖细胞(***细胞和***)，产生上述体细胞和生殖细胞的祖细胞、前体和干细胞也可以使用。这些细胞、组织和器官可以是正常的，也可以是病理性的，例如涉及疾病或身体障碍的那些细胞、组织和器官，包括但不限于遗传或生化病理(例如，囊性纤维化，血友病，阿尔茨海默氏病，精神***症，肌营养不良，多发性硬化等)或致癌和其他与癌症相关的过程出现的免疫相关疾病，慢性炎症，自身免疫反应，传染性疾病(由细菌、真菌或酵母菌、病毒(包括HIV)或寄生虫引起)。本发明设想了大鼠多能细胞，包括胚胎细胞，精原干细胞，胚胎斯坦细胞和iPS细胞。还设想了大鼠体细胞。
诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法
PCT申请序列号PCT/US2016/051992中描述的诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法100(其全部内容通过引用并入本文)是特定基因编辑事件(通过CRISPR/Cas9，锌指，TALEN等)和RNA干扰的新颖组合，要按顺序使用和/或在相同的生物***(或生物体或动物模型)中组合使用。第一种方法是CRISPR/Cas9基因组编辑工具，它能在精确的基因组位置启动DNA切割，以通过以下两种机制中的其中一种诱导DNA修复：NHEJ(非同源末端连接)或HDR(同源性定向修复)。在NHEJ的情况下，这些基因编辑事件用于通过在所需基因组区域随机***或删除核苷酸(INDELS)来产生基因突变，这可能会使生物学***或动物模型易感于疾病发病机制或所需表型的表达。在HDR的情况下，还递送含有同源区域以及所需突变的供体模板以诱导同源重组事件并将供体模板并入基因组。供体模板可包含任何数量的转基因盒以改变基因组DNA，包括但不限于cDNA，点突变序列，报告子，miRNA等。Cas9介导的DNA切割通过在可诱导的启动子(例如TRE(tet响应元件)启动子)中表达Cas9而可在精确的时间进行诱导。通过向动物的***或食物或饮用水中添加强力霉素(一种四环素类似物)此配置将驱动Cas9的表达(Dow,L.E.,Fisher,J.,O'Rourke,K.P.,Muley,A.,Kastenhuber,E.R.,Livshits,G.,Tschaharganeh,D.F.,Socci,N.D.和Lowe,S.W.(2015)，《利用CRISPR-Cas9的诱导型体内基因组编辑》，自然生物技术33，390-394)。相反，tGFP-shRNA构建体处于相反的方向(如图1所示，在PCT申请序列号PCT/US2016/051992中所述)并且不与启动子整合在一起，因此在强力霉素处理后其表达最初不会被诱导。一旦发生了CRISPR/Cas9诱导的基因编辑过程，将要应用的第二种方法是重组***，例如CRE/Lox或FLP/FRT或DRE/Rox，从而在Cas9-CREERT2构建体的侧面围绕反向重复序列(如图1所示，在PCT申请序列号PCT/US2016/051992中所述)，并能够实现在加入他莫昔芬(或***类似物)后发生的精确重组(Siegel,R.W.,Jain,R.,and Bradbury,A.(2001)，《使用体内噬菌粒***鉴定不相容的loxP序列》，FEBSLett 499,147-153)。可以使用许多构型的反向重复序列或重组序列。取决于loxP序列的位置和方向，可以发生特定的重组事件(如图1-4所示，在PCT申请序列号PCT/US2016/051992中所述)(Matsuda，T.和Cepko，C.L.(2007)，《通过体内电穿孔引入的转基因的受控表达》，美国国家科学院院报104，1027-1032；Siegel,R.W.,Jain,R.和Bradbury,A.(2001)，《使用体内噬菌粒***鉴定不相容的loxP序列》，(FEBS Lett 499，147-153)。如图2所示，在PCT申请序列号PCT/US2016/051992中所述，CRE对loxP位点的重组将引起DNA构建体的切除和/或倒置，从而tGFP-shRNA构建体将以合适的5'至3'方向定向，从而实现第三个方法——诱导型RNA干扰——的功能。loxP和lox2272可以替代其他反向重复序列和重组***(即Flp/FRT，PhiC31/attP/B***/Dre/Rox)。根据所选的重组酶，他莫昔芬可以被其他***或激素分子替代。tGFP可以替代任何报告子或DNA序列以监测基因表达的抑制情况。最后，在发生倒置之后，用强力霉素处理将激活GFP标记的shRNA构建体的表达，该构建体将诱导特定目标基因的RNAi介导的基因沉默(Dickins,R.A.,McJunkin,K.,Hernando,E.,Premsrirut,P.K.,Krizhanovsky,V.,Burgess,D.J.,Kim,S.Y.,Cordon-Cardo,C.,Zender,L.,Hannon,G.J.等人(2007)，《转基因小鼠中的组织特异性和可逆RNA干扰》，自然遗传学39，914-921；Premsrirut,P.K.,Dow,L.E.,Kim,S.Y.,Camiolo,M.,Malone,C.D.,Miething,C.,Scuoppo,C.,Zuber,J.,Dickins,R.A.,Kogan,S.C.等人(2011)，《一种利用条件性RNA干扰研究小鼠基因功能的快速且可扩展的***》，细胞145，145-158。)。
诱导型CRISPR/Cas9和RNAi 100方法能使单个DNA构建体递送到生物***中，从而促进CRISPR/Cas9介导的基因编辑和RNAi干扰介导的基因沉默的有效组合。这样的***将例如能够在生物***或动物模型中诱导特定疾病或表型，然后进行RNAi介导的基因沉默，从而可以有效地复制治疗干预。这种多合一设计的简单性使得能够快速生成疾病的动物模型，因此仅需要两个等位基因即可激活***：(1)多合一FLEx***(如图1PCT申请序列号PCT/US2016/051992所述)和(2)tet反式激活剂(Tet-off；tTA或Tet-on；rtTA)。
诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法的独特之处在于，它能使诱导型CRISPR/Cas9和诱导型RNAi都可以在相同的***中使用，并且具有相同的TRE启动子表达。可以想象，通过组合两个独特的诱导型表达***，例如SparQTM cumate开关(***生物科学公司，SystemBiosciences，Inc.)或RheoSwitch诱导型表达***(新英格兰生物实验室，New EnglandBioLabs)，可以实现诱导型CRISPR/Cas9和诱导型RNAi的组合。然而，这些***尚未在动物模型体内进行全面测试，不像Tet诱导型***那样常规使用(Abe,T.和Branzei,D.(2014)，《Tet-On 3G***诱导的高水平BRC4抑制DNA修复并损害脊椎动物细胞的细胞增殖》，DNA修复(阿姆斯特丹)22,153-164；Gossen和Bujard,1992；Loew,R.,Heinz,N.,Hampf,M.,Bujard,H.和Gossen,M.(2010)，《具有最小背景表达的改良的Tet响应启动子》，BMC生物技术10,81)，并且其体内表达模式的特征尚待确定。此外，尚不清楚两个独立的诱导型表达***是否可以组合成多合一表达载体，因为启动子干扰可能会阻碍这种可能性。因此，诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法使用要按顺序而不是同时诱导的Cas9和shRNA表达。这样做的目的是使突变开始发生并在疾病发病机理或表型表现之前保留对shRNA表达的诱导。
诱导型CRISPR/Cas9和RNAi***还可包括靶向针对Cas9(shCas9)的新型shRNA，以防止TRE启动子高水平表达Cas9(图1)。已经显示出高水平和/或连续水平的Cas9可能对细胞有害，因此为了限制其表达，诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法可能在Cas9表达盒的3'UTR上包括shRNA。除了控制来自TRE启动子的大量过表达外，shCas9还可以控制在强力霉素不存在的情况下(对Tet-on***)来自TRE启动子本身的任何渗漏表达(McJunkin,K.,Mazurek,A.,Premsrirut,P.K.,Zuber,J.,Dow,L.E.,Simon,J.,Stillman,B.和Lowe,S.W.(2011)，《使用转基因RNA干扰可逆性抑制成年小鼠的一个重要基因》，美国国家科学院院报108,7113-7118)。在许多情况下，原始TRE启动子已被证明存在泄漏，在没有强力霉素的情况下确实会出现最小量表达，因此已经开发了多个新一代的启动子(TREtight和TRE3G)(Abe和Branzei，2014；Loew等人，2010)。不幸的是，尽管这些启动子起到控制泄漏的作用，但在某些情况下调节可能过于严格，以致在动物模型的特定组织中表达受到限制(McJunkin等人，2011)。但是，可以用包括新一代TREtight和TRE3G启动子在内的任何启动子替代TRE。
诱导型CRISPR/Cas9和RNAi***也是独特的，因为它具有很高的适应性。可以使用多种版本，但是***并不仅限于所描述的版本。例如，许多U6-gRNA盒可以在TRE启动子的上游表达。可以串联克隆U6-RNA，例如U6-gRNA-gRNA—U6-gRNA-gRNA—U6-gRNA-gRNA。如前所述，U6可以被其他pol III启动子或调节元件取代。gRNA可以针对多个基因(Dow,L.E.,Fisher,J.,O'Rourke,K.P.,Muley,A.,Kastenhuber,E.R.,Livshits,G.,Tschaharganeh,D.F.,Socci,N.D.和Lowe,S.W.(2015)，《用CRISPR-Cas9诱导体内基因组编辑》，自然生物技术33,390-394)。可以用TREtight(克隆技术实验室，加利福尼亚州山景城)或TRE3G(克隆技术实验室，加利福尼亚州山景城)启动子替换TRE启动子(如图5-6所示，PCT申请序列号PCT/US2016/051992所述)，或最终用经过测试和表型的另一种诱导型启动子替换。TRE启动子可以用组织特异性或普遍存在的启动子或调节元件代替。shCas9可能存在也可能不存在，这取决于启动子以及是否存在大量过表达和/或渗漏。在某些情况下，CRE或CREERT2可以异位递送，例如以包含CRE的腺病毒或慢病毒的形式。在正常细胞中，CreERT2属于细胞质，无活性，但是他莫昔芬的添加激活了融合蛋白的重组酶活性。
四环素(tet)调控的***控制来自四环素反应性启动子(TRE)的RNAi构建体的表达(Dickins,R.A.,Hemann,M.T.,Zilfou,J.T.,Simpson,D.R.,Ibarra,I.,Hannon,G.J.和Lowe,S.W.，《使用稳定且受调节的合成microRNA前体探测肿瘤表型》，自然遗传学37(2005)1289-95)。简而言之，基于tet的***需要tet反式激活蛋白(tTA或rtTA)的额外表达(Furth,P.A.,St.Onge,L.,Boger,H.,Gruss,P.,Gossen,M.,Kistner,A.,Bujard,H.和Hennighausen,L.，《通过四环素响应性启动子对转基因小鼠中基因表达的时间控制》，美国国家科学院院报27(1994)9302-9306)。在存在tTA(tet-off)的情况下，TRE驱动的表达是有活性的，但是一旦施用了强力霉素(四环素衍生物)，它就会关闭。rtTA(tet-on)则相反，其中转录仅在强力霉素存在的情况下才有活性。在小鼠中，可以使用组织特异性启动子来限制tTA或rtTA的表达，从而有可能将敲除仅限于特定组织。
可以修改的其他特征是重组***。CRE/loxP和Flp/FRT***均已进行了详尽的描述并在体外和体内进行了测试(Boniface，EJ，Lu，J.，Victoroff，T.，Zhu，M.和Chen，W.(2009)，《基于FlEx的转基因报告子系用于在活斑马鱼中可视化展现Cre和Flp活性》，Genesis 47，484-491；Branda，C.S.和Dymecki，S.M.(2004)，《谈论一场革命：位点特异性重组酶对小鼠遗传分析的影响》，发育细胞6,7-28)，可以互相替代。在不久的将来可能会发现其他有效的重组***(KD，R，B2，B3或DRE重组酶)，并且可以代替CRE/loxP使用(Nern,A.,Pfeiffer,B.D.,Svoboda,K.和Rubin,G.M.(2011)，《用于操纵动物基因组的多种新的位点特异性重组酶》，美国国家科学院院报108,14198-14203)。IRES序列也可以与P2A互换(Kim,J.H.,Lee,S.R.,Li,L.H.,Park,H.J.,Park,J.H.,Lee,K.Y.,Kim,M.K.,Shin,B.A.和Choi,S.Y.(2011)，《猪捷申病毒1衍生的2A肽对人、斑马鱼和小鼠的高切割效率》，PLoS One 6,e18556)，或可以与任何其他核糖体进入序列互换。所描述的turboGFP(tGFP)可以替代任何其他报告子，例如抗生素抗性盒，荧光报告子，或甚至另一种cDNA。实际上，它可以被随机DNA序列取代，只要它在启动子和shRNA之间提供一个间隔子元件来诱导提高的RNAi效率(Premsrirut等人，2011)。
CRISPR/Cas9介导的RNAi模型工程
本发明结合了CRISPR/Cas9基因组工程、识别的缺陷、开发的新的方法和标准化的方案以促进几乎任何所需模型的创建。本发明开发了用于创建CRISPR/Cas9-RNAi大鼠的转化平台技术，其中CRISPR迅速诱导人肿瘤中发现的复杂突变模式，并且RNAi评估同一动物中的新靶标。可以转化RNAi大鼠管道，并使用仅包含独特shRNA序列的Cas9介导小供体模板的***(图2A)。这样，就可以替代传统的ESC靶向平台，并直接注射到胚胎中，从而大大减少了生产的时间和成本。本发明包括用于RNAi大鼠生产的CRISPR/Cas9方法，并且可逆基因沉默技术被应用于大鼠***。这样，将改变在以老鼠为首选啮齿动物模型的领域中的研究。更好地模拟临床疾病并评估更相关的模型生物中的遗传和环境刺激的能力将提高动物模型预测人类药物反应的可靠性，并推动药物发现研究超出其当前的局限性。
1.CRISPR
协同使用CRISPR/Cas9和RNAi工具箱进行模型创建
本发明可能采用新的CRISPR/Cas9工具，包括CRISPR干扰(CRISPRi)32，33，CRISPR激活因子(CRISPRa)34和其他Cas9融合，以实现对染色质35的调节。本发明通过建立和优化的RNAi工具、利用每个***的优势以及并行应用它们，使新兴的CRISPR技术协同增效以创建新的功能强大的CRISPR-RNAi小鼠模型用于基因靶标评估。本发明已经产生了使用CRISPR/Cas9介导基因编辑的100多种新模型，其中在几种情况下涉及复杂等位基因的工程设计，例如大片段***(>10kb)，在不同基因组位点引入多个报道基因或loxP位点，直接构建特定点突变和可调控的shRNA盒。本发明包括除小鼠外、在其他物种上进行的模型创建，包括但不限于大鼠。本发明包括CRISPR/Cas9基因工程，分子生物学，RNAi技术，胚胎操纵和动物模型创建。将建立创建大鼠模型的要求，并建立用于快速创建RNAi大鼠模型的管道。本发明包括验证shRNA和选择靶向针对大鼠基因的有效shRNA，可以容易地***设计用于******的预工程大鼠胚胎中，与小鼠模型***类似(图2A)。本发明将定义新的范例，从而不仅加速用于药物发现研究的新型大鼠模型的创建，而且为在更广泛的疾病背景下研究基因功能开辟一条新途径。
最近，基于成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸酶***，已经在微生物和哺乳动物***中开发了新的基因靶向工具。CRISPR相关核酸酶是细菌和古细菌适应性免疫的一部分。Cas9内切核酸酶是化脓性链球菌II型CRISPR/Cas***的组成部分，与被称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(transcrRNA))的两个短RNA分子形成复合物，它们指导核酸酶在两条链上的特定位点上切割非自身DNA。crRNA-transcrRNA异源双链体可以被一个嵌合RNA(即向导RNA(gRNA))取代，然后可以将其编程为靶向的特定位点。对gRNA-Cas9进行编程的最小限制是工程化设计的5'-RNA与靶向DNA之间至少有15个碱基配对而不发生错配，并且NGG基序(即原型间隔区相邻基序或PAM)紧随该靶向DNA序列中的碱基配对区域。通常，使用gRNA区域5'端的15-22nt来指导Cas9核酸酶在特定位点生成DSB。CRISPR/Cas***已被证明可用于人类、小鼠、斑马鱼，酵母和细菌的基因组编辑。
所述方法可能包括基因编辑和表达编码一种或多种基因产物的DNA分子，一种工程化、非天然存在的载体***，包含一种或多种载体，所述载体包括：a)与一个或多个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)的***引导RNA有效连接的第一个调节元件，***引导RNA与编码一种或多种基因产物的DNA分子基因组位点中的靶序列杂交，b)与II型Cas9蛋白有效连接的第二个调控元件，其中组件(a)和(b)位于***的相同或不同载体上，其中引导RNA靶向针对编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组位点，而Cas9蛋白裂解编码一种或多种基因产物的DNA分子的此基因组位点，从而改变一种或多种基因产物的表达；并且，其中Cas9蛋白质和引导RNA非自然一起存在。
CRISPR/Cas样序列可以自I型，II型或III型CRISPR/Cas***衍生。合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性例子包括Cas3,Cas4,Cas5,Cas5e(或CasD),Cas6,Cas6e,Cas6f,Cas7,Cas8a1,Cas8a2,Cas8b,Cas8c,Cas9,Cas10,Cas10d,CasF,CasG,CasH,Csy1,Csy2,Csy3,Cse1(或CasA),Cse2(或CasB),Cse3(或CasE),Cse4(或CasC),Csc1,Csc2,Csa5,Csn2,Csm2,Csm3,Csm4,Csm5,Csm6,Cmr1,Cmr3,Cmr4,Cmr5,Cmr6,Csb1,Csb2,Csb3,Csx17,Csx14,Csx10,Csx16,CsaX,Csx3,Csz1,Csx15,Csf1,Csf2,Csf3,Csf4和Cu1966。
在一个实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白从II型CRISPR/Cas***中衍生。在示例性实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白从Cas9蛋白中衍生。该Cas9蛋白可以来自从化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属的种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝丝菌属的种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊蓝细菌(Microcystisaeruginosa)、聚球蓝细菌属的种(Synechococcus sp.)、***糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobiusthermophilus)、喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属的种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonashaloplanktis、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、Methanohalobiumevestigatum、多变鱼腥蓝细菌(Anabaena variabilis)、产泡沫节球蓝细菌(Nodulariaspumigena)、念珠蓝细菌属的种(Nostoc sp.)、最大节螺蓝细菌(Arthrospira maxima)、盘状节螺蓝细菌(Arthrospira platensis)、节螺蓝细菌属的种(Arthrospira sp.)、鞘丝蓝细菌属的种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤蓝细菌属的种(Oscillatoria sp.)、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或深海单细胞蓝藻(Acaryochloris marina)。
通常，CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合域。RNA识别和/或RNA结合域与引导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域(即DNase或RNase结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNAse结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。
CRISPR/Cas样蛋白可以是一个野生型CRISPR/Cas蛋白，一个修饰过的CRISPR/Cas蛋白或一个野生型或修饰过的CRISPR/Cas蛋白的片段。可以修饰CRISPR/Cas蛋白以增加核酸结合亲和力和/或特异性、改变酶活性、和/或改变蛋白的另一性质。例如，可以修饰、删除或灭活CRISPR/Cas蛋白的核酸酶(即DNase，RNase)结构域。或者，可以截短CRISPR/Cas蛋白以去除对融合蛋白的功能不重要的结构域。也可以截短或修饰CRISPR/Cas蛋白以优化融合蛋白的效应子结构域的活性。
在一些实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以自野生型Cas9蛋白或其片段衍生。在其他实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以自修饰过的Cas9蛋白衍生。例如，可以修饰Cas9蛋白的氨基酸序列以改变该蛋白的一种或多种特性(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。或者，可以从蛋白中消除不参与RNA引导的切割的Cas9蛋白的结构域，使得修饰过的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。
通常，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即DNase)结构域。例如，Cas9蛋白可包含一个RuvC样核酸酶结构域和一个HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域共同作用以切割单链，从而在DNA中产生双链断裂。(Jinek等人，科学，337：816-821)。在一些实施方案中，可以修饰Cas9衍生的蛋白质以仅包含一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，可以修饰Cas9衍生的蛋白，使得其中一个核酸酶结构域被删除或发生突变，从而使其不再起作用(即，不存在核酸酶活性)。在其中一个核酸酶结构域失活的一些实施方案中，Cas9衍生的蛋白质能够将切口引入双链核酸(这种蛋白质被称为“核酸内切酶”)，但是不切割双链DNA。例如，在RuvC样结构域中天冬氨酸转化为丙氨酸(D10A)会将Cas9衍生的蛋白转化为内切酶。同样，以HNH结构域中组氨酸转化为丙氨酸(H840A)会将Cas9衍生的蛋白转化为切口酶。
在其他实施方案中，可以修饰或消除RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域，使得Cas9衍生的蛋白不能切除或切割双链核酸。在其他实施方案中，可以修饰或消除Cas9衍生蛋白的所有核酸酶结构域，使得Cas9衍生蛋白缺乏所有核酸酶活性。
在任何上述实施方案中，使用众所周知的方法(例如定点诱变，PCR介导的诱变和总基因合成以及本领域已知的其他方法)，通过一个或多个缺失突变、***突变和/或取代突变可以使任何或所有核酸酶结构域失活。在一个示例性实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白自Cas9蛋白衍生，其中所有核酸酶结构域均进行了失活或缺失处理。
题为“用于改变基因产物表达的CRISPR-CAS***和方法”的美国专利第8,697,359号中描述了用于制备和使用CRISPR-Cas***的组合物和方法，其内容全部包含于本文中。
近年来，已开发出序列特异性核酸酶以提高动植物***中基因靶向或基因组编辑的效率。其中，锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)是两种最常用的序列特异性嵌合蛋白。一旦将ZFN或TALEN构建体引入细胞并在细胞中表达，可编程的DNA结合结构域就可以特异性结合相应的序列，并引导嵌合核酸酶(例如FokI核酸酶)以进行特定的DNA链切割。可以引入一对ZFN或TALEN，以产生双链断裂(DSB)，断裂会激活DNA修复***，并显著增加非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)的频率。
通常，单个锌指基序特异性识别3对碱基对，而具有串联重复的工程化锌指可识别高达9-36对碱基对。但是，筛选和识别所需的ZFN非常繁琐且耗时。尽管存在缺点，ZFN仍已在植物中用于在特定基因组位点引入小突变、基因缺失或外源DNA整合(基因置换/敲入)。与锌指蛋白相反，TALE来源于植物病原菌黄单胞菌，并包含34个氨基酸的串联重复序列，其中12和13位的重复可变双残基(RVD)决定了DNA结合的特异性。结果，具有16-24个串联重复的TALEN可以通过基因组序列特异性地识别16-24个，并且嵌合核酸酶可以在特定的基因组位点产生DSB。TALEN介导的基因组编辑已在包括酵母、动物和植物在内的许多生物中得到证明。
工程化的大范围核酸酶也可以用作基因编辑***。工程化的大范围核酸酶是内切核酸酶家族中的酶，其特征在于其识别和切割大DNA序列(14至40对碱基对)的能力。最广泛和最广为人知的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，其名称源于一段保守的氨基酸序列。
2.重组***
该实例描述了使用Cre介导的重组产生遗传定义的RNAi***，该***将整合的单个RNAi表达盒稳定转化为大鼠基因组中定义基因座的所需方向。该技术将使其他研究中发现的随机整合事件导致的克隆变异最小化，并应允许有效创建“表位等位基因”系列的RNAi构建体和一个诱导型RNAi***。申请人已经修改了为小鼠染色体工程而开发的***，以介导大鼠ES细胞中单个短发夹RNA(shRNA)表达盒的整合。该策略依赖于将包含shRNA表达构建体的“供体”质粒整合到“受体”基因座中并通过瞬时表达Cre重组酶使表达盒与启动子一起重新定位的能力。
ERT2-CRE-ERT2可能存在或可能不存在；当ERT2-CRE-ERT2不存在时，他莫昔芬可以代替CRE——TRE可以代替任何启动子或诱导型启动子。
loxP和lox2272可以代替其他的反向重复序列和重组***(即Flp/FRT、PhiC31/attP/B、Dre/Rox***)；当使用非ERT2***时，可替换掉他莫昔芬。
3.RNAi
今天的RNAi不是过去的RNAi
我们有继续证明RNAi在体内的能力，显示出其复制特定基因靶标的小分子抑制并查明与基因沉默相关的潜在毒性13,15-18的能力。经过数十年的创新和逐步改进，我们将RNAi带到了迄今为止的最高峰，现在有了新的SplashRNA算法26、验证方法27和优化过的miRE主链28可供我们使用，我们能够鉴定出最有效的shRNA序列，靶向针对任何基因，并将其整合到最有效的RNAi介导的基因沉默支架中。值得注意的是，Genentech公司在最近的一份技术报告中也证实了我们miRE设计的优越性，该报告揭示了RNAi平台之间的巨大性能差异，以及常用RNAi试剂的一些主要设计缺陷29。最近，我们开发了一种新的串联shRNA方法，称为multEmiR，它可以在体内同时有效抑制多个靶标，并可以再现抑制蛋白家族而不是单一酶的药物。为此，MultEmiR小鼠为多靶点抑制或联合疗法的关键临床前评估提供了途径。我们和其他人已经成功地将RNAi与药物治疗结合使用，以提供联合治疗的证据和/或确定潜在的合成致死相互作用18。
在某些方面，本发明提供了使用RNA干扰来稳定地、有条件地(例如，通过空间、时间和/或可逆的控制)并且特异性地靶向针对并降低细胞中一个或多个靶基因的表达的***。最近的工作表明，通过表达折叠成稳定的“发夹”结构的单个RNA分子，可以在哺乳动物细胞中概括外源提供的dsRNA的RNA干扰作用(Paddison,P.J.,A.A.Caudy和G.J.Hannon，《RNAi在哺乳动物细胞中稳定抑制基因表达》，美国国家科学院院报，2002.99(3):第1443-8页)。编码小“发夹”RNA(shRNA)的质粒的瞬时转染可以实现细胞中特定蛋白质水平的几乎完全降低。申请人现已证明，shRNA可以稳定地引入哺乳动物细胞中，优选位点特异性的方式，引入活生物体并繁殖而不会显著损失RNA干扰作用。此外，可以有条件地表达稳定整合的RNAi构建体(例如，可以以组织特异性或可逆的方式开启或关闭表达)。在以下实例中详细介绍了证实这一发现的各种实验。
本发明的许多实施方案采用含有使RNA自杂交形成发夹结构的反向重复区域的单链RNA分子。这种类型的shRNA分子可以在RNA或DNA载体中编码。术语“编码的”用于表示当适当的酶作用于载体(例如RNA聚合酶)时，载体将产生所需的shRNA分子(尽管其他加工酶也可能参与生成编码的shRNA分子)。如本文所述，包含一种或多种编码的shRNA的载体可以转染到离体细胞中，并且可以将细胞引入哺乳动物。shRNA的表达可以是组成型的或以所需方式进行调节。在体内实现RNA干扰的其他技术不可靠；某些构建体在干细胞中可以表达，但在分化细胞中不可表达，反之亦然。本文所述的技术使得有可能在所有细胞类型中在体内实现shRNA的组成型或高度调控的表达，从而允许在体内严格调控靶基因。
shRNA的双链结构由自互补RNA单链形成。RNA双链体的形成可以在细胞内或细胞外开始。抑制是序列特异性的，因为对应于RNA双链体区域的核苷酸序列被靶向针对以进行遗传抑制。对于抑制而言，优选含有与一部分靶基因编码或非编码序列相同的核苷酸序列的shRNA构建体。我们还发现，具有相对于靶序列的***、缺失和单点突变的RNA序列对于抑制是有效的。因为不需要RNA和靶基因之间的序列是100％同一性才能实施本发明，所以本发明具有能够耐受由于遗传突变、鼠株多态性或进化差异而可能预期的序列变异的优点。序列同一性可以通过本领域已知的序列比较和比对算法进行优化(请参见Gribskov和Devereux，《序列分析引物》，Stockton Press，1991，以及其中引用的参考文献)并通过例如史密斯-沃特曼算法计算核苷酸序列之间的百分比差异，史密斯-沃特曼算法在BESTFIT软件程序中使用默认参数实现过(例如，威斯康星大学遗传计算小组)。优选抑制性RNA与部分靶基因之间序列同一性大于90％，或甚至达到100％的序列。或者，RNA的双链体区域可以在功能上定义为能够与一部分靶基因转录物杂交的核苷酸序列(例如400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16个小时；然后洗涤)。在某些优选的实施方案中，shRNA的双链体形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸的长度，例如，其大小对应于由Dicer依赖性切割产生的RNA产物。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度至少为25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为400-800个碱基。shRNA构建体高度耐受环序列和环大小方面产生的变异。
细胞的内源RNA聚合酶可以介导核酸构建体中编码的shRNA的转录。shRNA构建体也可以通过在细胞中表达的噬菌体RNA聚合酶(例如，T3，T7，SP6)合成。在优选的实施方案中，shRNA的表达受RNA聚合酶III启动子的调控；已知此类启动子可产生有效的沉默。尽管基本上可以使用任何Pol II启动子，但理想的例子包括人U6 snRNA启动子，小鼠U6 snRNA启动子，人和小鼠H1 RNA启动子以及人tRNA-val启动子。U6 snRNA前导序列可以附加到初级转录物上；此类前导序列倾向于提高次佳shRNA的效率，而通常对有效shRNA几乎没有影响。为了在体内从转基因转录，可将调节区(例如启动子，增强子，沉默子，剪接供体和受体，聚腺苷酸化)用于调节shRNA单链(或多链)的表达。抑制的控制方式可能有：通过器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件的刺激(例如感染，压力，温度，化学诱导剂)；和/或发育阶段或年龄的工程转录。RNA链可能会或可能不会发生聚腺苷酸化反应；RNA链可能能够或可能不能够被细胞的翻译设备翻译成多肽。表达构建体的使用和生产在本领域是众所周知的(也请参见WO 97/32016；美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693；以及其中引用的参考文献)。
在一个优选的实施方案中，继使用由人U6 snRNA启动子产生的转录物生成U6snRNA前导序列之后，我们设计了具有29对碱基对螺旋的shRNA构建体。这个转录单元可以通过小鼠干细胞病毒(MSCV)为基础的逆转录病毒传递，将表达盒***包装信号的下游。关于优化shRNA构建体的进一步信息可以在例如以下参考文献中找到：P.J.,A.A.Caudy和G.J.Hannon,《RNAi在哺乳动物细胞中稳定抑制基因表达》，美国国家科学院院报，2002.99(3):p.1443-8；Brummelkamp,T.R.,R.Bernards和R.Agami，《一种在哺乳动物细胞中稳定表达短干扰RNA的***》，科学，2002.21:p.21；Kawasaki,H.和K.Taira，《tRNA(Val)启动子控制的短发夹型dsRNA在人细胞的细胞质中显著诱导RNAi介导的基因沉默》，核酸研究，2003.31(2):p.700-7；Lee,N.S.等人，《在人细胞中靶向针对HIV-1反转录物的小干扰RNA的表达》，自然生物科技，2002.20(5):p.500-5；Miyagishi,M.和K.Taira，《由U6启动子驱动、具有四个尿苷3'突出端的siRNA有效抑制哺乳动物细胞中的靶向基因表达》，自然生物科技，2002.20(5):p.497-500；Paul,C.P.等人，《人细胞中小干扰RNA的有效表达》，自然生物科技，2002.20(5):p.505-8。
通常将shRNA设计成与一个或多个靶基因具有部分或完全互补性(即，与一个或多个靶基因的一个或多个转录物互补)。靶基因可以是来源于细胞的一个基因、一个内源基因、一个转基因或感染后在细胞中存在的病原体的一个基因。取决于特定的靶基因，shRNA的性质和shRNA的表达水平(例如，取决于拷贝数，启动子强度)，该程序可以为靶基因实现部分或完全的功能丧失。细胞中定量基因表达可能在靶mRNA积累或靶蛋白翻译的水平上显示出相似程度的抑制作用。
“抑制基因表达”是指不存在来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物或其水平有可观察到的降低。“特异性”是指抑制靶基因而不对细胞的其他基因产生明显影响的能力。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外在特性(如以下示例中所示)或通过生物化学技术(例如RNA溶液杂交，核酸酶保护，诺瑟杂交，逆转录，基因表达微阵列监测，抗体结合，酶联免疫吸附测定(ELISA)，蛋白质印迹，放射免疫测定(RIA)，其他免疫测定和荧光激活细胞分析(FACS))来确认。对于在细胞系或整个生物中的RNA介导的抑制，可通过使用其蛋白质产物易于测定的报道基因或药物抗性基因来方便地测定基因表达。这些报告子包括乙酰羟酸合酶(AHAS)，碱性磷酸酶(AP)，β半乳糖苷酶(LacZ)，β葡萄糖苷酸酶(GUS)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，绿色荧光蛋白(GFP)，辣根过氧化物酶(HRP)，萤光素酶(Luc))，胭脂碱合酶(NOS)，章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。可获得多种可选标记物，这些标记物对氨苄青霉素，博来霉素，氯霉素，庆大霉素，潮霉素，卡那霉素，林可霉素，甲氨蝶呤，膦丝菌素，嘌呤霉素和四环素赋予抗性。
取决于测定方式，与不根据本发明方法进行处理的细胞相比，基因表达量的定量允许人们确定抑制程度大于10％，33％，50％，90％，95％或99％的抑制。例如，可以通过评估细胞中基因产物的量来确定抑制的效率：可以用具有用于抑制性双链RNA的区域之外核苷酸序列的杂交探针来检测mRNA，或者可以用针对该区域的多肽序列的抗体检测翻译的多肽。
如图1至6所示，如PCT申请PCT/US2016/051992所述，shGOI＝shRNA靶向目标基因，也可以是miRNA主链内的shRNA，例如miR30。
如本文所公开的内容所述，本发明不限于任何类型的靶基因或核苷酸序列。为了说明之用，列出了以下几类可能的靶基因：发育基因(例如，粘附分子，细胞周期蛋白激酶抑制剂，Writ家族基因，Pax家族基因，有翼螺旋家族基因，Hox家族基因，细胞因子/淋巴因子及其受体，生长/分化因子及其受体，神经递质及其受体)；致癌基因(例如ABLI,BCLI,BCL2,BCL6,CBFA2,CBL,CSFIR,ERBA,ERBB,EBRB2,ETSI,ETS1,ETV6,FGR,FOS,FYN,HCR,HRAS,JUN,KRAS,LCK,LYN,MDM2,MLL,MYB,MYC,MYCLI,MYCN,NRAS,PIM 1,PML,RET,SRC,TALI,TCL3和YES)；肿瘤抑制基因(例如APC,BRCA1,BRCA2,MADH4,MCC,NF1,NF2,RB1,p53,BIM,PUMA和WTI)；和酶(例如ACC合酶和氧化酶，ACP去饱和酶和羟化酶，ADP葡萄糖焦磷酸酶，ATP酶，醇脱氢酶，淀粉酶，淀粉葡糖苷酶，过氧化氢酶，纤维素酶，查耳酮合酶，几丁质酶，环加氧酶，脱羧酶，糊精酶，DNA和RNA聚合酶，半乳糖苷酶，葡聚糖酶，葡萄糖氧化酶，颗粒结合淀粉合酶，鸟苷三磷酸酶，螺旋酶，半纤维素酶，整合酶，菊粉酶，转化酶，异构酶，激酶，乳糖酶，脂肪酶，脂氧合酶，溶菌酶，胭脂碱合酶，章鱼碱合酶，果胶酯酶，过氧化物酶，磷酸酶，磷脂酶，磷酸化酶，植酸酶，植物生长调节因子合酶，多聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶和肽酶，支链淀粉酶，重组酶，逆转录酶，RUBISCO，拓扑异构酶和木聚糖酶)。
可用于控制shRNA构建体在体内表达的启动子/增强子包括但不限于Pol III人或鼠U6和H1***，巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子，人β肌动蛋白启动子，存在于小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)中的糖皮质激素诱导型启动子，莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV LTR)的长末端重复序列，SV40早期或晚期区域启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)3'长末端重复序列中包含的启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子/增强子和单纯疱疹病毒LAT启动子。哺乳动物宿主细胞中载体的转录受到例如启动子的控制，所述启动子从病毒基因组获得(例如多瘤病毒，鸡痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛***瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))、来源于异源哺乳动物启动子(例如免疫球蛋白启动子)以及来源于热休克启动子，但前提是这些启动子与宿主细胞***相容。可以使用诱导***，例如Tet启动子。另外，重组酶***，例如Cre/lox可用于允许在期望的时间切除shRNA构建体。Cre可对外部信号(如他莫昔芬)响应(转录或转录后)。
在某些实施方案中，将shRNA构建体引入细胞的载体***是逆转录病毒载体***，例如慢病毒载体***。慢病毒***允许在体外和体内将shRNA构建体传递至***和非***细胞群体并在其中表达。慢病毒载体的实例是基于HIV、FIV和EIAV的那些载体。请参见例如，Lois,C.等人，《慢病毒载体递送的转基因的生殖系传递和组织特异性表达》，科学，2002.295(5556)：p.868-72。大多数病毒***都包含包装所必需的顺式作用元件，而反式作用因子则由与载体共转染到包装细胞系中的单独质粒提供。在某些实施方案中，高度可转染的293细胞系可以用于包装载体，并且病毒可以用VSV-G包膜糖蛋白假型化以增强稳定性并提供广泛的感染宿主范围。在某些方面，本发明提供了经过修改以适用于shRNA表达盒的新型载体。例如，可以将Gateway受体序列***包装信号的下游，以促进shRNA构建体通过简单重组往返于不同载体骨架的运动。还有另一个例子，可以***重组信号以促进shRNA从例如全基因组shRNA文库的体内转移。
部分取决于将受到影响的生物和细胞类型，应选择要使用的载体和启动子的类型。对于人类患者的离体干细胞疗法，应选择能够在人类细胞中转染和表达的载体和启动子。
在某些实施方案中，可衍生出逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒，脾坏死病毒，劳斯肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。逆转录病毒质粒载体可用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14倍，VT-19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86,GP+envAml2和DAN细胞系，如Miller，《人类基因疗法》1：5-14(1990)中所述，通过引用将其全部内容并入本文。载体可以通过本领域已知的任何方式转导包装细胞。生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，颗粒包含编码本发明多肽的多核苷酸。然后可以使用这种逆转录病毒载体颗粒在体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达本发明中的多肽。
在某些实施方案中，使用腺相关病毒(AAV)工程改造细胞。AAV是天然存在的缺陷病毒，需要辅助病毒来产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，Curr，《微生物学专题》，免疫学158：97(1992))。它也是可能将其DNA整合到非***细胞中的少数病毒之一。可以包装并整合包含300个碱基对AAV的载体，但外源DNA的空间限制为约4.5kb。生产和使用这种AAV的方法在本领域众所周知。请参见，例如，美国专利号5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377。例如，AAV载体可以包括DNA复制、衣壳化和宿主细胞整合所需的所有序列。可以使用任何标准技术(包括脂转染，电穿孔，磷酸钙沉淀等)，将重组AAV载体转染到感染了辅助病毒的包装细胞中。合适的辅助病毒包括腺病毒，巨细胞病毒，牛痘病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生包含多核苷酸构建体的感染性AAV病毒颗粒。然后将这些病毒颗粒用于转导真核细胞。
基本上可以采用任何将核酸构建体引入细胞的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有该构建体的溶液，覆盖有该构建体的粒子轰击，将细胞、组织样品或生物体浸入核酸溶液中，或在存在该构建体的情况下对细胞膜进行电穿孔。包装在病毒颗粒中的病毒构建体可用于完成将表达构建体有效引入细胞以及转录编码的shRNA。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运，化学介导的转运例如磷酸钙等。因此，可以将shRNA编码的核酸构建体与执行以下一种或多种活动的组分一起引入：增强细胞对RNA的吸收，促进双链的退火，稳定退火的链或增加对靶基因的抑制。
用于shRNA和转染小鼠的其他方法可以在美国出版物编号2009/0217404中找到。
方法
本发明人已经证明，通过RNAi进行的基因抑制可以模拟小鼠的基因功能丧失8，并且开发了一种快速有效的方法，以在确定的基因组位点将对强力霉素(dox)有响应的、GFP标记的shRNA引入胚胎干细胞(ESC)中9-11。使用该***，本发明人已经创建了超过200个小鼠品系，以探索基因功能并测试体内全身性基因沉默的治疗潜力(图1A-1C)。例如，本发明人已经证明，靶向针对包括Trp53、INK4a/ARF、APC和PTEN的几种肿瘤抑制基因的转基因shRNA不仅概括了相应敲除动物的表型，而且还提供了一种手段以评估基因恢复在疾病进展上的结果10-12。本发明人还证明了在小鼠中RNAi介导的Myc13，Cdk914，Rpa315，Brd416，Ptgs217，eIF4F18，Nuak1(在印刷中)及其他基因的沉默能实现评估新的候选治疗靶标。
本发明包括用于简化生产转基因RNAi大鼠模型的平台，并展示了其可逆的基因沉默的能力(图3)。在第一个实施方案中，本发明使用CRISPR/Cas9在大鼠中建立***的关键成分(图2B)。本发明包括新的大鼠品系，其将用作将来高效编辑以将RNAi技术转移至大鼠模型的基础。在第二个实施方案中，本发明进一步包括将小的诱导型shRNA整合到预先设计的胚胎中，并确定最佳实践的效率和可扩展性。在第三个实施方案中，本发明包括使用RNAi平台与携带靶向Brd4的shRNA的大鼠一起，以及使用RNAi介导的基因沉默在大鼠中模拟药物干预。进行Brd4验证研究是为了将我们的结果与我们的Brd4 RNAi小鼠进行比较，并识别潜在的生物变异，并生成有价值的数据，这些数据可以为已经使用BET抑制剂启动的早期临床试验研究提供参考36-38。本发明提供了大鼠中RNAi介导的基因抑制，并且还为将来大规模生产RNAi大鼠和其他物种开发了一个平台。
使用CRISPR/Cas9建立创始人敲入大鼠
在第一实施方案中，本发明包括使用CRISPR/Cas9基因组编辑，包括产生至少三种具有以下特征的大鼠品系：(1)2.5kb“归巢盒”，归巢盒包含TRE启动子，GFP报告子和独特靶标位点(TRE-GFP-UTS或UTS)用于在随后的大鼠品种中快速有效地***shRNA(图2A)；(2)以tet诱导与GFP偶联的shRNA，靶向针对大鼠Brd4基因(TRE-GFP-shBrd4)以及(3)CAG-rtTA3tet反式激活因子盒，用于dox诱导的表达(图2B)。CRISPR***使用同源直接修复(HDR)39-41将外源DNA元件敲入精确的基因组位置，比传统的同源重组更有效；但是，HDR的效率会随着***片段的大小增加而降低。在小鼠中，使用<1.5kb的***片段时，成功率约为30-50％；但是，使用大于2kb的模板时，成功率会大大降低至<10％。因此，尽管本发明人已经使用直接注射方法成功地产生了具有高达10kb的***片段的小鼠，但是常规地***整个TRE-GFP-shRNA盒以产生每个新的RNAi大鼠模型在商业上是不可行的。为了促进达到高效率，本发明包括***2.5kb的***物，该***物包含在每个RNAi模型中使用的共同元件(即TRE-GFP-miRE)以及一段独特的gRNA靶序列(UTS)，此序列将用作共同的“着陆垫”用于随后引入特异性shRNA(图2A)。本发明包括使用染色体10上的Col1a1基因下游的区域进行***，因为该区域已经表明是小鼠中广泛转基因表达的安全港。同时，本发明包括产生包含整个TRE-GFP-shBrd4盒的模型以获得可立即用于验证的大鼠，同时建立高效靶向平台。最后，本发明包括通过在Rosa26基因座处***产生CAG-rtTA3大鼠品系。本发明包括通过将CRISPR试剂(Cas9蛋白+gRNA+供体模板)直接注射到Sprague Dawley(SD)胚胎中来产生每个大鼠品系。每个品系的至少2个创始人鼠株将与SD对照动物一起接受全基因组测序，以识别是否存在任何脱靶效应。在一个实施方案中，选择了SD鼠株，但是也可以选择其他鼠株。在其他实施方案中，也可以设计近交系鼠株。其他品系包括但不限于以下品系：棕色挪威大鼠，布法罗大鼠，哥本哈根大鼠，达尔/盐敏感性大鼠，F344大鼠，FHH大鼠，菲舍尔大鼠，Goto-Kakizaki大鼠，刘易斯大鼠，李斯特连帽大鼠，Long-Evans大鼠，肥胖易感CD大鼠，肥胖抵抗CD大鼠，OFA大鼠，SHR大鼠，SHHF大鼠，Wistar大鼠，ZDF大鼠，Zucker大鼠。
在一个实施例中，UTS序列可以选自表1中的以下项：
表1：大鼠CTE UTS
Figure BDA0002605387800000271
Figure BDA0002605387800000281
Figure BDA0002605387800000291
Figure BDA0002605387800000301
Figure BDA0002605387800000311
Figure BDA0002605387800000321
Figure BDA0002605387800000331
第一个实施方案为第二实施方案提供了一个高效平台，并且提供了一个对第三实施方案中我们的RNAi平台的验证方式。本发明包括产生具有图2B中概述的等位基因的三个独立大鼠品系。本发明包括来自每个鼠株的2-3个创始人全基因组测序，以鉴定潜在的脱靶效应并消除具有不希望出现的诱变的创始人品系。
Thom Saunders博士(密歇根大学)已成功使用CRISPR/Cas9产生了超过400只敲入大鼠，其公开文献为Gopalakrishnan K,Kumarasamy S,Abdul-Majeed S,Kalinoski AL,Morgan EE,Gohara AF,Nauli SM,Filipiak WE,Saunders TL,JoeB，《针对高血压大鼠遗传模型中Adamts16基因的靶向破坏》，美国国家科学院院报，2012年12月11日；109(50):20555-20559，(PMID 23185005)PMC 3528556。
5'ColA1的基因分型PCR如下所示，序列ID：11号：
caataccagacgcacagcat[YY1]cacgggcaaactcgcacgcacttcaaatcccggaccacccatacctcaggccagaatcctaatggtgtatcactcttccatgatgtagacctgaggcc
Tggcgaggtgttgcctatgggtcctgagaggctcagggactctcaaaaggatccagagggagggaacagggactgagtcatggaggaccaggtttctccctggtcaagcatggaggggtagtt
Ggcttctccccatctcttgcccaaagaaacaagtgatttgatatagaaggggccttttgaggctggag tgccaccgattgcatatctgggggatcgattctagattcgagtttaccactccctatca
Gtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatc
Agtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctat
Cagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacg
ctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccgtcgagcttgcgttggatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacg[YY3]
其中，[YY1]是Col F1，[YY3]是EGFP NR。PCR产物大小：包括WT：无PCR产物，Col1A1盒KI为866bps。
3'ColA1的基因分型PCR如下所示，序列ID：12号：
ggggcaaagttttcagggtg[YY1]ttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttctttt
Cattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgt
Acttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacaccctggtcatcatcctg
Cctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctctttcctacagctcctgggcaacgtgct
Ggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaaggattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatcgttttccctctgcc
Aaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaatttctcgatcgctagtacgaccgtaagaatgttctgaggtc
actcttgctctcaccagagggaggtgcccagctcccaaagggatctcctgggggctcttagagagctgtggtgaaggaacttccagtgtgtcaccagaaaggacaggaccccac[YY2]
其中，[YY1]是RGB F1，[YY2]是Col R1。PCR产物的大小包括WT：无PCR产物，Col1A1盒KI：900bps。
Col1A1盒阳性动物ID：274、278、283、284、285、291和294。基因分型PCR产物的序列汇总显示在表2中。
表2：基因分型PCR产物序列汇总
Figure BDA0002605387800000341
Figure BDA0002605387800000351
注意：大多数错配位于空间区域或非重要区域。
图5A-5B显示5'ColA1#261-284的PCR结果；图5C-5D显示5'ColA1#285-300的PCR结果。
图6A-6B显示3'ColA1#261-284的PCR结果；图6C-6D显示3'ColA1#258-300的PCR结果。
图7A-7B显示5'ColA1#701-724的PCR结果。图7C-7D显示了5'ColA1#725-748的PCR结果。图7E-7G显示5'ColA1#749-773的PCR结果。
图8A-8F显示了3'ColA1#701-773的PCR结果。
脱靶裂解是对工程核酸酶普遍关注的地方42；然而，一些研究表明，CRISPR/Cas***在动物中的脱靶作用远低于在培养细胞中的脱靶作用，部分是因为Cas9和gRNA在胚胎中只是存活时间很短的RNA43,44。尽管最近报道有高脱靶率的体内诱变42，但许多人对此表示否认，并指出使用的高浓度的CRISPR试剂是该出版物的罪魁祸首，从而迫使对数据的解释作进一步的编辑审查。尽管如此，为了使具有脱靶切割的创始人鼠株的繁殖最小化，本发明包括来自每个鼠株的至少2只创始人大鼠的全基因组测序，以鉴定Cas9的任何潜在的脱靶切割。本发明包括仅繁殖没有脱靶事件的大鼠；但是，如果所有创始人动物都出现突变，我们将进行繁殖培育以分离并从我们的品系中删除突变等位基因。
评估UTS靶向平台的效率
在第二实施方案中，本发明包括快速修饰shRNA序列并将其***一个UTS“归巢盒”平台。为此，本发明包括繁殖UTS和CAG-rtTA3大鼠，以从怀孕供体雌鼠中获得单细胞胚胎。本发明包括使用多种实验条件进行Cas9/gRNA+shRNA ssODN供体盒的细胞质注射和核前注射，从而建立最佳参数以使CRISPR/Cas9介导的HDR在我们的环境中的功效最大化(图4)。在一个实施方案中，实验条件包括但不限于：Cas9 mRNA：
Figure BDA0002605387800000361
gRNA
Figure BDA0002605387800000362
(大于1时每次如此)；ssODN或供体DNA
Figure BDA0002605387800000363
浓度的变化即为要变化的条件。尽管较高浓度的Cas9和供体DNA可以提高HDR效率，但它可能导致注射混合物的粘度更高，从而需要更大的显微注射针尖。这最终可能导致胚胎破裂或可行性降低和/或无法将胚泡成功转移至受体雌鼠。此外，也有报道称与合成引导序列(可商购)预复合的Cas9蛋白的使用产生的效率要高于体外转录产生的Cas9 mRNA，在实验室中使用这两种方法的效率相近。本发明使用各种条件和试剂来定义将来用于***生成的最佳方法。注射后，本发明包括培养直至胚泡阶段的胚胎，并收集它们用于在强力霉素处理后通过T7核酸内切酶检测器测定、DNA测序和GFP/shRNA诱导进行筛选。我们会仔细记录我们在每种情况下的效率，以识别“最佳做法”，并建立适用于经济有效地扩展我们方法的方案。考虑到我们独特的shRNA ssODN的大小将保持恒定，因此本发明对用于所有未来生产的浓度和Cas9试剂进行了标准化处理。最后，通过选择最有效的显微注射条件，本发明优化了生产时间表以建立一个用于RNAi大鼠生产的快速平台，并证明了这种快速产生RNAi大鼠的方法的商业可行性。
第二实施方案包括：1)通过以小的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)的形式***shRNA产生RNAi大鼠胚胎；2)确定CRISPR/Cas9介导的HDR的最有效方法和浓度；3)建立可扩展性和快速生产的最佳实践。
第二实施方案评估了将ssODN***我们“归巢盒”内的UTS的可行性和效率。尽管不会生成使用这些胚胎的完全RNAi大鼠，但是胚胎中基因编辑的效率将准确反映未来生产RNAi大鼠的成功率。当通过CRISPR/Cas9产生小鼠时，评估培养胚胎中基因编辑的这种做法是我们的标准程序，它可以在投入时间和成本以产生整个动物之前测试多种条件并优化策略，从而减少活体动物的生产和筛选以及动物废弃。通过利用大鼠中的CRISPR编辑、测试多种条件并仅利用小的供体模板，本发明建立了一个成功靶向的优化方案。
使用诱导型shBrd4大鼠的RNAi平台验证
第三实施方案包括一个在大鼠模型中诱导有效和可逆基因表达的RNAi***。为此，本发明使可诱导的shBrd4和CAG-rtTA3鼠株杂交以产生双转基因大鼠。这些大鼠将用强力霉素处理8至14天，然后从强力霉素处理中移出，并在表型和组织学上进行分析，如先前的研究一样检查肠道干细胞区室、体重减少/增加、上皮和心肌16，23，24。本发明包括在精选的组织上进行蛋白质印迹分析以定量敲除水平。另外，本发明评估：(1)GFP诱导，方法是通过全组织成像和荧光显微术以高放大率对组织切片进行观察；(2)Brd4敲除水平，方法是通过免疫荧光，并与GFP表达比较(应成逆相关)；(3)使用主要器官***的组织学，包括肠道，皮肤，胰腺，肝脏，脾脏，肾脏，心脏，肺，肌肉和骨髓，对大鼠和小鼠之间进行比较表型分析。第三实施方案提供了RNAi大鼠模型的概念验证和证明，以继续开发用于快速生产和商业化的平台。
第三实施方案包括：1)评估所有组织中的全局GFP表达；2)证明在大鼠中的有效Brd4敲除；3)评估shBrd4大鼠的毒性，并与以前的其他研究进行比较。
通过利用Col1a1和Rosa26基因座进行整合，在小鼠中工作的安全港基因座由于其染色体同源性而将转化为大鼠基因组中的安全港。实际上，已经使用了两个广泛使用的小鼠基因座Rosa26和Hprt来生成转基因大鼠，并且确实表现出与小鼠中相似的表达模式45,46。最终，第三实施方案证明了shRNA和CAG-rtTA3两者在它们各自的基因座处的整合，并允许在整个大鼠中进行有效的普遍表达。如果在产生CAG-rtTA3鼠株方面有任何困难，则第三实施方案可以使用Rosa26-rtTA2鼠株46进行测试。
未来方向
本发明产生了一个快速、灵活以及可扩展的平台，用于***地产生具有时间性和可逆性抑制内源基因的独特能力的诱导型RNAi大鼠模型。用于生成RNAi小鼠的这种高通量***也适用于大鼠***，并且，延伸一下，适用于其他哺乳动物模型，包括但不限于豚鼠，兔子，猫，狗，非人类灵长类动物，猪。本发明将为传统的基因缺失方法提供一种可替代的、更快速且具有成本效益的方法，并帮助研究人员探索了解动物模型中特定基因的功能。诱导型RNAi大鼠模型无疑将成为强大的工具，可用于模拟人类疾病，模拟推定药物的作用以及在昂贵的药物开发之前评估体内治疗靶向策略的潜力。本发明可能检查与***抑制新靶标(如STAG147，CMTM648和FZD549)有关的潜在毒性，以帮助指导临床治疗。在现代医学的今天，如果我们能够预见潜在的危害，就可以避免许多药物引起的毒性伤害(例如，CAR-T疗法引起的细胞因子释放综合征现在可以利用IL6R拮抗剂托珠单抗的联合治疗得到有效管理50)。诱导型RNAi大鼠生产速度和成本的提高以及他们将提供的见解将大大增加商业和学术实验室的需求。
说明性用途
A.遗传操纵和治疗的方法
在某些方面，本发明提供了在细胞中产生特异性遗传病变和减弱基因表达的方法，它们可能分别通过CRISPR/Cas9介导的基因工程和shRNA表达的方式减轻疾病。根据本文公开的方法，gRNA、Cas9和shRNA可以在体内在多种细胞类型中可靠地表达。在某些实施方案中，对细胞进行施用处理以治疗病症。遗传操纵与细胞中shRNA表达相结合的多种机制可能有效治疗疾病。例如，病症可能部分地由表达不良基因组合的细胞群引起，其中某些细胞必须进行遗传改变，而另一些则只能进行抑制以达到治疗效果。可以消融这些细胞，并用包含正确基因和shRNA的施用细胞替换，以分别“修复”特定基因和/或减少其他不良基因的表达；或者，患病细胞可以用所施用的细胞竞争性对抗而无需消融。如另一个例子，病症可以由分泌因子的缺乏引起。通过施用表达间接刺激分泌因子生成的shRNA的细胞，例如抑制抑的抑制表达，可以改善这种疾病。
CRISPR/Cas9可用于改变几乎任何基因的遗传组成，就像shRNA可基本上靶向任何基因一样，并且在某些情况下，这种组合将需要获得可能有助于治疗疾病的基因表达谱。例如，就癌症疗法而言，单一疗法通常无效，而联合疗法已成为提供最佳预后的有效疗法的支柱。靶基因可能参与受试者的疾病过程。靶基因可能编码病毒在病毒感染期间增选的宿主蛋白，例如病毒在感染细胞时结合的细胞表面受体。HIV与多种细胞表面受体结合，包括CD4和CXCR5。引入携带有特定基因操作的HSC或其他T细胞前体以及针对HIV受体或共受体的shRNA有望产生抗性T细胞库，从而减轻HIV感染的严重性。类似的原理也适用于其他病毒感染。
免疫排斥通过外源主要组织相容性复合体的识别进行介导。在将异源细胞施用于受试者的情况下，可以对所述细胞进行遗传改变并用靶向可能被宿主免疫***识别的任何MHC组分的shRNA转染。
在许多实施方案中，经shRNA转染的细胞将通过部分或全部替代受试者中的患病细胞群而获得有益的结果。转染的细胞可以是自受试者细胞衍生但携带具有有益作用的shRNA的自体细胞。
B.在动物中诱发和治疗疾病的方法
本发明的一种用途是产生既具有引发疾病过程的潜力又携带可用于治疗疾病本身的shRNA的动物模型。通过并入图1-？所示胚胎干细胞(ESC)中的结构，可以通过胚泡注射产生ESC衍生的动物。在任何时间点，CRISPR/Cas9介导的诱变均可通过用强力霉素对动物进行处理而诱导。通过用强力霉素处理怀孕雌鼠，甚至可能在胚胎中引发诱变。这些诱发的突变是对突变敏感的疾病引起的，并引发一系列导致疾病发病的事件。在疾病发展期间的不同时间点，可以通过CRE/他莫昔芬处理诱导***的盒发生倒置。随后，在发生倒置事件之后，用强力霉素进行处理可诱导shRNA的表达，从而使可能具有治疗疾病的治疗潜力的特定基因沉默或减弱疾病的进程。
该***提供了在特定时间点诱导多种遗传操纵的独特能力，而不必使小鼠与携带其他疾病等位基因的鼠株杂交。其独特之处在于，抑制基因功能的shRNA也可以在疾病进展后使用，以确定靶基因是否具有治疗潜力或可能加速疾病的发展。
C.筛选测定
本发明的一个用途是作为一种通过CRISPR/Cas9诱导特定表型并在生物体，特别是高级真核生物的特定表型环境中鉴定基因功能的方法，它包括使用双链RNA来抑制以前未知功能的靶基因的活性。不用像传统遗传筛选那样费时费力地分离突变体，功能基因组学将设想通过采用本发明减少靶基因活性的量和/或改变靶基因活性的作用时间来确定未表征基因的功能。本发明可用于确定药物的潜在靶标、了解与发育有关的正常和病理事件、确定负责产后发育/衰老的信号传导途径等。从基因组和表达的基因源(包括哺乳动物基因组的总序列)获得核苷酸序列信息的速度在不断加快，可以与本发明结合以确定细胞或整个生物体中的基因功能。偏好不同生物体以使用特定密码子，在序列数据库中搜索相关的基因产物，将遗传性状的连锁图谱与核苷酸序列所源自的物理图谱相关联，以及人工智能方法可以使用来定义来自这样的测序项目中获得的核苷酸序列的推定开放性阅读框。
一种简单的测定方法将是根据可从表达的序列标签(EST)获得的部分序列抑制基因表达。生长，发育，代谢，抗病性或其他生物学过程中的功能改变将指示EST基因产物的正常作用。
可以很容易地产生表型，然后可以在包含靶基因的相同完整细胞/生物中活化dsRNA构建体，这使得本发明可以用于高通量筛选(HTS)。例如，双链RNA可以通过使用源自靶细胞或生物的任何基因文库的***片段侧翼的引物通过扩增反应来产生。***序列可衍生自基因组DNA或mRNA(例如cDNA和cRNA)。可以复制文库中的单个克隆，然后在单独的反应中进行分离，但是优选将文库保存在单独的反应容器(例如96孔微量滴定板)中，以最大限度地减少实施本发明所需的步骤，并实现过程自动化。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了RNAi构建体的阵列文库。该阵列可以是溶液的形式，例如多孔板，或者可以“印刷”在细胞可在其上生长的固体基质上。为了起到说明作用，可以将包含能够抑制不同表达基因的双链体RNA的溶液作为有序阵列放置在微量滴定板上的各个孔中，并可以测定每个孔中完整的细胞/生物的行为或发育因靶基因活性受到抑制而发生的变化或修饰。
在某些方面，本发明提供了用于评估体内基因功能的方法。可以将包含旨在减少靶基因表达的shRNA表达构建体的细胞引入动物中，并且可以评估表型以确定水平降低的基因表达的作用。整个动物可以从含有旨在减少靶基因表达的shRNA表达构建体的细胞(例如ES细胞)产生。可以评估转基因动物的表型。
动物基本上可以是任何在实验上易处理的动物，例如非人灵长类动物，啮齿动物(例如小鼠)，兔类动物(例如兔)，犬科动物(例如家犬)，猫科动物(例如家猫)。通常，优选具有完整或接近完整的基因组计划的动物。
待评估的表型基本上可以是任何有兴趣的东西。定量干细胞对特定组织或肿瘤有贡献的趋势，是鉴定参与干细胞分化以及肿瘤发生和肿瘤维持过程的靶基因的有效方法。可以观察到与疾病状态相关的表型，例如对病毒、细菌或其他感染的易感性，胰岛素产生或葡萄糖稳态，肌肉功能，神经再生，一种或多种代谢产物的产生，行为模式，炎症，自身抗体的产生，肥胖等。
可以使用一组通过不同程度影响靶基因表达的shRNA，并且可以评估表型。特别地，测量基因表达降低的程度和特定表型之间的任何相关性可能有用。
可以将shRNA构建体的异质池引入细胞，并且可以将这些细胞引入动物。在这类实验的一个实施方案中，将使细胞经受选择性压力，然后将有可能鉴定哪些shRNA对选择性压力产生抗性或敏感性。选择性压力可能非常微妙或只是偶然产生，例如，仅植入转染的HSC可能是一种选择性压力，某些shRNA会干扰植入过程，而其他shRNA会促进植入过程。发育和分化可能被视为“选择性压力”，一些shRNA会调节某些干细胞分化为后代的不同子集的趋势。如下所述，可以将化学治疗药剂处理用作选择性压力。可以从文库获得shRNA的异质池，并且在某些优选的实施方案中，该文库是条形码文库，允许快速鉴定shRNA种类。
在某些方面，本发明提供了鉴定影响肿瘤细胞对化学治疗药剂敏感性的基因的方法。在人类癌症中作为化学抗性基础的分子机制大部分仍然未知。尽管各种抗癌药剂显然具有不同的作用机制，但大多数最终会干扰DNA合成或产生DNA损伤。反过来，这会触发细胞检查点，这些检查点要么阻止细胞增殖以允许修复，要么通过凋亡或衰老引起从细胞周期中永久退出。
在某些实施方案中，方法包括将包含编码shRNA的核酸构建体的转染的干细胞引入受试者，其中shRNA与靶基因的至少一部分互补，转染的干细胞显示出水平降低的靶基因表达，并且转染的干细胞在体内产生转染的肿瘤细胞。例如，干细胞可以源自对肿瘤发生具有遗传易感性的动物，例如过表达癌基因的动物(例如，Eμ-myc小鼠)或肿瘤抑制基因敲除的动物(例如，p53-/-动物)。或者，可将包含干细胞的动物暴露于致癌条件下，从而产生包含源自干细胞的细胞的肿瘤。可以用化学疗法或其他抗肿瘤方案治疗患有肿瘤的动物，并且可以评估该方案对表达shRNA的细胞的作用。抗肿瘤治疗后过度表达的shRNA可能针对产生敏感性的基因。抗肿瘤治疗后代表性不足的shRNA可能针对产生抗性的基因。代表性不足的shRNA可能会被开发以用作联合治疗药物，与所述化学治疗药剂共同给药并抑制耐药性。
过度代表和代表不足通常是相对而言，并且确定这些参数通常将涉及与对照或基准的比较。可以简单地与化疗之前的同一只动物进行比较。还可以与尚未接受化学治疗药剂的对照受试者进行比较。可以与多个其他shRNA试验的平均值比较。尽管实验方案应基本相同，但任何对照都无需与实验同时进行。
可以在单独的shRNA上执行该技术(请参见例如在下面的示例中的BIM shRNA)。该技术也可用于高度平行筛选。例如，一种方法可以包括将多个转染的干细胞引入受试者体内，其中每个转染的干细胞都包含核酸构建体，该核酸构建体包含shRNA文库的代表性shRNA，并且shRNA文库的代表性shRNA与代表性靶基因的至少一部分互补，多个转染的干细胞表现出代表性靶基因的表达降低，并且多个转染的干细胞在体内产生转染的肿瘤细胞。尤其是，没有必要或没有期望每个shRNA都不同或每个转染的细胞都将成为肿瘤的一部分。一旦产生了肿瘤，就可以采用化学疗法或其他抗肿瘤方案，并且可以评估shRNA种类过量表达或表达不足的情况。在某些优选的实施方案中，每个代表性shRNA与允许快速鉴定每个shRNA的可区别标记相关。例如，shRNA可以从带有条形码的shRNA文库中获得。
本文所述的某些方法利用以下事实：可以从受影响的小鼠中分离出大量癌细胞(例如，淋巴瘤细胞)，并将其移植到同系、具有免疫能力的受体中，以产生与自发性疾病几乎无法区别的淋巴瘤。这允许在体外操纵肿瘤细胞以产生可以在体内分析的潜在化学抗性变体。在某些示例性实施方案中，本发明利用Eμ-myc***的优势无偏差地寻找可以针对化学治疗药剂赋予抗性的遗传改变，例如广泛使用的烷化药剂CTX。
以下概述了使用无偏差遗传方法鉴定赋予CTX抗性的基因的筛选实例。此筛选的概述在图19中用图展示。从Eμ-myc小鼠中分离出的淋巴瘤细胞群接受了一系列经过序列验证的、专门靶向鼠类基因的shRNA。将工程细胞导入具有免疫能力的同系受体动物中。一旦出现肿瘤，就用CTX治疗动物。在每种情况下，测量缓解的时间，并且在复发时，对动物进行第二轮治疗。经过两轮治疗后，鉴定出抗性细胞群中的shRNA，并将其转移到新鲜的淋巴瘤细胞群中，然后将这些淋巴瘤细胞移植到无淋巴瘤细胞的动物中。在经过适当数量的选择循环后，就获得了能够赋予抗药性的单个shRNA。
D.细胞递送***
在某些实施方案中，本发明提供了配制用于治疗患者(例如患病的人或动物)的复合物。如此配制的复合物可包含干细胞和核酸构建体，所述干细胞包含Cas9蛋白和gRNA以诱导特异性遗传改变，所述核酸构建体编码被设计用来降低靶基因表达的shRNA。复合物还可包含药学上可接受的赋形剂。基本上可以使用任何合适的细胞，包括选自本文公开的那些的细胞。转染的细胞也可以用于制备用于治疗受试者的药物。药学上可接受的赋形剂的例子包括细胞可以附着的基质、支架结构或其他底物(可选择地形成固体或空心珠、管或膜)，以及有助于促进给药(例如缓冲液和盐)、保存细胞(例如螯合剂，如山梨酸盐，EDTA，EGTA或季胺或其他抗生素)或促进植入的试剂。
细胞可以被封装在膜或微胶囊中。可将细胞置于由藻酸盐或聚丙烯酸酯组成的微胶囊中。Aebischer等，美国专利号4,892,538；Aebischer等，美国专利号5,106,627；美国专利号4,391,909；美国专利号4,353,888。
本领域技术人员可以根据细胞的类型和治疗目的来选择产生胰岛素的细胞组合物的植入部位。示例性的植入部位包括静脉内或动脉内给药，肝脏给药(通过门静脉注射)，腹膜腔，肾囊或骨髓。
其他说明性用途可以在美国专利号8,697,359中找到，该专利在此引为参考，包括用于植物基因组学和其他治疗方法。
本文所提及的所有出版物和专利均通过引用全文并入本文，就好像每个单独的出版物或专利均被具体地、单独地指示通过引用并入。在发生冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。
引用文献
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<210>1
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<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 1
gcttcgtgta aactccctcc atcccaatct ggttccctcc cacccagccc actttccccc 60
aaccctggaa acagaccaac aacccaaact caatttcccc aaaagccaaa aattgggaga 120
caatttcaca tggactttgg aaaacatttt tttcctttgc attcatctct caaacttagt 180
ttttatcttt gaccaactga acgtgaccaa aaaccaaaag tgcattcaac cttaccaaaa 240
agaaaaaaaa ataagaataa ataaataact ttttaaaaaa ggaagcttgg tcctcttgct 300
tgaagaccta tgtgggtata agtccctttc tgcccactgg gcttatgata ccccaaatgc 360
tgccttttct gttcctttct ccaccccctc ttggggcctc tcctccattg ctccccaaat 420
ttaagtctcc cccaaagaca caggaaataa tgcattgtct gcccagccag caaaggcaat 480
gctgaatcgt cccaccagcc cctcaacccc cagcctactt ccctacccag caccttcaaa 540
tcctgccggg acatggggtt ctcggactat tgaaggagcc taaccatctg gcatctccat 600
ggcctctgca acaaatcccc acacacactt tgtttttgag ggcctgtgct gggggagcca 660
cctgcccctc gcaggggttt ggagccaggc agggtcacag cagactggaa acatcggcca 720
cacatgtgca ggctgggtgg gagagactgt tctgttcctt gtgtaattgt gttgctgaaa 780
gactacctcg ttcttgtctt tgtgtgtcac cggggcaact gtgtgggggc ggggatgggg 840
gcagggtggc agcgcgccca gtttggtatc aaaggtgcta catctctgtg aaggggtggg 900
gtgggaagga atttctggtg ctatagaatc tgagatgctc ccctagacca gcaaatgttc 960
cttttgttca aagtattttt ttattctttt ttttttaatg gatagggact tgtgtgaatt 1020
ttcttttcct gacggtgcta tttaacaagg gaggagagag tgccaactcc agcctgctct 1080
ctctctaccc ccctcttcac tcttccagct cctgggccta tctgatgatc tctctctctt 1140
ctgaaaccct cccctcttgc tgctgctccc taccctcagc ttctctctct ctctgtcctg 1200
catcagggtt tcagagcacc attttccaaa gcacaaagca gtttttatcc ctggggtggg 1260
aggaagcaag agactctgta cctattttgt atgtgtataa taatttgaga tgtttttaat 1320
tattttgatt gctggaataa agcatgtgga aatgacccaa cgcatgttca gtggtctctg 1380
aatttccttc ctggaacttg gggaggtggg gatccaggga gaggctttgg gatgtgtgag 1440
gcagggagct tgtcttctac catcaccctt tatctctccc cccacttctc atccagatgc 1500
cgttgccttc ctcttgcctt tcttacgcct tagacccatt tttcttgcct cttttacctt 1560
ttcccctttc aagtcctctt tgcacatccc caagtccccc aagtctccac cacagttcaa 1620
taccagacgc acagcatcac gggcaaactc gcacgcactt caaatcccgg accacccata 1680
cctcaggcca gaatcctaat ggtgtatcac tcttccatga tgtagacctg aggcctggcg 1740
aggtgttgcc tatgggtcct gagaggctca gggactctca aaaggatcca gagggaggga 1800
acagggactg agtcatggag gaccaggttt ctccctggtc aagcatggag gggtagttgg 1860
cttctcccca tctcttgccc aaagaaacaa gtgatttgat atagaagggg ccttttgagg 1920
ctggagtgcc accaggaggg taagaatgtt ctgaggtcac tcttgctctc accagaggga 1980
ggtgcccagc tcccaaaggg atctcctggg ggctcttaga gagctgtggt gaaggaactt 2040
ccagtgtgtc accagaaagg acaggacccc acaccacaga ggtgcgtggg tcactcctgg 2100
tcttcggcgt gcccagagag cgtgctggct cggtgcaggg ggcctgtgga atcatgccac 2160
ccttcctcct gcctcttctt ccctttgcct ttatctctac aactttttgc ttctttttcc 2220
tccttttccc ccctccctcc ttccctccct tcctctgccg gtctgagaat ctgaggccct 2280
aggagagtgg taactgactg tcccccacat ctcagagaat ggggacatag tggaaggtct 2340
gagaatccag caggcaggag tctgcactga accggacact aaacataagg acacaggtga 2400
ccccattcag ggggtcaggt ctcaaatttg aaaggaaggc acagactact tgtagcttcc 2460
ctttcttgtg ctaccagaga gaccaactaa tctactgcag tgtccactgg acacgatctt 2520
actgccactg agtactcgag actgttaatt atgaccttta ataatttatt actagcactt 2580
tacatgaggg caatgtaaaa agaaaattta tctagagagg aaaagaagtt gaggagtata 2640
aatgaagatc tatttagaca caaattaccc aaaattgcgt ggtcctgata gacccattga 2700
ttgatgcagt gattgggtga tacctttctc cccaggcatc cccagtcttg aggctcttcc 2760
tggcttagac cctatctctt cccatcctca cagggtccat ccttctgaac tcagcatctg 2820
agctgtacct ggccactact cacttgtcta agcttattgt ctcctccagg gcctacatct 2880
gtcatctcag tcaataggca tgattacaat ttatatatat aatatatata cacatatatt 2940
atatataata taaattcaca tacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 3000
cacacacaca caagcccaag ctgacctcag ccctctgagg tcccaacaca ctgctagccc 3060
cttacccaga cgttacaggc ccctgtggtc atggtccacc atgttctttc tagtgtcaag 3120
gcctggaaat tctgtgcagg gctgggcaca gtcttcatag gtactaggga gagacaagat 3180
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tgaaggtgag aggaaggaga acaaacgaca gtttcctgac gtgacaggta gttgagccct 3300
taaaatgtgg ctccgtgata aaggactgca atcctcactt ttactactgc aatcactttc 3360
actaactgca aaagggctga aggaagcaag ctccaggcaa aggagcgaag agcgcctctc 3420
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<213>Rattus norvegicus
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cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 3000
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 3060
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 3120
cgagctgtac aagtaatgaa taacagggta attgtttgaa tgaggcttca gtactttaca 3180
gaatcgttgc ctgcacatct tggaaacact tgctgggatt acttcgactt cttaacccaa 3240
cagaaggctc gagaaggtat attgctgttg acagtgagcg cctcggactt caaggggcta 3300
gaattcgagc aattatcttg tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt 3360
tttacaaagc tgaattaaaa tggtataaat taaatcactt ttttcaattg acgcgttgag 3420
aacttcaggg tgagtttggg gacccttgat tgttctttct ttttcgctat tgtaaaattc 3480
atgttatatg gagggggcaa agttttcagg gtgttgttta gaatgggaag atgtcccttg 3540
tatcaccatg gaccctcatg ataattttgt ttctttcact ttctactctg ttgacaacca 3600
ttgtctcctc ttattttctt ttcattttct gtaacttttt cgttaaactt tagcttgcat 3660
ttgtaacgaa tttttaaatt cacttttgtt tatttgtcag attgtaagta ctttctctaa 3720
tcactttttt ttcaaggcaa tcagggtata ttatattgta cttcagcaca gttttagaga 3780
acaattgtta taattaaatg ataaggtaga atatttctgc atataaattc tggctggcgt 3840
ggaaatattc ttattggtag aaacaactac accctggtca tcatcctgcc tttctcttta 3900
tggttacaat gatatacact gtttgagatg aggataaaat actctgagtc caaaccgggc 3960
ccctctgcta accatgttca tgccttcttc tctttcctac agctcctggg caacgtgctg 4020
gttgttgtgc tgtctcatca ttttggcaaa ggattcactc ctcaggtgca ggctgcctat 4080
cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcgtttt 4140
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4200
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt tctcgatcgc tagtacgacc 4260
gtaagaatgt tctgaggtca ctcttgctct caccagaggg aggtgcccag ctcccaaagg 4320
gatctcctgg gggctcttag agagctgtgg tgaaggaact tccagtgtgt caccagaaag 4380
gacaggaccc cacaccacag aggtgcgtgg gtcactcctg gtcttcggcg tgcccagaga 4440
gcgtgctggc tcggtgcagg gggcctgtgg aatcatgcca cccttcctcc tgcctcttct 4500
tccctttgcc tttatctcta caactttttg cttctttttc ctccttttcc cccctccctc 4560
cttccctccc ttcctctgcc ggtctgagaa tctgaggccc taggagagtg gtaactgact 4620
gtcccccaca tctcagagaa tggggacata gtggaaggtc tgagaatcca gcaggcagga 4680
gtctgcactg aaccggacac taaacataag gacacaggtg accccattca gggggtcagg 4740
tctcaaattt gaaaggaagg cacagactac ttgtagcttc cctttcttgt gctaccagag 4800
agaccaacta atctactgca gtgtccactg gacacgatct tactgccact gagtactcga 4860
gactgttaat tatgaccttt aataatttat tactagcact ttacatgagg gcaatgtaaa 4920
aagaaaattt atctagagag gaaaagaagt tgaggagtat aaatgaagat ctatttagac 4980
acaaattacc caaaattgcg tggtcctgat agacccattg attgatgcag tgattgggtg 5040
atacctttct ccccaggcat ccccagtctt gaggctcttc ctggcttaga ccctatctct 5100
tcccatcctc acagggtcca tccttctgaa ctcagcatct gagctgtacc tggccactac 5160
tcacttgtct aagcttattg tctcctccag ggcctacatc tgtcatctca gtcaataggc 5220
atgattacaa tttatatata taatatatat acacatatat tatatataat ataaattcac 5280
atacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acaagcccaa 5340
gctgacctca gccctctgag gtcccaacac actgctagcc ccttacccag acgttacagg 5400
cccctgtggt catggtccac catgttcttt ctagtgtcaa ggcctggaaa ttctgtgcag 5460
ggctgggcac agtcttcata ggtactaggg agagacaaga tggtgataga ggtcctctgg 5520
aggatgtgag tacagagtac agagctgtgg aaaggtgaag gtgaaggtga gaggaaggag 5580
aacaaacgac agtttcctga cgtgacaggt agttgagccc ttaaaatgtg gctccgtgat 5640
aaaggactgc aatcctcact tttactactg caatcacttt cactaactgc aaaagggctg 5700
aaggaagcaa gctccaggca aaggagcgaa gagcgcctct cactgtgcat atgcaaatct 5760
acacgggcgt ctgcatgcac acgcatgttc acatgtggat atatgcatga gcatgtgcgt 5820
cttgtggtag gccttgtgtg cagcactcct cggcggccat cacatggtga gggctggtat 5880
gtgctctaag tgtgtgtaca gagcagcagg gaagggggac aacaaagaga gcattgtatc 5940
acactctgaa cccaagccct cctttccgct gacatcattg ccgccttaaa tacagatgcc 6000
aggccctgtt cccaagaccc tcactgtccc ctgtgtgcta acacagctct gctgtgtgga 6060
cttcccgttc atctttatgg ggaagactat cctcctggag ccgatgtttc catcaaatcc 6120
aagtagaaaa aatctacagg gaaagaaggt ttggttttga ttttttactc ttg 6173
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213> Rattus norvegicus
<400>6
caataccaga cgcacagcat 20
<210>7
<211> 16
<212>DNA
<213> Rattus norvegicus
<400>7
cgtcgccgtc cagctc 16
<210>8
<211> 20
<212> DNA
<213>Rattus norvegicus
<400> 8
ggggcaaagt tttcagggtg 20
<210>9
<211> 20
<212> DNA
<213>Rattus norvegicus
<400> 9
gtggggtcct gtcctttctg 20
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>10
gctgttgaca gtgagcgcct cgg 23
<210>11
<211> 870
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 11
caataccaga cgcacagcat yycacgggca aactcgcacg cacttcaaat cccggaccac 60
ccatacctca ggccagaatc ctaatggtgt atcactcttc catgatgtag acctgaggcc 120
tggcgaggtg ttgcctatgg gtcctgagag gctcagggac tctcaaaagg atccagaggg 180
agggaacagg gactgagtca tggaggacca ggtttctccc tggtcaagca tggaggggta 240
gttggcttct ccccatctct tgcccaaaga aacaagtgat ttgatataga aggggccttt 300
tgaggctgga gtgccaccga ttgcatatct gggggatcga ttctagattc gagtttacca 360
ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga 420
gaaaagtgaa agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt 480
ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt 540
gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag 600
tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagctc ggtacccggg 660
tcgaggtagg cgtgtacggt gggaggccta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca 720
gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc 780
cgtcgagctt gcgttggatc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 840
cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgyy 870
<210>12
<211>904
<212>DNA
<213> Rattus norvegicus
<400>12
ggggcaaagt tttcagggtg yyttgtttag aatgggaaga tgtcccttgt atcaccatgg 60
accctcatga taattttgtt tctttcactt tctactctgt tgacaaccat tgtctcctct 120
tattttcttt tcattttctg taactttttc gttaaacttt agcttgcatt tgtaacgaat 180
ttttaaattc acttttgttt atttgtcaga ttgtaagtac tttctctaat cacttttttt 240
tcaaggcaat cagggtatat tatattgtac ttcagcacag ttttagagaa caattgttat 300
aattaaatga taaggtagaa tatttctgca tataaattct ggctggcgtg gaaatattct 360
tattggtaga aacaactaca ccctggtcat catcctgcct ttctctttat ggttacaatg 420
atatacactg tttgagatga ggataaaata ctctgagtcc aaaccgggcc cctctgctaa 480
ccatgttcat gccttcttct ctttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct 540
gtctcatcat tttggcaaag gattcactcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt 600
ggctggtgtg gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatcgttttc cctctgccaa 660
aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt 720
tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt ctcgatcgct agtacgaccg taagaatgtt 780
ctgaggtcac tcttgctctc accagaggga ggtgcccagc tcccaaaggg atctcctggg 840
ggctcttaga gagctgtggt gaaggaactt ccagtgtgtc accagaaagg acaggacccc 900
acyy 904

Claims (14)

1.一种建立创始人敲入鼠株的方法，包括：
a.用具有启动子和miRNA主链的核苷酸序列创建创始人鼠株；以及
b.使用创始人鼠株敲入可变的shRNA序列，以生产后续的鼠株。
2.如权利要求1所述的方法，其中创建所述创始人鼠株包括使用基因组编辑******用于每个后续RNAi鼠株的共同序列；以及其中使用创始人鼠株敲入可变的shRNA序列包括产生随后的带有靶向内源基因的shRNA的鼠株；以及通过将试剂转导到胚胎或细胞中来产生每种鼠株。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸序列进一步包含报道子序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基因编辑***选自由CRISPR/Cas9***、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)组成的群组。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9***包括一个Cas9蛋白、一个gRNA和一个供体模板。
6.如权利要求4所述的方法，其中驱动基于miRNA的shRNA表达的启动子选自一个群组，群组包括：tet诱导型Pol III人或鼠U6和H1***、巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子、人类β肌动蛋白启动子、大鼠和小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)中存在的糖皮质激素诱导型启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV LTR)的长末端重复序列、SV40早期或晚期区域启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)3'长末端重复序列中包含的启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子/增强子、单纯疱疹病毒LAT启动子、多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物启动子(例如免疫球蛋白启动子)和热休克启动子，但前提是这类启动子与宿主细胞***和诱导***(如Tet启动子)兼容。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述胚胎或细胞来自大鼠物种。
8.一种用于产生RNAi大鼠的***，包括：
a.产生第一创始人鼠株，其中所述第一个创始人鼠株包括由一个启动子和
一个主链miRNA***组成的核苷酸序列；以及
b.使用第一个创始人鼠株并并入一段shRNA靶向序列。
9.如权利要求8所述的***，其中所述启动子是一段TRE序列。
10.如权利要求8所述的***，其中所述的核苷酸序列还包括一段报告子序列。
11.如权利要求10所述的***，其中所述报告子序列选自一个群组，群组包括：任何荧光报告子，例如绿色荧光蛋白(GFP)和GFP的衍生物，红色荧光蛋白(RFP)和RFP的衍生物，黄色荧光报告子(YFP)，乙酰羟酸合酶(AHAS)，碱性磷酸酶(AP)，β半乳糖苷酶(LacZ)，β葡糖苷酸酶(GUS)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，辣根过氧化物酶(HRP)，萤光素酶(Luc)，胭脂碱合酶(NOS))，章鱼碱合酶(OCS)以及它们的衍生物。可获得多种选择标记物，这些标记物对氨苄青霉素，博来霉素，氯霉素，庆大霉素，潮霉素，卡那霉素，林可霉素，甲氨蝶呤，膦丝菌素，嘌呤霉素和四环素赋予抗性。
12.如权利要求8所述的***，其中所述miRNA***包含一段UTS序列。
13.如权利要求8所述的***，其中所述shRNA靶向序列是靶向一个内源基因。
14.如权利要求13所述的***，其中所述启动子选自一个群组，群组包括：Pol
III人或鼠U6和H1***，巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子，人β肌动蛋白启动子，存在于大鼠和小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)的糖皮质激素诱导型启动子，莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV LTR)的长末端重复序列，SV40早期或晚期区域启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)的3'长末端重复序列中包含的启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子/增强子，单纯疱疹病毒LAT启动子，多瘤病毒，鸡痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛***瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40
(SV40)，来自异源哺乳动物启动子(例如免疫球蛋白启动子)和来自热休克启动子，但前提是这些启动子与宿主细胞***与诱导***(例如Tet启动子)相容。
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