CN116688019B - 一种改善便隐血与肠道屏障、调节肠道菌群的荔枝发酵物 - Google Patents
一种改善便隐血与肠道屏障、调节肠道菌群的荔枝发酵物 Download PDFInfo
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Abstract
提供了一种改善便隐血与肠道屏障、调节肠道菌群的荔枝发酵物。提供了荔枝发酵物在受试者中维持炎症因子稳态,恢复肠道屏障结构功能和改善肠道菌群失调或促进短链脂肪酸的生成,特别是支链脂肪酸的用途,其中肠道菌群失调是由DDS和致病性大肠杆菌AIEC引起的肠道菌群失调。与药物相比,荔枝发酵物具有更高的安全性,是一种改善肠炎的食源性策略。
Description
技术领域
本发明属于食品领域,具体涉及一种改善黏附侵袭性大肠杆菌对肠道健康的不利影响的荔枝发酵物。
背景技术
肠道疾病包括炎症性肠病、肠易激综合征、慢性便秘等。临床上主要采用药物来缓解和治疗炎症性肠病,但长期服用药物会不可避免地对机体产生一定的毒副作用。与药物相比,食源性物质具有更高的安全性,因此,通过食源性物质缓解、改善炎症性肠病正成为一种新的策略。
肠道疾病的发生与肠道菌群失调有关。与炎症性肠病相关的肠道菌群失调表现为特定细菌的大量繁殖,其中黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)是近几年广受关注的一种致病菌,被认为是炎症性肠病个体中最活跃的致病菌之一。AIEC能够黏附在肠黏膜上皮细胞、定殖在肠粘膜中,并进入固有层及派尔***中与免疫细胞反应,从而促进炎症反应;同时可破坏肠上皮的屏障通透性和完整性,增加炎症因子的释放。
虽然有较多功能食品或成分被用于改善肠道炎症,但目前尚无通过食源性物质干预AIEC作用的研究报道。鉴于此,本领域需要干预AIEC作用的功能食品或成分。
发明内容
发明人在过去的工作中发现荔枝发酵物在体外细胞实验中表现出参与免疫调节的功能,在巨噬细胞RAW264.7的炎症模型实验中具有抑制一氧化氮(NO)释放量的能力,进而推测其具有抗炎效果。但是,这些实验研究都是基于发明人的体外研究。由于荔枝发酵物在进入人体后会经历诸如消化、代谢等的一系列反应,一些研究表明在体外具有抗炎效果的物质,在体内没有良好的抗炎效果或者没有抗炎效果。
发明人在葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)和黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)诱导的小鼠肠道炎症模型中对荔枝发酵物的体内功效进行研究,发现荔枝发酵物在肠道炎症模型中具有以下功效:1)降低促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量,抑制肠道炎症;2)减少DSS和AIEC 对结肠组织的损伤,修复肠道组织结构;上调肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-2的基因表达量,恢复肠道上皮的紧密连接,维持肠道的物理屏障完整性;3)调节肠道菌群结构,增加有益菌属的丰度,降低有害菌属的丰度,改善肠道菌群的紊乱,增加有机酸含量,发挥益生作用,维持肠道稳态。发明人通过疾病动物模型证明了荔枝发酵物能通过降低促炎因子水平来减缓肠道炎症,并且能够改善由DSS和AIEC共同造成的肠道菌群紊乱或失调,或者可以用于在正常受试者中阻断或消除由致炎性物质诸如DSS和/或致病菌诸如致病性大肠杆菌(诸如AIEC)引起的不利影响(包括肠道菌群紊乱或失调)。发明人还发现了荔枝发酵物可以在肠道中增加有益菌的丰度和/或减少有害菌的丰度,从而可以维持或提升肠道健康。
本发明提供一种改善AIEC(或其定殖)对肠道健康的不利影响的荔枝发酵物,可缓解肠道炎症、修复肠道屏障。
在一方面,本发明提供了荔枝发酵物在制备用于在受试者中改善肠道菌群失调、有益于炎症反应抑制、改善便隐血、促进肠屏障结构功能恢复或促进支链脂肪酸的生成的组合物中的用途。
在一个实施方案中,受试者受黏附侵袭性大肠杆菌和葡聚糖硫酸钠影响。
在一个实施方案中,肠道菌群失调是黏附侵袭性大肠杆菌和葡聚糖硫酸钠引起的肠道菌群失调,所述便隐血是黏附侵袭性大肠杆菌和葡聚糖硫酸钠引起的便隐血。
在一方面,本发明提供了荔枝发酵物在制备用于在受试者中改善肠道菌群失调的组合物中的用途,其中肠道菌群失调是由致病性大肠杆菌引起的肠道菌群失调。
在一个实施方案中,致病性大肠杆菌是侵袭性大肠杆菌。在一个实施方案中,致病性大肠杆菌是黏附侵袭性大肠杆菌。
在一个实施方案中,组合物还用于在受试者中改善炎症性肠病、肠易激综合征、慢性便秘。
在一个实施方案中,改善肠道菌群失调选自:增加肠道中有益菌的丰度和/或减少肠道中有害菌的丰度。
在一个实施方案中,有益菌选自Dubosiella、Akkermansia、Clostridia和Parvibacter属的细菌。
在一个实施方案中,有害菌属于埃希氏菌属和/或志贺氏菌属。在一个实施方案中,有害菌是埃希氏菌属和/或志贺氏菌属的物种。
在一个实施方案中,有害菌是致病性大肠杆菌或侵袭性大肠杆菌。在一个实施方案中,有害菌是黏附侵袭性大肠杆菌。
在一个实施方案中,受试者是人或动物。
在一个方面,本发明提供了荔枝发酵物用于维持或提升受试者的肠道健康的用途,其中维持或提升肠道健康选自阻断或消除肠道致炎性物质和/或致病性大肠杆菌对肠道的不利影响、增加肠道中有益菌的丰度和/或减少肠道中有害菌的丰度。
在一个实施方案中,不利影响选自致病性大肠杆菌对肠道的定殖。
在一个实施方案中,肠道致炎性物质是葡聚糖硫酸钠。
在一个实施方案中,有益菌选自Dubosiella、Akkermansia、Clostridia和Parvibacter属的细菌。
在一个实施方案中,有害菌属于埃希氏菌属和/或志贺氏菌属。
在一个实施方案中,有害菌是致病性大肠杆菌是侵袭性大肠杆菌,优选是黏附侵袭性大肠杆菌。
在一个方面,本发明提供了荔枝发酵物在制备组合物中的用途,其中组合物用于在受试者中改善致病性大肠杆菌侵袭或定殖的肠炎和/或肠易激综合征和慢性便秘,其中致病性大肠杆菌是黏附侵袭性大肠杆菌。
在一个实施方案中,组合物用于改善肠道菌群失调、维持肠道稳态、和/或防止致病性大肠杆菌对肠道的定殖,其中肠道菌群失调是由致病性大肠杆菌引起的肠道菌群失调。
在另一个方面,本发明提供了荔枝发酵物在制备组合物中的用途,其中组合物用于降低促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量,抑制肠道炎症;上调肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-2的基因表达量,恢复肠道上皮的紧密连接,维持肠道的物理屏障完整性;和/或减少 DSS和AIEC 对结肠组织的损伤,修复肠道组织结构。
在本文的各个实施方案中,荔枝发酵物通过二级发酵产生,二级发酵包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂密封静置发酵,然后通过醋酸菌静置或通气发酵得到。
在本文的各个实施方案中,酵母菌选自异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母;乳酸菌选自植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌;醋酸菌选自巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌。
在本文的各个实施方案中,荔枝发酵物为口服形式。在本文的各个实施方案中,荔枝发酵物可以制成片剂、胶囊剂、粉剂和/或饮品、凝胶糖果。在本文中,荔枝发酵物可以在进食时服用,或者可以不在进食时服用。
在各个实施方案中,组合物是食品组合物或功能性食品。
在各个实施方案中,受试者是人或动物。动物可以是任何哺乳动物,例如模型动物、伴侣动物、农场动物等,例如鼠、猫、狗、牛、猪、马等。
在各个实施方案中,致病性大肠杆菌是侵袭性大肠杆菌。
在各个实施方案中,致病性大肠杆菌是黏附侵袭性大肠杆菌。
在各个实施方案中,荔枝发酵物比荔枝果汁在改善肠炎期间体重下降、便隐血状态、肠道组织结构修复、肠道有益菌属丰度和支链脂肪酸异戊酸生成方面更有效和/或在炎症调节方面更优。
在各个实施方案中,组合物为食用组合物、食品组合物或保健品组合物。
本发明的有益效果包括:
1. 在动物模型中证明了荔枝发酵物具有改善肠道炎症的功效,可以作为食源性物质缓解和/或改善肠炎;
2. 荔枝发酵物改善AIEC对肠道健康的不利影响或改善AIEC(或其定殖)引起的肠道菌群失调;
3. 荔枝发酵物可在DSS诱导的肠炎模型中改善AIEC对肠道健康的不利影响或改善AIEC(或其定殖)引起的肠道菌群失调。
4. 荔枝发酵物具有以下一项或多项功能:可在体内降低促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量,抑制肠道炎症;上调肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-2的基因表达量,恢复肠道上皮的紧密连接,维持肠道的物理屏障完整性;减少DSS和AIEC对结肠组织的损伤,修复肠道组织结构;调节肠道菌群结构,增加有益菌属的丰度,降低有害菌属的丰度,改善肠道菌群的紊乱,增加有机酸含量,发挥益生作用,维持肠道稳态。
5. 荔枝发酵物在服用时足以在体内消除或阻断由致炎性物质、致病菌或者这两者对肠道的不利影响,进而不会引起肠道炎症或肠道菌群失调或紊乱或由此带来的肠道疾病。这是由体外实验推断不到的结果。基于现有的体外实验,本领域技术人员无法预期到该结果。
附图说明
图1显示了荔枝发酵物对肠炎期间体重变化、粪便形态和便隐血状态的影响。BC:空白对照组;MC:模型组;PC:阳性对照组;LF:荔枝发酵物组;LG:荔枝果汁。
图2显示了荔枝发酵物对结肠组织促炎因子表达的影响。BC:空白对照组;MC:模型组;PC:阳性对照组;LF:荔枝发酵物组;LG:荔枝果汁。
图3显示了荔枝发酵物对肠紧密连接蛋白基因表达的影响。BC:空白对照组;MC:模型组;PC:阳性对照组;LF:荔枝发酵物组;LG:荔枝果汁。
图4显示了荔枝发酵物对肠道损伤的干预作用。BC:空白对照组;MC:模型组;PC:阳性对照组;LF:荔枝发酵物组;LG:荔枝果汁。
图5A和图5B显示了荔枝发酵物对肠道菌群组成的影响。
图6A和图6B显示了荔枝发酵物对肠道菌属占比的影响。
图7显示了荔枝发酵物促进肠道短链脂肪酸生成。BC:空白对照组;MC:模型组;PC:阳性对照组;LF:荔枝发酵物组;LG:荔枝果汁。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点,而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语,但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
如本文所使用,术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义,并且是包括端点在内或是开放式的,并且不排除额外的未叙述的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语,意思指存在所述要素,但也可以增加其它要素并且仍形成在所述权利要求范围内的构造或方法。
如本文中所使用,“食用植物酵素”是指以可用于食品加工的植物为主要原料,添加或不添加辅料,经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类食用的酵素产品。中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5323-2018提供了食用植物酵素的特征性指标。食用植物酵素可以为液态、半固态或固态。对于液态食用植物酵素,总酸以乳酸计(g/100g)≥0.8;游离氨基酸(mg/100g)≥33;有机酸以乳酸计(g/100g)≥660;乳酸(mg/kg)≥550;粗多糖(g/100g)≥0.1;γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.03;多酚(mg/g)≥0.5;SOD酶活性≥15U/L。对于半固态,总酸以乳酸计(g/100g)≥1.1;游离氨基酸(mg/100g)≥35;有机酸以乳酸计(g/100g)≥900;乳酸(mg/kg)≥800;粗多糖(g/100g)≥0.15;γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.039;多酚(mg/g)≥0.6;SOD酶活性≥20U/L。对于固态,总酸以乳酸计(g/100g)≥2.4;游离氨基酸(mg/100g)≥97;有机酸以乳酸计(g/100g)≥6400;乳酸(mg/kg)≥1150;粗多糖(g/100g)≥2.8;γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.06;多酚(mg/g)≥1.4;SOD酶活性≥30U/L。
食用植物酵素(或称为植物发酵物)可以含有发酵菌株,例如乳酸菌和/或酵母菌。或者,食用植物酵素可以经过灭菌而不包含活菌。如本文中所使用,“荔枝发酵物”与“荔枝酵素”可互换使用,是以荔枝为原料,经过微生物发酵得到的含有总酸、γ-氨基丁酸、SOD酶活物质等特定生物活性成分的酵素。本文中的荔枝发酵物可以满足上述食用植物酵素的相关标准。荔枝发酵物可以从荔枝果液和/或荔枝果渣经过微生物发酵产生。微生物可以包含酵母菌、乳酸菌和醋酸菌中的1种、2种或3种。酵母菌可以为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。乳酸菌可以为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种醋酸菌为巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。荔枝发酵物可以通过二级发酵产生。二级发酵可以包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂(例如密封静置)的第一级发酵。二级发酵可以包括通过醋酸菌(例如静置或通气培养)的第二级发酵。荔枝发酵物可以为例如中国发明专利申请号202210565739.1,发明名称“荔枝酵素、其制备方法和用途”的中国发明专利中提到的荔枝酵素。该专利中的荔枝酵素相对于其他植物酵素具有更好的抗炎效果。
例如,荔枝酵素可以通过如下的方法制备,所述方法包括(1) 一级发酵,其包括在荔枝果液和荔枝果渣中添加第一碳源,接种第一菌剂,于20-45℃密封静置发酵24-96小时,其中第一菌剂是酵母菌与乳酸菌的混合菌剂;(2) 对一级发酵后的产物进行挤压和过滤,获得一级发酵滤液;和(3) 二级发酵,其包括在一级发酵滤液中添加第二碳源,接种第二菌剂,15-40℃静置或通气培养3-15天以得到二级发酵液,其中第二菌剂是醋酸菌;(4)对二级发酵液进行过滤、灭菌以得到荔枝酵素。在一个实施方案中,方法包括对荔枝果进行清洗和压榨的前处理步骤。在一个实施方案中,第一碳源为果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、***糖中的一种或多种。在一个实施方案中,第一碳源的添加量为0-5wt%。在一个实施方案中,酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。优选地,酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、面包酵母中的一种或多种。在一个实施方案中,乳酸菌为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种。在一个实施方案中,酵母菌:乳酸菌的重量比为50:1-500:1。优选地,酵母菌:乳酸菌的重量比为300:1-500:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰-10‰。在一个实施方案中,第二碳源为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。在一个实施方案中,第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1%-20%。在一个实施方案中,第二菌剂为巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。在一个实施方案中,第二菌剂的添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰-10‰。在一个实施方案中,静置培养为8层纱布封口静置培养。在一个实施方案中,通气培养的通气量为0.1-20mL/min/mL发酵液。
在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为400:1;酵母菌为清酒酵母;乳酸菌为副干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌:格氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.9‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为100:1;酵母菌为面包酵母:毕赤酵母:鲁氏酵母为1:1:1;乳酸菌为植物乳杆菌:干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的5‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为50:1;酵母菌为威尔酵母:胶红酵母:鲁氏酵母为1:1:1;乳酸菌为清酒乳杆菌:干酪乳杆菌为1:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为300:1;酵母菌为异常汉逊酵母;乳酸菌为格氏乳杆菌。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的10‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为500:1;酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1;乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的8‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为200:1;酵母菌为胶红酵母;乳酸菌为植物乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的2‰。在一个实施方案中,第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为150:1;酵母菌为面包酵母;乳酸菌为干酪乳杆菌。在一个实施方案中,第一菌剂的添加量为荔枝总质量的4‰。
二级发酵过程可以包括在一级发酵滤液中添加第二碳源,接种第二菌剂,于第二温度静置或通气培养第二时间段以得到荔枝酵素,其中第二菌剂是醋酸菌。第二菌剂可以是巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。第二碳源可以为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。第二碳源可以包含两种以上的糖类,例如重量百分比相同的两种以上的糖类。第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1%-20%,例如2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%。在一个实施方案中,第二碳源是乳糖。在一个实施方案中,第二碳源是赤砂糖。在一个实施方案中,第二碳源是糖蜜:乳糖为1:1。在一个实施方案中,第二碳源是葡萄糖。在一个实施方案中,第二碳源是蜂蜜。在一个实施方案中,第二碳源是葡萄糖:蜂蜜为1:1。第二温度的范围可以为15-40℃。第二时间段的范围可以为3-15天。在一个实施方案中,第二菌剂是醋酸醋杆菌:醋化醋杆菌。在一个实施方案中,第二菌剂添加量为一级发酵滤液总质量的1‰。在一个实施方案中,第二菌剂是巴氏醋杆菌。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的5‰。在一个实施方案中,第二菌剂是醋化醋杆菌。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的9‰。在一个实施方案中,第二菌剂是加纳醋杆菌:醋化醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰。在一个实施方案中,第二菌剂是恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰。在一个实施方案中,第二菌剂是恶臭醋酸菌。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的3‰。在一个实施方案中,第二菌剂是加纳醋杆菌。在一个实施方案中,添加量为一级发酵滤液总质量的10‰。
在一个优选的实施方案中,荔枝发酵物具有表1中所示的一种或多种参数特征。
表1 荔枝发酵物规格标准
如本文中所使用,“葡聚糖硫酸钠(DSS)”是一种聚阴离子衍生物,其诱导结肠炎模型的机理虽仍未十分明确,但通常认为与巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调、DSS对结肠上皮的毒性作用、细胞因子在DSS结肠炎模型的发病中起重要作用等机制有关。
如本文中所使用,“受试者”可以是任何合适的哺乳动物,优选是人。受试者可以有肠道疾病,诸如肠炎,或者受试者可以没有肠道疾病或者为肠道健康的受试者。对于肠道健康的受试者而言,荔枝发酵物可以增加肠道中诸如Dubosiella、Akkermansia、Clostridia和Parvibacter属的细菌的丰度,和/或降低有害菌诸如埃希氏菌属和/或志贺氏菌属的细菌的丰度。荔枝发酵物可以提升或维持受试者的肠道健康。
大肠杆菌有致病性和非致病性之分。非致病性大肠杆菌是肠道正常菌丛。致病性大肠杆菌可分为侵袭性和毒素性两类。侵袭性大肠杆菌不产生肠毒素,而主要是侵入结肠粘膜内并增殖,引起有嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润的炎症反应,致使粪便中含有血细胞和粘液。侵袭性大肠杆菌的治疗可使用抗菌药物,例如阿米卡星、庆大霉素、诺氟沙星等。侵袭性大肠杆菌包括黏附侵袭性大肠杆菌。
黏附侵袭性大肠杆菌
黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)是大肠杆菌中的一个独特的致病菌种,被认为与炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)有关。AIEC能黏附已分化和未分化的肠上皮细胞,且能够在巨噬细胞中生存和复制。AIEC可通过微管聚合和肌动蛋白招募作用黏附侵袭肠道上皮细胞(IEC),诱导炎性细胞因子的分泌。当其在巨噬细胞内生存和复制时,能够诱导TNF-α的分泌并促进体外肉芽肿的形成,并促进克罗恩病(Crohn' s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的发生。研究表明AIEC还可通过长极菌毛结构穿越黏膜屏障进入淋巴细胞。
肠道屏障能够保护黏膜免受肠腔内毒素、侵袭性微生物的侵害。肠道上皮细胞相互连接形成物理屏障,贯穿于整个肠道黏液层,是天然免疫中不可或缺的一部分。屏障***功能紊乱则会增加肠道的通透性,这也是IBD患者的重要患病特征。屏障紊乱包括肠道黏液层厚度和组分的减少、紧密连接复合物的改变等。遗传或环境来源的宿主肠道屏障缺陷可能会影响AIEC在肠道定殖和易位的能力。许多CD患者中存在的宿主缺陷与AIEC LF82菌株致病能力的增强有关。在炎症背景下,由于肠上皮特异性受体CEACAM6和Gp96异常表达,从而导致上皮细胞抵御致病菌黏附和侵袭的能力下降,CD患者的回肠损伤部位有致病性的AIEC定植。
此外,自噬过程中存在的缺陷与NOD2、ATG16L1和IRGM家族的功能和表达有关,这些缺陷会损害宿主细胞抵御外界感染的能力。相关证据表明,AIEC能够通过置换和重新分布顶端紧密连接形成的必需组分。屏障***完整性的下降使AIEC更易穿过上皮屏障,发挥致病作用。肠道屏障损伤和炎性反应也会加剧肠道的炎症症状。在CD背景下,AIEC破坏上皮屏障的完整性。宿主和微生物群之间的相互作用能够促进紧密连接的重新调整,但这有时会扰乱肠道紧密连接屏障,导致病理生理紊乱。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解,在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地,其他实施方案在以下权利要求的范围内。
以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而,本领域技术人员应理解,这些实施例仅为了说明的目的提供,而不是意图限制本申请。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本申请,而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外指明,所列出的所有量均基于总重的重量百分比描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
材料和方法
1. 荔枝果汁及荔枝发酵物的制备
1.1荔枝果汁的制备:取荔枝果,清洗压榨出汁,然后过滤灭菌。
1.2荔枝发酵物的制备:(可参考中国专利申请No. 202210565739.1)
(1)前处理:5吨荔枝果清洗,压榨;
(2)一级发酵:在果液和果渣的混合物中添加糖1,接种菌剂1,25℃密封静置发酵48h;
(3)过滤:压滤机挤压,获得一级发酵滤液,一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%;
(4)二级发酵:在一级发酵滤液中添加糖2,接种菌剂2,40℃通气培养9天;
(5)过滤、灭菌。
在本实施例中,糖1为果糖:蔗糖:红糖为1:1:1;糖1的添加量为3%(w/w);菌剂1为酵母菌:乳酸菌为500:1;酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1;乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1;菌剂1的添加量为荔枝总质量的8‰。
在本实施例中,糖2为蜂蜜;糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的20%;菌剂2为恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1;菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰;培养方式为通气量为5mL/min/mL发酵液的通气培养。荔枝发酵物满足表1中的规格标准。
菌种来源:面包酵母(Saccharomyces sp.)GDMCC 2.115(购自广东省微生物菌种保藏中心);清酒酵母CCTCC CY 20081270(购自典型培养物保藏中心);植物乳杆菌CGMCC1.572(购自中国普通微生物保藏中心);格氏乳杆菌FRI2008082(购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司);清酒乳杆菌subsp. sakei CICC 21858(购自中国工业微生物菌种保藏中心);恶臭醋酸菌BNCC183824(购自北纳生物菌种保藏中心);醋酸醋杆菌ATCC15973(来自美国典型培养物保藏中心);巴氏醋杆菌GDMCC 1.67(购自广东省微生物菌种保藏中心)。
2. 动物分组与模型建立
在研究功能食品或成分对肠炎的干预或治疗作用时,常采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)造模。鉴于AIEC在肠道炎症中的作用,本发明采用DSS和AIEC联合灌胃的方式建立肠炎模型。
购买8-10周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠,饲养在SPF级动物房,给予充足的标准饲料和水。适应实验环境一周后,称重并随机分为空白对照组(BC)、肠炎模型组(MC)、荔枝果汁组(LG)、阳性对照组(PC)和荔枝发酵物干预组(LF),每组8只小鼠(n=8)。空白对照组在第1-15天灌胃正常蒸馏水;模型组第1-5天灌胃含2.5% DSS的蒸馏水,第6天灌胃含2.5% DSS和链霉素(20mg/只)的蒸馏水,第7-8天灌胃大肠杆菌AIEC LF82菌株(法国克莱蒙费朗大学Arlette Darfeuille-Michaud 教授友情提供)(1*109 CFU/只),第9-15天灌胃正常蒸馏水;阳性对照组第1-5天灌胃含2.5% DSS和美沙拉嗪(100mg/kg)的蒸馏水,第6天灌胃含2.5% DSS、美沙拉嗪(100mg/kg)和链霉素(20mg/只)的蒸馏水,第7-8天灌胃美沙拉嗪(100mg/kg)和LF82菌株(109 CFU/只),第9-15天灌胃美沙拉嗪(100mg/kg);荔枝发酵物组第1-5天灌胃含2.5% DSS和荔枝发酵物(26mg/kg,将荔枝发酵原液冻干,灌胃时根据浓缩倍数将浓缩物稀释成工作浓度3.65mg/mL)的蒸馏水,第6天灌胃含2.5% DSS、荔枝发酵物(26mg/kg)和链霉素(20mg/只)的蒸馏水,第7-8天灌胃荔枝发酵物(26mg/kg)和LF82菌株(109 CFU/只),第9-15天灌胃荔枝发酵物(26mg/kg);荔枝果汁组第1-5天灌胃含2.5%DSS和荔枝果汁(26 mg/kg),第6天灌胃含2.5%DSS、荔枝果汁(115 mg/kg)和链霉素(20 mg/kg)的蒸馏水,第7-8天灌胃荔枝果汁(115 mg/kg)和LF82菌株(109 CFU/只),第9-15天灌胃荔枝果汁(115 mg/kg)。每个实验组每只小鼠每天的灌胃量为200μL。第16天处死小鼠,取样检测。
3. 体重变化和DAI评分
实验期间,每天固定时间给小鼠称量体重和饮水量,用便隐血试剂盒记录小鼠便隐血情况。其中便隐血检测参照试剂盒说明书(珠海贝索生物科技有限公司,货号BA-2020E)。按试剂盒说明书对小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分,DAI评分是由体重下降分值、粪便性状分值和便隐血情况分值三项之和。
4. 结肠组织炎症因子测定
取出冻存的结肠组织称重,按照质量体积比1:9补充相应体积含蛋白酶抑制剂的预冷PBS溶液,置于组织研磨机60 HZ研磨2 min。研磨液在4 ℃下以5000 g离心10 min,收集上清并分装。炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的测定参照ELISA试剂盒说明书(深圳欣博盛生物科技有限公司,货号分别为EMC004.96、EMC001b.96和EMC102a.96)用ELISA试剂盒测定。
5. 肠紧密连接蛋白mRNA表达
将约50mg的结肠组织放入装有无酶钢珠的2 mL无酶EP管中,加入1 mL预冷的Trizol试剂,置于组织研磨机60 Hz研磨2 min。研磨结束后向研磨液加入200 µL氯仿,涡旋仪震荡1 min,放置冰上 5 min后4 ℃,12000 g,离心10 min。吸取上层水相约400 µL转移至新的2 mL无酶离心管中并加入等体积的异丙醇,颠倒摇匀后室温静置10 min,然后4 ℃下12000 g离心10 min,弃上清。用1 mL 75%的乙醇(含0.1% DEPC水)温和洗涤沉淀,4℃下8000 g离心 5 min,弃上清,超净工作台里晾干10 min。最后用50 µL DEPC水溶解 RNA。使用超微量分光光度计测定RNA浓度和质量。RNA样品保存于-80℃冰箱。根据Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,货号AG11728)操作说明书将总RNA反转录成cDNA,使用表2中的引物直接进行荧光定量PCR分析ZO-1、Occludin和Claudin-2的mRNA表达水平。
表2 引物序列
6. 肠道菌群检测
取第15天的小鼠粪便,送至美吉生物进行粪便总DNA的提取。PCR产物用Quantus™Fluorometer进行检测定量。按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库,利用Illumina公司的 Miseq PE300 进行测序。图5A和图5B是Illumina测序得到的原始数据拼接、质控并优化数据,根据OUT深度进行聚类,通过美吉生物的云平台处理得到。PCoA分析首先是对一系列特征值和特征向量进行排序,然后选择排在前几位的最主要特征值,并将其表现在坐标系里,相当于是距离矩阵的一个旋转。基于所选距离矩阵进行作图,通过降维找出影响样本群落组成差异的潜在主成分。
7. 短链脂肪酸测定
配制丙酸(Propionic acid)、丁酸(Butyric acid)、异丁酸(Isobutyric acid)和异戊酸(Isovaleric acid)的混合标准溶液,使用外标法以确定各短链脂肪酸的出峰时间并依据其浓度梯度绘制标准曲线。取60 mg第15天的小鼠粪便于2 mL EP管中,加入0.8 mL超纯水和0.2 mL 50%浓硫酸后涡旋5 min。4℃下12000 g离心5 min。离心结束后取上层清液,加入0.5 mL -20℃预冷的***,涡旋5 min萃取短链脂肪酸。将经***萃取的短链脂肪酸放入4℃预冷的离心机中以12000 g离心5 min。将离心管放入-80℃冰箱中静置10 min以破乳,破乳后再4℃离心,取上层清液,过0.22 μm有机相滤膜,导入具有内插管的色谱样品瓶中备用。
色谱条件:流速:14.4 mL/min;进样方式为不分流进样;进样量为1 μL;FID温度:240℃;进样口温度:200℃;H2流速:30 mL/min;空气流速:300 mL/min;N2流速:20 mL/min。升温程序:起始温度为100℃,保留0.5 min,以8℃/min的升温速率升至180℃,保留1 min后以20℃/min的升温速率升温到200℃,随后保持200℃的柱温到17.5 min。
8. 病理切片实验
用脊椎脱臼法处死小鼠,解剖,取距离***1 cm处的结肠0.5 cm左右,置于多聚甲醛固定液24 h。取出固定好的结肠组织,在梯度乙醇中脱水并用石蜡包埋。用切片机将组织块切成4 um切片,使用苏木精和伊红(HE)染色,用中性树胶封片。将切片置于光学显微镜下观察,拍照记录。
实施例1:荔枝发酵物调节肠道炎症期间体重下降、改善粪便形态和便隐血状态
如图1中显示,肠道炎症期间,相比对照组的稳定体重,体重变化呈现先降低后增加。模型组体重变化最剧烈,而荔枝发酵物处理后的组别体重下降趋势被明显缓解,效果显著优于荔枝汁组和阳性对照组。图1的B图显示了正常粪便形态和改善便隐血程度。从DAI评分可以看出小鼠粪便形态和便隐血状态在荔枝发酵物处理后得到明显改善。这表明荔枝发酵物可缓解肠炎期间的体重变化和排便状态。
实施例2:荔枝发酵物改善肠道炎症、维持肠道屏障完整性并且修复肠道组织损伤
荔枝发酵物改善肠道炎症
如图2中显示,在AIEC和DSS共同造模的模型中,与模型组相比,荔枝发酵物组的促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量下降(P<0.05),表明荔枝发酵物能通过降低促炎因子水平来减缓肠道炎症。荔枝发酵物组的抗炎效果甚至优于阳性对照组的抗炎效果,且IL-6、IL-1β、TNF-α水平与空白对照组相当,表明荔枝发酵物可消除致炎物质和致病性大肠杆菌引起的肠道炎症反应。
荔枝发酵物维持肠道屏障完整性
如图3中显示,在AIEC和DSS共同造模的模型中,与模型组相比,荔枝发酵物组的肠道上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-2的mRNA相对表达量增加(P<0.05),表明荔枝发酵物能够通过上调肠道上皮紧密连接蛋白的表达量、恢复肠道上皮的紧密连接,进而维持肠道的物理屏障完整性。表明荔枝发酵物可消除致炎物质和致病性大肠杆菌对肠道屏障的不利影响。
荔枝发酵物修复肠道组织损伤
如图4中显示,模型组的结肠组织显示出严重的上皮损伤,其中结肠细胞和隐窝大量丢失,杯状细胞耗尽,粘膜侵蚀和水肿。阳性对照组和荔枝发酵物组都能够维持结肠组织的正常结构。该实验结果表明荔枝发酵物干预可减少DSS和AIEC对结肠组织的损伤,具有修复肠道组织结构的功能。
实施例3:荔枝发酵物恢复肠道菌群稳态
如图5A和图5B中显示,实验第1天,各组小鼠的肠道菌群组成相似,分组椭圆内各样本点相互聚集。第15天时,模型组的肠道菌群组成改变,分组椭圆方向与空白对照组相反,而阳性对照组和荔枝发酵物组的样本分组与空白对照组相接近。表明荔枝发酵物能够改善由DSS和AIEC共同造成的肠道菌群紊乱。
如图5A、图5B、图6A和图6B中显示,实验第1天,各组小鼠肠道菌属占比相近,边造模边干预9天后,各组小鼠的菌群组成发生变化。Dubosiella作为肠道菌群的基底菌属,具有提高肠道免疫力和促进机体抵抗炎症等功效。与空白对照组(图中BC)相比,模型组(图中MC)和阳性对照组(图中PC)的肠道基底菌属Dubosiella属丰度降低,而荔枝发酵物组(图中LF)则与BC组丰度接近。Escherichia-Shigella属是肠道致病菌,在模型组中丰度明显高于其他组,而荔枝发酵物组和阳性对照组的丰度与空白对照组接近。
干预15天后,各组小鼠肠道基础菌属Dubosiella属逐渐恢复,占比趋于一致。荔枝发酵物组Dubosiella属水平一直保持较高丰度,与空白对照组接近,表明该样品在干预初期即发挥了作用,并稳定维持肠道稳态。荔枝发酵物组的有益菌属Akkermansia属丰度也高于其他组,而有害菌属Escherichia-Shigella丰度较低、与BC组接近,这表明荔枝发酵物能增加有益菌的定殖、减少大肠杆菌的增殖。Clostridia_UCG-014属于梭状芽孢杆菌属,能利用多糖生成短链脂肪酸(SCFAs),参与体内代谢。Parvibacter属于放线菌门,有文献报道该菌是对健康有益的,和丁酸、戊酸含量呈正相关。荔枝发酵物的摄入能显著增加Clostridia_UCG-014和Parvibacter丰度,使其接近BC组正常水平。综上所述,荔枝发酵物通过增加有益菌属Dubosiella属、Akkermansia属、Clostridia_UCG-014、Parvibacter属等丰度,降低有害菌属Escherichia-Shigella丰度,改善了肠道菌群的紊乱,维持肠道稳态。
实施例4:荔枝发酵物促进肠道短链脂肪酸生成
如图7中显示,与AIEC和DSS共同造模的模型组相比,荔枝发酵物能够增加小鼠粪便中的丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸含量(P<0.05),表明荔枝发酵物在肠道内发挥了益生调节作用,且这种益生调节作用足以阻断或消除AIEC和DSS等物质带来的不利影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.荔枝发酵物在制备用于在受试者中改善便隐血或促进支链脂肪酸生成的口服组合物中的用途,其中受试者受到黏附侵袭性大肠杆菌和葡聚糖硫酸钠影响,所述便隐血是黏附侵袭性大肠杆菌和葡聚糖硫酸钠引起的便隐血和/或支链脂肪酸是异丁酸和异戊酸。
2.根据权利要求1所述的用途,其中受试者是人或动物,和/或荔枝发酵物通过二级发酵产生,二级发酵包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂密封静置发酵,然后通过醋酸菌静置或通气发酵得到。
3.根据权利要求2所述的用途,其中酵母菌选自异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母;乳酸菌选自植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌;醋酸菌选自巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌。
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黏附侵袭性大肠杆菌在炎症性肠道疾病中的作用;杨玉倩等;生物技术通讯;第27卷(第06期);851-859 * |
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