CN116688115B - 一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PD‑L1/TGF‑β双功能融合蛋白制剂及其用途。所述药物制剂含有PD‑L1/TGF‑β双功能融合蛋白、稳定剂、缓冲剂和表面活性剂。本发明的PD‑L1/TGF‑β双功能融合蛋白药物制剂非常稳定，经长时间保存、强光、高温后仍能够符合药学使用要求，有着广泛的应用前景。

Description

一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白制剂及其用途
技术领域
本发明属于抗体和融合蛋白制剂领域，具体的涉及一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白制剂及其用途。
技术背景
程序性死亡受体-1(Programmed death-1，PD-1)是T细胞上的一种跨膜蛋白，主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞与巨噬细胞表面，是T细胞增殖的负调节因子。与受体PD-L1、PD-L2结合后，能够抑制T细胞的功能，诱导凋亡。多种肿瘤细胞PD-L1表达上调，可与肿瘤浸润的淋巴细胞表面的PD-1相互作用，从而抑制淋巴细胞对肿瘤的杀伤，导致肿瘤发生免疫逃逸。利用抗PD-1、PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路，部分恢复T细胞的免疫杀伤功能，具有良好的临床应用价值。
转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)是一种多功能细胞因子，共有3个亚型，即TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3。TGF-β通过TGF-β/SMAD信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、上皮-间质转化、以及炎性反应调节等方面发挥重要作用。晚期癌症中，大量肿瘤细胞均过表达TGF-β，高水平的TGF-β阻断未成熟T细胞分化，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，加速肿瘤进展。TGF-β1还能直接阻止T细胞的分化，抑制T细胞和NK细胞杀伤癌细胞的功能。
尽管抗PD-1/PD-L1抗体药物在许多肿瘤等治疗中取得了显著的效果，然而其客观有效率(ORR)范围在10％-35％之间。ORR较低的原因可能与PD-1/PD-L1介导的免疫抑制机制外的其他肿瘤免疫逃逸有关，包括肿瘤内抑制性微环境(TGFβ，IL-10，VEGF等)。因此，开发PD-L1抗体和TGF-β受体的双功能融合蛋白药物，同时阻断PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ信号通路，协同产生杀伤肿瘤细胞的作用，从而进一步提高免疫治疗的响应率。
发明内容
发明人首先获得了一个靶向PD-L1和TGF-β受体的双功能融合蛋白。在获得双功能融合蛋白的基础上，进一步地对其制剂处方进行了大量摸索和研究，最终获得了一种针对该双功能融合蛋白最为适用的、且能稳定保存所述双功能融合蛋白的冻干制剂，该制剂能够充分防止双功能融合蛋白的聚集、降解、氧化或者变性等，从而保持其有效组分的生物学活性，适合于临床使用。进一步地，在得到双功能融合蛋白制剂的基础上，对该制剂的药物学功能做了深入研究，发现该制剂具有良好的抗肿瘤活性。
发明详述
1、术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。
本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“抗人PD-L1”的抗体指能够识别、结合来自于人的PD-L1分子的抗体。
本文所用的术语“抗体”，典型的指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。天然IgG抗体即具有这样的结构。每条轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每条重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区。
本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，对应的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以进一步分为不同的亚类，例如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。
在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，该恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分离，该铰链区是可变长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
术语“可变区”或“可变结构域”显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原的识别和结合。每个轻链/重链对应的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)结构域各包含具有极端变异性的三个区域，被称为高变区(HVR)，或更通常地，被称为互补决定区(CDR)，VH和VL各有4个骨架区FR，分别用FR1，FR2，FR3，FR4表示。因此，CDR和FR序列通常出现在重链可变结构域(或轻链可变结构域)的以下序列中：FRl-HCDR 1(LCDR 1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
术语“Fc”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。
如在此使用的，广义上的“抗体”的类型可包括如多克隆抗体(polyclonalantibodies)、单克隆抗体(monoclonal antibodies)、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、人类抗体(包括重组产生的人类抗体)、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)等等。
术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以是用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
需说明的是，本发明的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号***，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本发明的单抗序列为基础，包含任何命名***衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确的保持在本发明的范围内。
术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白中或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定部分特异性结合或反应的多肽片段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：可变轻链片段、可变重链片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)及由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体等。
术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的DNA可以是基因组或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ECD。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术等。
术语“双功能融合蛋白”是指能够结合两种不同特异性的目标蛋白的融合蛋白。本发明的双功能融合蛋白结合TGFβ和PD-L1。术语“双功能融合蛋白”还可以包括前缀，例如“TGFβ/PD-L1”或“PD-L1/TGFβ”，以指示其特异性的结合两种靶蛋白。本文所述的双功能融合蛋白的PD-L1的两个结合域中的每一个都是亲本抗PD-L1单克隆抗体的PD-L1抗原结合域(或“抗原结合位点”)。本文所述的双功能融合蛋白的TGFβ的两个结合域中的每一个都是衍生自TGFβ受体2蛋白(TGFβR2)的TGFβ结合域，并且也称为“陷阱”(或“TGFβ陷阱”)将结合域区分为源自受体的配体结合域，而不是源自抗体的抗原结合域。
术语“生物学活性”指抗体结合抗原并导致可测量的生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。
术语“药物制剂”或“制剂处方”，表示这样的制品：其存在形式允许活性成分的生物学活性有效，并且不含有对所述制剂要施用的受试者有毒的其他组分。
术语“溶液制剂”表示，在大气压下至少约2℃至约8℃的温度为液体的制剂。
术语“冻干剂”是指通过本领域所公知的冻干技术，制备的冻干剂。冻干剂施用于患者前，应使用水性重建成分重建。这个步骤允许冻干剂中的抗体和其他成分重新溶解，以得到适用于注射给患者的溶液。用于重建的水性物质体积决定了得到的药物组合物中抗体的浓度。用比冻干前体积小重建水性物质重建提供了比冻干前更加浓缩的组合物。重建系数(冻干后制剂的体积：冻干前制剂的体积)可以从1：0.5至1：6。本发明的冻干剂可重建，以得到具有抗PD-L1和TGF-β双特异的融合蛋白浓度至少50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL的水性组合物，并相应地选择重建成分的体积。如果需要，可在施用于患者前稀释重建的制剂，从而酌情递送预期剂量。
典型的用于冻干制剂的重建成分包括无菌水或缓冲液，任选地含有防腐剂。如果冻干剂包括缓冲剂，则重建成分可进一步包括缓冲剂(其可以是相同或不同的冻干剂的缓冲剂)，或者其也可以不包括缓冲剂(例如：注射用水、生理盐水或葡萄糖注射液)。
术语“聚集”的抗体或融合蛋白指的是这样一种抗体或融合蛋白，其已经被发现与其他抗体或融合蛋白分子一起聚集，特别是在冷冻和/或搅动之后。
术语“稳定的”制剂是这样的制剂，其中的蛋白质在保存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。在冷藏温度(2-8℃)保存至3个月、优选6个、更优选1年，甚至更优选的多达2年。另外在25℃的温度保存包括1个月、3个月、6个月或者在40℃保存30天的时段后表现出稳定。
稳定性的典型可接受标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的活性成分发生降解。通过视觉分析，药物制剂是淡黄色近无色澄明液体或者无色或者澄清至稍微乳白色，或淡黄色近无色澄明液体。所述制剂的浓度、pH具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％的截短，优选不超过5％的截短。通常形成不超多10％的聚集，优选不超过5％的聚集。
术语“缓冲剂”或“缓冲液”表示稳定药物制剂pH的药学上可接受的赋形剂。合适的缓冲剂是本领域公知的，且可以在文献中找到的。优选的药学上可接受的缓冲液包括但不限于：组氨酸缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、精氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或其混合物等等。缓冲液用本领域已知的酸或碱进行pH调节，可以将pH调至在4.0-6.0范围内的值，特别是调至在4.0-5.5范围内的值，最特别地是调至pH4.5。
术语“稳定剂”表示药学可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于糖，氨基酸，多元醇，环糊精等。
术语“表面活性剂”表示，用于保护蛋白制剂抵抗物理应力(如搅拌和剪切)的药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的表面活性剂包括：聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(例如在商标BrijTM下销售的那些)和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)。聚氧乙烯脱水山梨糖醇-脂肪酸酯包括聚山梨酯20(在商标吐温20TM下销售)和聚山梨酯80(在商标吐温80TM下销售)。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式：施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“药盒”包括有效量的一种或多种单位剂型的本发明的药物制剂或联合用药物。在一些实施方案中，药盒可含有治疗或预防性组合物的无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合于保持药物的材料制成。此外，药盒还包括将本发明的药物制剂或联合用药物给予个体的说明书。说明书中通常包含使用本发明的药物制剂或联合用药物来治疗或预防疾病的方法。
本发明工程化的抗体或其抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。
本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质细胞、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、***、神经组织、卵巢、胰腺、***、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、***器官，或组织或相应的细胞。肿瘤包括癌症，如肉瘤，癌，或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。本发明所述的肿瘤，可包括，但不限于白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、血管肉瘤、***内皮肉瘤，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、***癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、***和胶质瘤。
本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
2、发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定的适用于特定的抗人PD-L1抗体和TGF-β受体结合的双功能融合蛋白的制剂及其用途。
本发明提供一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的药物制剂，包含PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白和缓冲液，所述PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白由IgG1型的抗PD-L1抗体通过其Fc段的每一个C-末端与TGF-βRII胞外区的N端截短形式通过一个柔性linker连接而成，其中，PD-L1抗体的轻链序列如SEQ ID NO：1所示，重链与TGF-βRII胞外区的N端截短形式整体的序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述缓冲液选自醋酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和/或枸橼酸盐缓冲液。优选的为醋酸盐和/或枸橼酸盐。
优选的，所述的醋酸盐缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液；所述的枸橼酸缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
优选的，所述缓冲液的浓度为5mM至30mM，优选为10mM至25mM，最优选为大约25mM。
优选的，所述的双功能融合蛋白的浓度为30mg/ml至100mg/ml，优选为30mg/mL至70mg/mL，最优选为大约50mg/mL。
优选的，制剂中还包含有稳定剂，其中所述的稳定剂包含糖类、多元醇类、氯化钠、盐酸精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸中的一种或多种；优选的稳定剂为糖类和/或多元醇类，最优选的为糖类。
优选的，所述的糖类选自蔗糖和海藻糖；所述的多元醇类选择甘露醇、山梨醇和甘油；稳定剂优选为蔗糖和/或海藻糖，最优选的为蔗糖。
优选的，所述糖的浓度为50mg/mL至100mg/ml，优选为60mg/mL至90mg/mL，最优选为大约70mg/ml。
优选的，制剂中还包含有表面活性剂，优选表面活性剂为聚山梨醇酯，更优选的表面活性剂为聚山梨酯20。
优选的，所述表面活性剂浓度为0.2mg/mL至0.7mg/mL，优选为0.3mg/mL至0.6mg/mL，更为优选为大约0.5mg/mL。
优选的，所述制剂的pH为4.0至7.0，优选的pH为4.0至5.5，更为优选的pH为4.2至4.8。
优选的，所述制剂包含蔗糖、枸橼酸-枸橼酸钠、聚山梨酯20中的任意两种或三种。
本发明还提供一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的药物制剂，其包含30-100mg/ml双功能融合蛋白，50-100mg/ml蔗糖，0.2-0.7mg/ml聚山梨酯20，5-30mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值4-7。
本发明还提供一种含有PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的冻干制剂，所述冻干制剂通过本发明所述的药物制剂经冷冻干燥所得。
本发明还提供一种含有PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的冻干制剂，所述冻干制剂经复溶后可形成如本发明所述的药物制剂。
本发明还提供一种产品，其包括容器，所述容器中包含如本发明所述的药物制剂，或如本发明所述的冻干制剂。
本发明还提供本发明所述的制剂在用于制备治疗或抑制肿瘤细胞增殖或肿瘤细胞转移相关的疾病或病症，所述疾病或病症优选的为肿瘤或癌症，所述肿瘤或癌症选自肺癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、***、膀胱癌、食道癌、胰腺癌和头颈肿瘤。
本发明所述的抗人PD-L1抗体和TGF-β受体结合的双功能融合蛋白的药物制剂，具有以下有益效果：该制剂非常稳定，经长时间保存、强光、高温后仍能够符合药学使用要求，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1：双功能融合蛋白结构示意图。
图2：双功能融合蛋白等电点示意图。
图3：双功能融合蛋白不同pH条件下的物理稳定性。
图4：双功能融合蛋白不同pH条件下的化学稳定性。
图5：双功能融合蛋白不同保护剂处方的pH。
图6：双功能融合蛋白不同保护剂处方中的稳定性。
图7：双功能融合蛋白不同蔗糖保护剂处方中的稳定性。
图8：双功能融合蛋白不同缓冲盐中的稳定性。
图9：双功能融合蛋白不同缓冲盐中的pH。
图10：双功能融合蛋白液体制剂条件下的SEC稳定性。
图11：双功能融合蛋白液体制剂条件下的非还原CE-SDS稳定性。
图12：双功能融合蛋白液体制剂条件下的iCIEF稳定性。
图13：双功能融合蛋白冻干制剂长期和加速条件下的SEC稳定性。
图14：双功能融合蛋白冻干制剂长期和加速条件下的非还原CE-SDS稳定性。
图15：双功能融合蛋白冻干制剂长期和加速条件下的iCIEF稳定性。
图16：双功能融合蛋白冻干制剂高温条件下的稳定性。
图17：双功能融合蛋白冻干制剂光照条件下的稳定性。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明。在本发明的基础上改变制剂组成成分的浓度或加入其它一些物质，但对双功能融合蛋白的稳定性没有显著影响的改变，仍被视为本发明的一部分。
电荷异质性(iCIEF)
采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法来检测本品样品的电荷异质性和等电点。毛细管为100μm内径FC涂层熔融石英毛细管，有效分离长度5cm；样品处理时分别加入终浓度为2.0％的GE pharmalyte 3-10、2.0％的GE pharmalyte 5-8、0.35％的羟丙基甲基纤维素，4mol/L尿素，样品终浓度2mg/ml；聚焦分离电压和时间为1.5kV-1min，3kV-9min。以MarkerpI值计算目标峰的pI值。
分子排阻层析(SEC)
使用分子大小排阻层析来量化聚合体、单体和片段。这种测定利用TOSOH TSK gelG3000SWXL(7.8×300mm，5μm)柱并在Waters e2695-2489 HPLC或Arc HPLC***上运行。流动相为50mM磷酸盐，300mM氯化钠缓冲液，pH6.8。样品进样量为50μg蛋白，以0.5mL/min的流速将蛋白质等度洗脱30min，于280nm检测洗脱物的吸光度。利用Empower 3软件进行积分处理。
毛细管电泳(CE-SDS)
通过非还原CE-SDS(nrCE)和还原CE-SDS(rCE)分别测定主峰和(LC+HC)纯度，将这一测定在BECKMAN COULTER PA800 plus毛细管电泳***上以50μm I.D.非涂层石英毛细管进行，毛细管有效分离长度20cm(全长30.2cm)，PDA220nm带宽10nm检测。
以下列举具体实施例来阐明本发明，应理解这些例子仅仅是为了说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1PD-L1/TGFβ双功能融合蛋白的结构和序列信息
该PD-L1/TGFβ融合蛋白，由IgG1型的抗PD-L1单抗通过其Fc段的C-末端与TGF-βRII胞外通过一个柔性linker连接。其结构如图1所示。
其中，PD-L1抗体的轻链序列如SEQ ID NO：1所示，重链与TGFβRII受体整体的序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2PD-L1/TGF β双功能融合蛋白的制备
PD-L1/TGFβ双功能融合蛋白是CHO细胞表达的双功能融合蛋白。细胞发酵收获液经碟片离心+深层过滤+除菌过滤的处理方式后进行纯化。纯化步骤包括经过亲和层析及低pH病毒灭活、阳离子层析、UF/DF，去除蛋白聚集体、碎片和HCP、DNA和ProA等杂质，最终获得融合蛋白原液。
实施例3最适pH范围筛选
由于融合蛋白的等电点范围大约在5.7～6.9，见图2。取蛋白原液，将溶液分成两份，分别用1MHCl和1MNaOH调节至不同pH值，根据中国药典0902澄清度检查法，第二浊法浊度仪法，检测不同pH样品的浊度。试验结果见图3所示：蛋白溶液在等电点的范围内易出现极度浑浊的等电点沉淀现象。由此，想要获得澄清度较好的溶液(以3号浊度标准液约24NTU为界限)，需要的pH范围为≤pH4.5。
从上述实验中，另制备一批pH4.0～pH8.5的样品，进行化学稳定性考察，分析SEC、非还原CE-SDS纯度。试验结果如图4所示：在不同pH值的溶液中，蛋白表现出随pH值增加而聚集体明显增加的趋势，最佳的pH值在SEC结果中为pH4.5，过低的pH值聚集体也会表现出略微增加。在非还原CE-SDS结果中，各pH值样品碎片含量差别不显著，可以看到在低pH(3.93)和高pH(7.91～8.51)值溶液中，杂质比例略高，而其他样品之间没有显著差异。因此，综合上述两步试验结果，初步确定pH为pH4.5作为后续处方开发的基础。
实施例4保护剂种类和用量筛选
在pH筛选之后，首先开展了保护剂种类筛选，处方设计：以25mM醋酸-醋酸钠，pH4.5作为缓冲体系，双功能融合蛋白浓度50mg/ml，聚山梨酯800.5mg/ml基础上，采用不同保护进行考察，制剂处方如下表1：
表1双功能融合蛋白不同保护剂的制剂处方
上述处方pH检测结果显示，见图5所示，各样品均在不同程度的pH偏移(偏移程度大于0.1)，此可能由于醋酸缓冲盐在该制剂条件下的缓冲能力不足导致。对上述处方样品进行40℃高温稳定性考察，结果显示，40℃高温考察28天，如图6所示，保护剂在相同用量条件下，各处方样品聚集体含量呈上升趋势。其中甘露醇和甘氨酸保护剂样品中，聚集体变化最大且与不添加保护对照样品趋势一致，说明甘露醇和甘氨酸未起到稳定蛋白单体的作用。蔗糖、海藻糖、山梨醇保护剂样品聚集体含量变化最少，且聚集体含量最低，其中蔗糖保护剂样品最佳，因此选用蔗糖作为较优选的的保护剂。进一步进行蔗糖保护剂用量考察，结果见图7所示随着蔗糖用量增加，SEC纯度呈现单调增加的趋势。注射剂等渗范围为285～315mOsm/kg，表3所示为无蛋白空白处方溶液渗透压，加入双功能融合蛋白后，渗透压会略微增加，因此参考等渗条件，选择最高蔗糖浓度，确定7％蔗糖浓度为最适用量。
表2双功能融合蛋白不同保护剂浓度考察的制剂处方
表3双功能融合处方溶液渗透压测定
缓冲溶液 蔗糖浓度 渗透压(mOsm/kg)
25mM枸橼酸盐，pH4.5 50mg/ml 218
25mM枸橼酸盐，pH4.5 60mg/ml 252
25mM枸橼酸盐，pH4.5 70mg/ml 282
25mM枸橼酸盐，pH4.5 80mg/ml 314
实施例5缓冲盐种类筛选
确定最适pH条件基础上，进行了缓冲盐种类筛选。因最适pH条件为pH4.5，在此基础上，考察缓冲盐种类为醋酸-醋酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、酒石酸-NaOH和枸橼酸-枸橼酸钠。考察处方设计如下表4所示，以蔗糖作为稳定剂，0.5mg/mL的聚山梨酯80作为表面活性剂，蛋白浓度为50mg/mL。
表4双功能融合不同缓冲液的制剂处方
对上述处方样品进行40℃高温考察，结果如图8所示，在枸橼酸和醋酸缓冲体系中，聚集体的稳定性较好，其中枸橼酸缓冲体系中最佳。由于前述筛选中存在pH偏移较大问题，进而对不同缓冲盐浓度样品进行pH检测，结果如图9所示，不同缓冲盐体系样品间，在pH4.5条件下存在不同程度的pH偏移，其中醋酸、琥珀酸、酒石酸缓冲体系pH偏移较大(0.24～0.31)，说明其在该制剂条件下，缓冲能力较差。而枸橼酸缓体系样品pH偏移可控制在0.1以内，说明其在该制剂条件下缓冲能力较好。综合以上实验结果，确定枸橼酸缓冲体系为优选的缓冲体系。
实施例6表面活性剂种类和用量筛选
确定最适pH条件、缓冲盐种类和保护剂种类基础上，表面活性剂种类和用量筛选。在25mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH4.5，50mg/ml蔗糖基础上，考察聚山梨酯80、聚山梨酯20表面活性剂种类，考察浓度范围0.1～0.5mg/ml，处方设计见下表5所示。
表5双功能融合不同缓冲液的制剂处方
对上述样品进行了pH、SEC、非还原CE-SDS等分析，实验结果如下表6所示：
表6双功能融合蛋白不同表面活性剂种类和用量试验结果
上述结果表明，在不同表面活性剂中，未见各处方在SEC、非还原CE-SDS纯度各方面存在明显差异。但是在MFI检测不溶性颗粒测定结果中，聚山梨酯20处方的不溶性微粒(10μm以上微粒)整体表现出比聚山梨酯80处方更少的不溶性颗粒的数量。未见聚山梨酯20各用量之间有显著性差异。但考虑到大分子生物制剂较容易在原液制备、纯化、储存等过程中出现不稳定性的颗粒形成现象，因此选用较高浓度表现活性剂用量，以保证双功能融合蛋白的稳定性。
实施例7稳定性
根据上述实验结果，确定最优制剂组成为50mg/ml双功能融合蛋白，70mg/ml蔗糖，0.5mg/ml聚山梨酯20，25mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值4.5。对上述最优选制剂进行稳定性研究。包括：强制条件试验(高温试验、强光照射试验、)、加速试验、长期试验。稳定性研究中样品放置方式为正置；长期、加速、高温分别考察了液体和冻干样品，冻融考察了液体样品，光照考察了冻干样品，光照试验样品除去外包装及瓶签进行。各考察条件如下表7所述：
表7双功能融合蛋白各稳定性实验考察条件
所用的冻干循环见下表8所述：
表8双功能融合冻干循环参数
阶段 搁板温度 变温速度(℃/min) 维持时间(min) 真空度(mbar)
预冻 -45℃ 1 120 /
一级干燥 -15℃ 1 1800-3000 0.133
二级干燥 30℃ 0.2 120-240 0.133
加塞 30℃ / / 690-790
稳定性考察结果显示液体状态下在长期(-40℃)和加速条件下(2-8℃)SEC、非还原CE-SDS和iCIEF纯度在18个月考察期内稳定，在高温条件下(25℃)，SEC、非还原CE-SDS和iCIEF纯度呈下降趋势，其中非还原CE-SDS和iCIEF下降较为明显，见图10-图12。说明液体状态下，在低温条件下稳定性较好。冻干状态下长期(2-8℃)、加速(25℃)、高温(40℃)和光照条件下，SEC、非还原CE-SDS和iCIEF纯度均稳定，其中长期条件下可稳定保存18个月，见图13-图17。上述结果证明该双功能融合蛋白在拟定条件(2～8℃)下是比较稳定的。为获得更好的稳定性，应以冻干制剂为主要形式。
实施例8PD-L1/TGF β双功能融合蛋白的活性评价
根据上述结果，对实施例7中的最优制剂的双功能融合蛋白进行结合活性的评估。采用ELISA法，测定本品与TGF-β和PD-L1蛋白的结合能力。首先将人TGFβ1蛋白包被在96孔板上，然后加入梯度稀释的本品，再加入固定浓度的生物素标记的PD-L1蛋白。本品一端与TGF-β1蛋白结合，另一端与生物素标记的PD-L1蛋白结合，利用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行显色，从而对本品与TGF-β1和PD-L1蛋白的结合能力进行检测。试验数据采用SoftMax Pro进行四参数拟合分析，绘制曲线并计算获得EC50值，结果如表9所示。结果显示，PD-L1/TGFβ双功能融合蛋白与TGF-β和PD-L1蛋白都有良好的结合活性。
表9PD-L1/TGFβ双功能融合蛋白结合活性结果
样品名称 EC50值(ng/mL)
PD-L1/TGFβ双功能融合蛋白 0.0303

Claims (24)

1.一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的药物制剂，其特征在于，包含如下：
(1)PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白，所述PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白由IgG1型的抗PD-L1抗体通过其Fc段的每一个C-末端与TGF-βRII胞外区的N端截短形式通过一个柔性linker连接而成，其中，PD-L1抗体的轻链序列如SEQ ID NO:1所示，重链与TGF-βRII胞外区的N端截短形式整体的序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)缓冲液，所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液；
(3)稳定剂，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、山梨醇；
(4)表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80；
所述药物制剂的pH为4.0至4.5。
2.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述双功能融合蛋白的浓度为30mg/ml至100mg/ml。
3.如权利要求2所述的药物制剂，其中所述双功能融合蛋白的浓度为30mg/mL至70mg/mL。
4.如权利要求3所述的药物制剂，其中所述双功能融合蛋白的浓度为50mg/mL。
5.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述缓冲液为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
6.如权利要求5所述的药物制剂，其中所述枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的浓度为5mM至30mM。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的浓度为10mM至25mM。
8.如权利要求7所述的药物制剂，其中所述枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的浓度为25mM。
9.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述稳定剂为蔗糖。
10.如权利要求9所述的药物制剂，其中所述蔗糖的浓度为50mg/mL至100mg/ml。
11.如权利要求10所述的药物制剂，其中所述蔗糖的浓度为60mg/mL至90mg/mL。
12.如权利要求11所述的药物制剂，其中所述蔗糖的浓度为70mg/ml。
13.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨酯20。
14.如权利要求13所述的药物制剂，其中所述聚山梨酯20的浓度为0.2mg/mL至0.7mg/mL。
15.如权利要求14所述的药物制剂，其中所述聚山梨酯20的浓度为0.3mg/mL至0.6mg/mL。
16.如要求要求15所述的药物制剂，其中所述聚山梨酯20的浓度为0.5mg/mL。
17.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述药物制剂的pH为4.2至4.5。
18.如权利要求1-17任一所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含蔗糖、枸橼酸-枸橼酸钠、聚山梨酯20中的任意两种或三种。
19.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于：其包含30-100mg/ml双功能融合蛋白，50-100mg/ml蔗糖，0.2-0.7mg/ml聚山梨酯20，5-30mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值4.0-4.5。
20.一种含有PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的冻干制剂，所述冻干制剂通过将权利要求1-19中任一项所述的药物制剂经冷冻干燥所得。
21.一种含有PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白的冻干制剂，所述冻干制剂经复溶后可形成如权利要求1-19中任一项所述的药物制剂。
22.一种产品，其包括容器，所述容器中包含如权利要求1-19中任一所述的药物制剂，或如权利要求20-21任一项所述的冻干制剂。
23.权利要求1-19任一项所述的制剂、权利要求20-21任一项所述的冻干制剂、权利要求22所述的产品在用于制备治疗或抑制肿瘤细胞增殖或肿瘤细胞转移相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症为肿瘤或癌症。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述肿瘤或癌症选自肺癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、***、膀胱癌、食道癌、胰腺癌和头颈肿瘤。
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