CN116693585A - 一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其应用 - Google Patents

一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从陈皮中制备槲皮素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的方法及其应用，方法包括以下步骤：(1)以陈皮作为原料，经过有机液浸提后，合并浸提液，旋转蒸干溶剂，得到有机层提取物AE；(2)将有机层提取物AE过柱分离纯化，为组分AE‑3；(3)将组分AE‑3再次分离纯化，为组分AE‑3‑10；(4)进行胰脂肪酶活性抑制实验。本发明制备过程简单易操作；所得的槲皮素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷为首次从陈皮中提取、分离纯化得到，并发现具有抑制胰脂肪酶活性，可制成降高血脂功能性食品，为降血脂的防治提供了新的来源，对于药食同源的中药材天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

Description

一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及活性药物技术领域，具体涉及一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其应用。
背景技术
陈皮为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)，呈若干瓣或不规则片状，约2～3mm厚，外皮表面为红褐色，有细小的褶皱和凹状油室；气微香；味苦、辛，性温。现代药理学研究表明陈皮具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、促消化、祛痰、保肝、降血压和神经保护等多种药理作用。近年来，陈皮作为首批药食同源的原料之一，其药用价值在临床上的应用日益明显。陈皮的成分构成和药理活性使其具有很好的开发和应用价值，近年来相关产业也发展迅速。
槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷是槲皮素的葡萄糖结合衍生物，黄酮是一种广泛存在于植物的次级代谢产物，是指含有酚羟基的两个苯环通过中间的三碳原子(C6-C3-C6)连结而成的一类化合物。天然黄酮类化合物常与葡萄糖、鼠李糖、芸香糖连接形成黄酮苷类化合物，糖取代位置主要是C-3、C-7、C-3'和C-4'。研究表明，黄酮具有很强的抗氧化活性，可有效清除体内的氧自由基，对高血脂症、糖尿病、肿瘤的治疗均有良好的作用。
高脂血症是一种脂质代谢异常导致血清中一种或多种脂质水平高于正常水平的慢性疾病，常见症状为血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平过高，或高密度脂蛋白胆固醇水平过低，现代医学称为血脂异常。高脂血症可导致一些严重的心血管疾病，如冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等，这些疾病每年导致世界上数百万人死亡。越来越多的证据表明，植物黄酮类物质可能是预防和管理高脂血症及其并发症的一种有前途的策略。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及应用，该方法能够对陈皮进行充分回收利用，避免浪费，操作简单，所得的槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷为首次从陈皮中提取、分离纯化得到，并发现该化合物能够有效抑制胰脂肪酶活性，对降血脂功能性食品的研发具有重要的应用价值。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)以陈皮作为原料，经过有机液浸提后，合并浸提液，旋转蒸干溶剂，得到有机层提取物AE；
(2)将有机层提取物AE溶解，然后过柱分离纯化，等度洗脱，收集组分，为组分AE-3；
(3)将组分AE-3再次溶解在甲醇内，用Sephadex LH-20分离纯化，流速设置为0.25mL/min，甲醇做洗脱剂，收集第1920～1992min组分，为组分AE-3-10；将组分AE-3-10经核磁鉴定为含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷；
(4)将提取物AE-3-10作为样品进行胰脂肪酶活性抑制实验，检测对于胰脂肪酶活性的抑制率。
优选地，第(1)步中，浸提是用乙酸乙酯浸泡，并用超声辅助加速浸提，超声频率是20-50kHz，重复浸提3次。
优选地，第(2)步中，溶解使用的是质量分数为50％的甲醇水溶液，分离纯化使用的是中低压反相C18柱，过柱流速设置30mL/min，洗脱使用的是质量分数为30％的甲醇水溶液，收集的组分为第38～63min的组分。
优选地，第(4)步中，胰脂肪酶活性抑制实验的所需溶剂包括：10mg/mL胰脂肪酶、0.8mM p-NPP溶液、1mg/mL奥利司他溶液和样品溶液。
优选地，第(4)步中，胰脂肪酶活性抑制实验的过程包括：
S1.将40μL Tris-HCl缓冲液，20μL样品溶液，60μL的10mg/mL胰脂肪酶依次加入96孔板中，震荡混匀，在37℃下孵育10min；
S2.孵育结束后加入80μL的0.8mM p-NPP底物以启动反应，震荡混匀，在37℃下孵育30min；
S3.然后在405nm下检测样品孔的吸光度；
S4.空白对照组Tris-HCl缓冲液代替样品和胰脂肪酶；在完全反应组中，用Tris-HCl缓冲液代替样品；样品对照组用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶；奥利司他作为阳性对照；
S5.样品组的胰脂肪酶活抑制率计算公式如下式1：
式中，C1为空白对照组；C2为完全反应组；C3为样品反应组；C4为样品对照组。
优选地，第(4)步中，异槲皮苷抑制胰脂肪酶的IC50值为0.10±0.01μg/mL。
第二方面，本发明提供一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，针对化合物AE-3-10的核磁数据进行比对，推测化合物AE-3-10中含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，分子式：C21H20O12；相对分子量：464.3763；结构如下：
第三方面，本发明提供一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷应用于防治高尿酸血症的功能性食品中。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及应用，该方法以陈皮为原料进行分离，原料易得，能够对陈皮进行充分回收利用，避免浪费；制备过程简单易操作；所得的槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷为首次从陈皮中提取、分离纯化得到，并发现具有抑制胰脂肪酶活性，可制成降高血脂功能性食品，为降血脂的防治提供了新的来源，对于药食同源的中药材天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。
2、本发明对于使用陈皮作为原料提取槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的步骤中进行了优化处理，相比较于传统的先醇沉水提或是水沉醇提法，再有机提取的方式，本发明直接使用有机液进行一次浸提，有机液使用的是乙酸乙酯，同时加以超声辅助，这样相比较于传统的醇沉水提或是水沉醇提法不仅提取方式更简便且更容易得到所需的产物；在提取的过程中，洗脱是本发明比较重要的一部分，包括依次进行的两次洗脱，第一次洗脱是采用30％的甲醇水溶液作为洗脱液，控制洗脱速度(30mL/min)和收集洗脱产物的时间(38～63min)，第二次洗脱采用纯甲醇作为洗脱液，再次控制洗脱速度(0.25mL/min)和收集洗脱产物的时间(1920～1992min)，最终完成洗脱也得到了所需产物。
3、本发明最终追踪的槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷对胰脂肪酶的抑制能力在1μg/ml能够达到95％以上，明显高于奥利司他的表现，也比现有的传统方法提取得到的槲皮糖苷具有更好的表现，能够说明使用本发明的方法得到的含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的组分AE-3-10更适合用于对胰脂肪酶的抑制。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为根据本发明实施例的化合物AE-3-10槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的HPLC分析图；
图2为根据本发明实施例的化合物AE-3-10槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的1H-NMR图；
图3为根据本发明实施例的化合物AE-3-10槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的13C-NMR图；
图4为根据本发明实施例的化合物AE-3-10槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷对胰脂肪酶的抑制效果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例
一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及应用，包括以下步骤：
步骤1、取1000g的陈皮，于粉碎机粉碎，置于2L锥形瓶中，以10倍体积的乙酸乙酯浸泡并用超声加速浸提1h，重复浸提3次，合并浸提液，以旋转蒸发仪抽干溶剂，得到乙酸乙酯层提取物34.65g。
步骤2、取步骤1得到的乙酸乙酯层提取物(AE)34.65g，用50mL 50％甲醇水溶解，用中低压反相C18柱(填料为：YMC-GEL ODS-AQ-HG,s-50μm；柱长为4.5×35cm)，流速设置为30mL/min，用30％甲醇水溶液洗脱，收集第38～63min组分(AE-3)。
步骤3、取步骤2得到的(AE-3)1.12g用20mL 100％甲醇溶解，用Sephadex LH-20(2.5×170cm)，100％甲醇做洗脱剂，过柱流速为0.25mL/min，收集第1920～1992min组分(AE-3-10)，浓缩得到化合物约31.4mg。
本实施例制得的化合物AE-3-10为黄色粉末状，对其进行HPLC分析，HPLC参数如下：HPLC型号：Agilent 1260Infinity II；检测器：1260DAD WR；色谱柱：H&E-SP ODS-TA柱，4.6×250mm，s-5μm；液相条件：流动相：45％甲醇-55％水混合液，再加入0.1％的三氟乙酸；检测时间：20min；流速：1mL/min，柱温：35℃，进样量：20.0μL；检测波长：254nm。
结果如图1所示，图1为化合物AE-3-10在254nm检测波长下的高效液相色谱图，保留时间为7.182min。
对化合物AE-3-10进行核磁测定：用BrukerAvanceII-500核磁共振仪(Bruker，瑞士)记录了1H和13C核磁共振谱。1H和13C NMR的工作频率分别为500MHz和125MHz。样品用600μL CD3OD溶解，试验温度为300K。耦合常数(J)以Hz表示，化学位移以δ(ppm)表示，并以四甲基硅烷(TMS)作为内标物。结果如图2和图3。
1H-NMR(500MHz,CD3OD)数据如下：δ7.75(1H,d,J＝2.1Hz,H-2'),7.64(1H,dd,J＝8.5,2.1Hz,H-6'),6.88(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),6.71(1H,d,J＝2.1Hz,H-8),6.44(1H,d,J＝2.1Hz,H-6),5.06(1H,d,J＝7.5Hz,Glc H-1"),3.96(1H,dd,J＝12.2,2.1Hz,Glc H-6"a),3.75(1H,dd,J＝12.2,5.8Hz,Glc H-6"b),3.59-3.50(3H,m,Glc H-2",3",4"),3.44(1H,t,J＝9.0Hz,Glc H-5")。
13C-NMR(125MHz,CD3OD)数据如下：δ177.6(C-4),164.6(C-7),162.3(C-5),157.8(C-9),149.1(C-2),148.9(C-4'),146.4(C-3'),137.8(C-3),124.1(C-1'),122.0(C-6'),116.4(C-2'),116.3(C-5'),106.4(C-10),101.8(Glc,C-1"),100.3(C-6),95.7(C-8),78.5(Glc C-5"),78.1(Glc C-3"),74.90(Glc C-2"),71.44(Glc C-4"),62.6(Glc C-6")。
综合化合物AE-3-10的核磁数据及液相数据并与文献进行比对，推测化合物AE-3-10含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷；槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，英文名：Quercetin-7-O-β-D-glucoside；分子式：C21H20O12；相对分子量：464.3763；结构如下：
胰脂肪酶活抑制率的测定：
10mg/mL胰脂肪酶：精密称取胰脂肪酶0.0500g，用50mM Tris-HCl缓冲液溶解，并定容于50mL容量瓶，5000r/min离心10min，取上清，备用。
0.8mM p-NPP溶液：精密称取p-NPP粉末0.0151g，用50mM Tris-HCl缓冲液溶解，并定容于50mL容量瓶，置于4℃避光冷藏备用。
1mg/mL奥利司他溶液：精密称取0.0050g的奥利司他，用含有3％DMSO的50mMTris-HCl缓冲液溶解定容至5mL容量瓶，备用。
样品溶液：精密称取化合物AE-3-100.0050g，用DMSO溶解，并用PBS缓冲液进行稀释，控制DMSO浓度在3％以内，得到浓度1mg/mL的样品溶液。
根据上述方法控制加入量，从而得到不同浓度的别嘌呤醇和样品溶液。
胰脂肪酶的酶活试验方法：将40μL Tris-HCl缓冲液，20μL样品(AE-3-10)溶液，60μL的10mg/mL胰脂肪酶依次加入96孔板中，震荡混匀，在37℃下孵育10min。孵育结束后加入80μL的0.8mM p-NPP底物以启动反应，震荡混匀，在37℃下孵育30min。在405nm下检测样品孔的吸光度。空白对照组Tris-HCl缓冲液代替样品和胰脂肪酶。在完全反应组中，用Tris-HCl缓冲液代替样品。样品对照组用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶。奥利司他作为阳性对照。样品组的酶活抑制率计算公式如下(式1)。
式中，C1为空白对照组的吸光值；C2为完全反应组的吸光值；C3为样品反应组的吸光值；C4为样品对照组的吸光值。
检测不同浓度下本发明得到的槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(AE-3-10)和奥利司他对胰脂肪酶的抑制能力如表1所示，表1中，检测1、检测2和检测3为分别进行的三次平行实验。
表1不同浓度下奥利司他和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷对胰脂肪酶的抑制能力
表1和图4能够看出，在酶活性测定中，槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷有效的降低了胰脂肪酶的活性，其IC50值为0.10±0.01μg/mL，是阳性对照奥利司他(IC50值为0.37±0.02μg/mL)的0.27倍，这说明本发明制备的槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷可以有效地抑制胰脂肪酶的活性，可应用于防治高尿酸血症的功能性食品中。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以陈皮作为原料，经过有机液浸提后，合并浸提液，旋转蒸干溶剂，得到有机层提取物AE；
(2)将有机层提取物AE溶解，然后过柱分离纯化，等度洗脱，收集组分，为组分AE-3；
(3)将组分AE-3再次溶解在甲醇内，用Sephadex LH-20分离纯化，流速设置为0.25mL/min，甲醇做洗脱剂，收集第1920～1992min组分，为组分AE-3-10；将组分AE-3-10经核磁鉴定为含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷；
(4)将提取物AE-3-10作为样品进行胰脂肪酶活性抑制实验，检测对于胰脂肪酶活性的抑制率。
2.根据权利要求1所述的一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，第(1)步中，浸提是用乙酸乙酯浸泡，并用超声辅助加速浸提，超声频率是20-50kHz，重复浸提3次。
3.根据权利要求1所述的一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，第(2)步中，溶解使用的是质量分数为50％的甲醇水溶液，分离纯化使用的是中低压反相C18柱，过柱流速设置30mL/min，洗脱使用的是质量分数为30％的甲醇水溶液，收集的组分为第38～63min的组分。
4.根据权利要求1所述的一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，第(4)步中，胰脂肪酶活性抑制实验的所需溶剂包括：10mg/mL胰脂肪酶、0.8mM p-NPP溶液、1mg/mL奥利司他溶液和样品溶液。
5.根据权利要求1所述的一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，第(4)步中，胰脂肪酶活性抑制实验的过程包括：
S1.将40μL Tris-HCl缓冲液，20μL样品溶液，60μL的10mg/mL胰脂肪酶依次加入96孔板中，震荡混匀，在37℃下孵育10min；
S2.孵育结束后加入80μL的0.8mM p-NPP底物以启动反应，震荡混匀，在37℃下孵育30min；
S3.然后在405nm下检测样品孔的吸光度；
S4.空白对照组Tris-HCl缓冲液代替样品和胰脂肪酶；在完全反应组中，用Tris-HCl缓冲液代替样品；样品对照组用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶；奥利司他作为阳性对照；
S5.样品组的胰脂肪酶活抑制率计算公式如下：
式中，C1为空白对照组的吸光值；C2为完全反应组的吸光值；C3为样品反应组的吸光值；C4为样品对照组的吸光值。
6.根据权利要求1所述的一种从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，第(4)步中，异槲皮苷抑制胰脂肪酶的IC50值为0.10±0.01μg/mL。
7.一种权利要求1所述的从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于，针对化合物AE-3-10的核磁数据进行比对，推测化合物AE-3-10含有槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷；槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷，分子式：C21H20O12；相对分子量：464.3763；结构如下：
8.一种权利要求7所述的从陈皮中制备槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷应用于防治高尿酸血症的功能性食品中。
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