CN116478888B

CN116478888B - 一株多功能植物乳植杆菌及其应用

Info

Publication number: CN116478888B
Application number: CN202310619412.2A
Authority: CN
Inventors: 廖振林; 蔡常宇; 王临好; 陈俊杰; 王洁
Original assignee: Hunan Kaiyou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Kaiyou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-05-29
Filing date: 2023-05-29
Publication date: 2024-06-28
Anticipated expiration: 2043-05-29
Also published as: CN116478888A

Abstract

本发明公开了一株多功能植物乳植杆菌及其应用。本发明研究的植物乳植杆菌LY4菌株已于2023年4月19日保存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：GDMCC N0:63373，其全基因序列登录号为SRR24579381。本发明研究显示LY4菌株具有对引起血糖升高的关键酶α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶有较高的抑制能力，其抑制率最高达100％，效果达糖尿病药物阿卡波糖的96％以上，并且能够降解脂多糖；同时，LY4菌株具有较好的耐酸耐胆盐能力，及更好的安全性和热稳定性，满足益生菌在人体胃肠消化道的存活要求，可作为控制血糖的高效菌株，在降解脂多糖的同时能够缓解糖尿病，为糖尿病患者控制血糖提供新的选择。

Description

一株多功能植物乳植杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株多功能植物乳植杆菌及其应用。

背景技术

糖尿病是由不同病因和发病机制引起的胰岛素缺乏或胰岛素抵抗的代谢紊乱的总称，主要表现为葡萄糖代谢异常。糖尿病的并发症多，对患者的生活造成极大不便，也给家庭、社会造成巨大的经济负担，是继恶性肿瘤和心血管疾病之后的威胁人类健康和生活的第三大慢性且不传染的疾病，因此，对糖尿病的有效预防和治疗成为当前重要的任务。α-葡萄糖苷酶是一种在小肠黏膜刷状缘存在的水解酶，可催化碳水化合物(低聚糖、双糖等)水解为单糖，使葡萄糖释放到血液，导致血糖水平升高。现有研究表明，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可以延缓碳水化合物转变成单糖，降低对葡萄糖的吸收速率，使糖尿病患者餐后血浆中的葡萄糖维持在较低水平，起到调控血糖的作用。或通过对α-淀粉酶的抑制来阻断淀粉转化为糖类物质，从而降低血浆中葡萄糖水平，从而实现对血糖的控制。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性菌破裂后分泌的细胞壁成分，也是炎症启动的主要诱导因子，在健康人群中革兰氏阳性菌富集，而2型糖尿病(T2DM)患者的肠道内革兰氏阴性菌富集，这些阴性菌死亡后会释放出大量LPS，部分LPS会被吸收进入血液循环***，因此T2DM患者血液内LPS浓度明显增加。LPS能够与小肠上皮细胞膜受体蛋白结合破坏肠道通透性，激活NF-κB等转录因子产生免疫应答，诱发炎症反应。LPS还能与CD14/Toll样受体4(TLR4)受体结合，通过NF-κB途径抑制胰岛β细胞表达，同时LPS还可激活MAPKs通路，影响胰岛素受体底物的表达，导致胰岛素抵抗。肠道菌群失调会导致革兰氏阴性菌的数量争夺，从而增加LPS浓度，高浓度的LPS激活TLR4，释放炎症因子如白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，进而引发机体慢性炎症反应，最终导致了胰岛素抵抗。

近年来，随着生物技术的发展，益生菌的研究越来越引起人们的关注和重视。益生菌是指在食品中添加一定剂量时对宿主健康有益的活微生物，益生菌具有抑菌、抗病毒、降胆固醇、抗氧化、增强免疫力等生物学功能。现有研究显示，益生菌、益生元或合生元等可对糖尿病患者的临床症状有明显的缓解作用。据文献报道，LI等发现植物乳植杆菌(原名称植物乳杆菌)X1、CCFM12、CCFM30、CCFEM236、CCFM311、RS4的无细胞上清液均对α-葡萄糖苷酶有抑制效果，抑制率分别为41.81％、27.14％、24.96％、31.18％、27.83％、35.68％。张召等从自然发酵泡菜液中筛选出一株具有良好抑制α-葡萄糖苷酶活性的植物乳杆菌NX-1，其未灭活的发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为33.13％。与化学药物相比，益生菌安全性高、毒副作用小，生物疗法更具有前景与吸引力。但现有已公开的益生菌对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制效果都较低，还有待提高。

目前缺乏能够同时抑制α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶的降糖和脂多糖降解的药物，而脂多糖能够刺激胰岛素抵抗的关键诱导因子的释放，因此寻找能够同时抑制α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶、降解脂多糖含量的菌株或药物迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有益生菌对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制效果的缺陷和不足，提供一株具有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性、且能降解脂多糖的植物乳植杆菌及其应用。

本发明的第一个目的是提供一株多功能植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LY4菌株。

本发明的第二个目的是提供植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株的应用。

本发明的第三个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂。

本发明的第四个目的是提供一种缓解/治疗糖尿病或控制血糖的产品。

本发明的第五个目的是提供一种抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶、降解脂多糖的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一株多功能植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株，能够抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性，同时还能降解脂多糖，该菌株于2023年4月19日保存于广东省菌种保藏中心，菌种保藏编号：GDMCC N0:63373。LY4菌株的全基因序列已上传至NCBI，登录号为SRR24579381。

本发明提供的LY4菌株分离自米酒发酵醪液，LY4菌株对引起血糖升高的关键酶α-葡萄糖苷酶有较高抑制作用，LY4菌株的发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率能达到糖尿病药物阿卡波糖的效率的96％以上；LY4菌株对α-淀粉酶也具有优异的抑制能力，其发酵上清液对α-淀粉酶的抑制率能达到100％，且效果不受高温影响，具有较好的热稳定性，抑制效果与阿卡波糖非常接近，但比阿卡波糖具有更好的安全性，无毒副作用。同时，LY4菌株能够降解脂多糖，在4h对101EU/mL的脂多糖去除率达到29.91％。即LY4菌株能够高效抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，能通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，并能降解脂多糖，减缓糖类的转化和吸收，降低餐后血糖水平，从而抑制餐后高血糖，缓解糖尿病。同时该菌株具有较好的耐酸耐胆盐能力，满足益生菌在人体胃肠消化道的存活要求。

因此，本发明提供多功能植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株和/或其菌液的以下应用：

在以非疾病诊断治疗为目的的抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶中的应用。

在以非疾病诊断治疗为目的降解脂多糖中的应用。

在制备抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的产品中的应用。

在制备降解脂多糖的产品中的应用。

在制备缓解或治疗糖尿病产品或控制血糖产品中的应用。

优选地，所述产品为食品、保健品或药品。

本发明提供一种α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂，含植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液。

优选地，所述菌液为菌株发酵液，发酵液由LY4菌株按1～5％的接种量，接种到培养基中，于35～40℃、静置培养24～72h即得。

更优选地，所述发酵液为发酵上清液或菌悬液。

本发明提供一种缓解/治疗糖尿病或控制血糖的产品，含植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液。

优选地，所述LY4菌株浓度不低于2×10⁹cfu/mL。

更优选地，LY4菌株按1％的接种量接种到培养基中，于37℃、静置培养24h即得发酵液。

本发明提供一种抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶、降解脂多糖的方法，采用植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液对样品进行处理。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一株多功能植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株，对引起血糖升高的关键酶α-葡萄糖苷酶有较高抑制作用，LY4菌株的发酵上清液对α葡萄糖苷酶的抑制率能达到糖尿病药物阿卡波糖的效率的96％以上，且LY4菌株对α-淀粉酶也具有优异的抑制能力，其发酵上清液对α-淀粉酶的抑制率能达到100％，还不受高温与蛋白酶的影响，效果与阿卡波糖相当，但比阿卡波糖具有更好的安全性，无毒副作用。同时，LY4菌株能够降解脂多糖，在4h对101EU/mL的脂多糖去除率达到29.91％，即LY4菌株能降解脂多糖，更好地减缓糖类的转化和吸收，以降低餐后血糖水平，从而抑制餐后高血糖；且本发明提供的LY4菌株具有较好的耐酸耐胆盐能力，满足益生菌在人体胃肠消化道的存活要求。

本发明提供的LY4菌株能通过抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性和降解脂多糖，减缓糖类的转化和吸收，降低餐后血糖水平，从而抑制餐后高血糖，缓解糖尿病，对糖尿病的预防与治疗有积极作用。此外，植物乳植杆菌已经进入国家可食用益生菌名录，菌株安全性高，无毒副作用，抗逆性强。本发明植物乳植杆菌LY4可应用于发酵食品、保健品和药品中，为糖尿病患者日常血糖控制提供新的选择。

附图说明

图1为植物乳植杆菌LY4菌体形态图；

图2为植物乳植杆菌LY4的用邻接法构建的进化树；

图3为植物乳植杆菌LY4基因组圈图；

图4为植物乳植杆菌LY4对酸耐受性实验结果图；

图5为植物乳植杆菌LY4对胆盐耐受性实验结果图；

图6为植物乳植杆菌LY4对α-葡萄糖苷酶活性抑制率结果图；

图7为植物乳植杆菌LY4发酵上清液时间梯度对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验结果图；

图8为植物乳植杆菌LY4发酵上清液温度梯度对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验结果图；

图9为植物乳植杆菌LY4发酵上清液蛋白酶处理对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验结果图；

图10为植物乳植杆菌LY4对α-淀粉酶活性抑制实验结果图；

图11为植物乳植杆菌LY4发酵上清液降解脂多糖实验结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株的筛选和鉴定

1、菌株的分离纯化：

样品来自米酒发酵醪液，吸取适量米酒发酵醪液，置于含有99mL的无菌三级水中，其中加入适量的无菌玻璃珠，置于室温200rpm/min的摇床中6h，使微生物与酒糟充分分离，微生物得到充分分散，此三角瓶中的菌悬液的菌浓度即为原始样品的10^-2倍。采用梯度稀释的方法，将适宜梯度稀释的菌悬液涂布于MRS培养基上，平板倒置放在37℃培养箱培养48h，依据菌落形态，在MRS培养基上多次划线纯化，获得纯化菌株，并将其命名为LY4菌株。

2、菌体形态观察：

将上述纯化后的LY4菌株接种于MRS培养基平板上37℃倒置培养48h，观察其菌落形态，其菌株形态如图1所示，菌落呈现不透明乳白色，表面光滑湿润，菌株通过革兰氏染色呈阳性。

3、细菌的分子生物学鉴定：

采用SDS法对上述纯化后的细菌进行DNA提取，使用通用引物27f(5’-CCTGGCTCAGAGAGTTTGAT-3’)和1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对细菌保守序列进行扩增。再将扩增引物送至测序公司进行测序，并将得到的序列进行拼接，拼接后的序列在NCBI数据库通过BLAST进行比对。

同时利用Mega软件邻接法进行进化树构件结果如图2所示，比对结果显示LY4菌株与Lactiplantibacillus plantarum CGMCC10331^T(KR106205.1)菌株相似性达99％，基于上述鉴定结果，最终LY4菌株分类地位确定为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，并命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株，并于2023年4月19日保存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：GDMCC N0:63373，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

4、细菌的全基因测序：

实验流程按照PacBio公司提供的标准protocol执行，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和上机测序等流程开展，其中，基因组组装软件为hif iasm v0.12。

基因组组装结果显示：基因组全长3270221bp，环状，GC含量为44.44％。

非编码RNA分析结果显示：植物乳植物杆菌LY4基因组上tRNA数量为68个，rRNA为16个，其中5S rRNA6个、16S rRNA5个、23S rRNA5个。

利用组装和预测得到的基因组信息，如tRNA、rRNA、重复序列、GC含量以及基因功能信息等，应用软件Circos v0.66绘制基因组圈图，如图3所示。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LY4菌株全基因序列已上传至NC BI，登录号为SRR24579381。

实施例2植物乳植杆菌LY4的胆盐及pH耐受性测定

1、pH耐受性测定：

将活化好的LY4菌液在4℃，10000r/min离心8min后弃上清液，分别接入pH2.0、pH3.0、pH4.0的MRS液体培养基中，37℃静置培养，以普通MRS培养基为对照，接种后分别在0h、4h采用十倍梯度稀释法用无菌生理盐水稀释合适梯度在MRS平板点10μL，于37℃培养箱培养后进行活菌计数，将活菌数带入以下公式计算得出耐酸存活率。

存活率(％)＝(log_N1/log_N0)×100％

其中：N1：实验组培养下的活菌数，N0：普通MRS培养基培养后的0h活菌数。

2、胆盐耐受性测定：

将活化好的LY4菌液在4℃，10000r/min离心8min后弃上清液，分别接入0.1％(w/v)、0.3％(w/v)、0.5％(w/v)的胆盐MRS液体培养基中，37℃静置培养，以普通MRS培养基为对照，接种后分别在0h、4h采用十倍梯度稀释法用无菌生理盐水稀释合适梯度在MRS平板点10μL，于37℃培养箱培养后进行活菌计数，将活菌数带入存活率公式中，计算得出耐胆盐存活率。

3、实验结果：

植物乳植杆菌LY4对pH耐受能力如图4所示，在pH耐受性测定中，当pH＝2时，植物乳植杆菌LY4的存活率为53.3％；当pH＝3时，植物乳植杆菌LY4的存活率可达90.4％；当pH＝4时，植物乳植杆菌LY4的存活率超过了100％，达到了105％。

植物乳植杆菌LY4对胆盐耐受能力如图5所示，在胆盐耐受性测定中，当胆盐添加0.1％时，植物乳植杆菌LY4的存活率达到97.9％，当胆盐添加0.3％时，植物乳植杆菌LY4的存活率达到96.2％，当胆盐添加量增加到0.5％时，植物乳植杆菌LY4仍保持84％的存活率。

因此，表明本发明的植物乳植杆菌LY4具有较好的耐酸和耐胆盐能力。

实施例3植物乳植杆菌LY4抑制α-葡萄糖苷酶活性

1、不同植物乳植杆菌样品的制备：

菌株活化：从-20℃冰箱取出LY4菌株，以1％的接种量接种到MRS试管中活化，活化两代后使用。

发酵液制备：取上述活化好的植物乳植杆菌LY4菌株发酵液按1％的接种量接种到100mL液体培养基中，37℃、静置培养24h，得到发酵液。

发酵上清液/灭活发酵上清液制备：将上述制备的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心l0min，收集上清液，利用0.22μm滤膜过滤后即得发酵上清液样品。将发酵上清液在100℃煮沸20min，得灭活发酵上清液样品。4℃冷藏备用。

活菌悬液/灭活菌悬液制备：将上述制备的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，收集菌体，0.1mol/L PBS(pH＝6.8)洗涤后，菌体重悬于PBS中，将菌液浓度调至OD₆₀₀为1.0，得到活菌悬液。将活菌悬液在100℃下煮沸20min，得到灭活菌悬液。

胞外上清液(CFS)制备：将上述制备的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，收集菌体，用PBS洗涤后菌体重悬于PBS中，将菌液浓度调至OD₆₀₀为1.0，37℃、180r/min条件下震荡培养24h；在4℃、10000r/min条件下离心10min收集上清，利用0.22μm滤膜过滤后即得胞外上清，于4℃冷藏备用。

胞内提取物(CFE)制备：将上述制备的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，收集菌体，PBS洗涤后菌体重悬于PBS中，将菌液浓度调至OD₆₀₀为1.0，加入溶菌酶，于37℃反应3h后，在冰浴条件下超声破碎；将超声破碎液在4℃、10000r/min条件下离心10min，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤后得到无细胞提取液，于4℃冷藏备用。

3、实验方法：

采用上述制备得到的各组发酵上清液、灭活发酵上清液、活菌悬液、灭活菌悬液、胞外上清液、胞内提取物，分别吸取25μL样品与25μL 20mmol/L PNPG加入96孔板中，于37℃下孵育10min，取出，然后加入α-葡萄糖苷酶溶液(0.2U/mL)50μL，在37℃下反应20min，取出，加入100μL 0.1mol/L Na₂CO₃终止反应，于405nm波长下测定其吸光度。阿卡波糖作阳性对照。

对α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下所示：

其中：A：含有α-葡萄糖苷酶不含样品的吸光度；B：不含α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度；C：含有α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度；D：含有样品但不含α-葡萄糖苷酶的吸光度。

4、实验结果：

测定结果如图6所示，阿卡波糖阳性对照组的α-葡萄糖苷酶的抑制率菌为100％，植物乳植杆菌LY4发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为96％，灭活发酵上清液的抑制率为90％，活菌悬液的抑制率为14％、灭活菌悬液的抑制率为7％，胞外上清液的抑制率为15％、胞内提取物的抑制率为6％。可见，植物乳植杆菌LY4不同成分均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

为了进一步说明植物乳植杆菌LY4发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，对植物乳植杆菌LY4发酵上清液做时间梯度实验，分别培养8h、24h、48h、72h，结果如图7所示，在发酵8h时，植物乳植杆菌LY4发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为4.65％，在发酵24h时的抑制率达到了91.48％，在48h时抑制率为92.17％，在72h时抑制率为93.61％，表明植物乳植杆菌LY4在培养24h时就能达到一个较高的α-葡萄糖苷酶的抑制率，且随着培养时间的增加，抑制率越高。

进一步对植物乳植杆菌LY4发酵上清液做温度梯度实验，将培养24h后的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心l0min，收集上清液，利用0.22μm滤膜过滤后分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴锅中水浴30min，水浴结束后冷却至室温，测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，测定方法同上。

结果如图8所示，在20-100℃的不同温度下发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率未发生明显变化，抑制率在95％左右，说明发酵上清液具有较好的热稳定性，能够耐受高温。

进一步对植物乳植杆菌LY4发酵上清液进行蛋白酶处理，将培养24h后的发酵液在4℃、10000r/min条件下离心l0min，收集上清液，利用0.22μm滤膜过滤后分别使用胃蛋白酶和胰蛋白酶(终浓度均为1mg/mL)在37℃水浴3h，水浴结束后冷却至室温，测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，测定方法同上。

结果如图9所示，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的处理，发酵上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率未发生很大变化，未经过处理的发酵上清液抑制率为95.79％，经过胃蛋白酶处理的发酵上清液抑制率为96.54％，经过胰蛋白酶处理的发酵上清液抑制率为93.72％，说明可以排除发酵液中抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分为蛋白质类物质。

实施例4植物乳植杆菌LY4的抑制α-淀粉酶活性

1、样品准备：

实验样品：LY4菌株的发酵上清液、灭活发酵上清液、活菌悬液、灭活菌悬液、胞外上清液、胞内提取物、阿卡波糖组、PBS组、MRS组的制备方法同实施例3。

2、实验方法：

将淀粉培养基倾倒少量到无菌平板中，凝固后，用镊子将牛津杯放置培养基表面，再次将培养基倒入平板，凝固后取出牛津杯。每个平板放置3个牛津杯。分别取上述样品50μL和50μL 1mg/Lα-淀粉酶溶液混合，加入到小孔中。其中，50μL PBS和50μLα-淀粉酶溶液混合为空白对照组；50μL MRS和50μLα-淀粉酶溶液混合为培养基阴性对照组；50μL阿卡波糖和50μLα-淀粉酶溶液混合为阳性对照组。置于37℃培养箱中培养24小时。取出，用稀碘液染色后观察，并使用游标卡尺测量透明圈大小。

3、实验结果：

不同样品组与α-淀粉酶的抑效果如图10所示，显示阿卡波糖阳性组对α-淀粉酶的抑制率为100％，无透明圈产生，发酵上清液组与灭活发酵上清液组同样无透明圈产生；活菌悬液组的透明圈直径为22mm；灭活菌悬液组的透明圈直径为23mm；胞外上清液组的透明圈直径为23mm；胞内提取物组的透明圈直径为23mm；MRS阴性对照组的透明圈直径为23mm、空白PBS对照组的透明圈直径为23mm，表明发酵液中的MRS成分对α-淀粉酶不存在抑制作用，对实验结果不产生干扰。植物乳植杆菌LY4的发酵上清液组和灭活发酵上清液组对α-淀粉酶的抑制效果与阿卡波糖相同，100％抑制了α-淀粉酶的酶活，而活菌悬液、灭活菌悬液、胞内代谢物和胞内提取物对α-淀粉酶无明显抑制效果。

实施例5植物乳植杆菌LY4对脂多糖的降解

1、样品准备：

将植物乳植杆菌LY4菌株活化后，吸取5mL培养好的菌液于去热源的离心管中，离心4000r/min，10min，离心后用无LPS的无菌水重悬3次洗去残留培养基，用无脂多糖的无菌水补足至5mL制备菌悬液，另外吸取上清液至去热源的试管中制备上清液。

2、实验方法：

分别取菌液上清液，菌液沉淀物置于TSB培养基内，准备TSB空白培养基，各加入1mL 90EU的脂多糖中，在37℃条件下分别反应0h和4h；分别取0h反应后溶液和4h反应后溶液分别稀释400倍、800倍以及1600倍稀释液，然后各取0.1mL的稀释后的溶液，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，采用中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测，同时建立标准曲线，采用0.005EU/mL、0.05EU/mL、0.5EU/mL和5EU/mL浓度的标准内毒素，每一浓度内毒素溶液至少3个平行孔，阴性对照平行2孔，检测的结果取三个平行处理的结果平均值。

3、实验结果：

植物乳植杆菌LY4发酵上清液对脂多糖的降解效果如图11所示，在4h对101EU/mL的脂多糖去除率达到29.91％，效果显著(p≤0.01)，说明植物乳植杆菌LY4发酵上清液能够起到降解脂多糖的效果，能够降低炎症反应，辅助降血糖。

综上可知，本发明提供的植物乳植杆菌LY4对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶都具有良好的抑制效果，能通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性减缓糖类的转化和吸收，同时能降解脂多糖，降低餐后血糖水平，从而抑制餐后高血糖，缓解糖尿病，对糖尿病的预防与治疗有积极作用，能够应用于降低血糖水平的产品中。目前，植物乳植杆菌已被多个国家或地区列入可食用菌名录中，安全性高，可促使植物乳植杆菌以多种多样的产品形式呈现在糖尿病患者面前，给予他们更多的治疗选择，这无论在糖尿病患者血糖控制方面还是其保持健康良好的心理状态都有积极的意义，此外，植物乳植杆菌发酵条件简单、易于产业化、成本低，将是一株市场潜力巨大的益生菌株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株多功能植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LY4菌株，其特征在于，该菌株于2023年4月19日保存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：GDMCC NO:63373。

2.权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液在以非疾病诊断治疗为目的的抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶中的应用。

3.权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液在以非疾病诊断治疗为目的降解脂多糖中的应用。

4.权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液在制备抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的产品中的应用。

5.权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液在制备降解脂多糖的产品中的应用。

6.权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液在制备缓解或治疗糖尿病产品或控制血糖产品中的应用。

7.一种α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂，其特征在于，含权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液。

8.一种缓解/治疗糖尿病或控制血糖的产品，其特征在于，含权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液。

9.根据权利要求7所述抑制剂或权利要求8所述产品，其特征在于，所述LY4菌株浓度不低于2×10⁹cfu/mL。

10.一种非疾病诊断治疗为目的的抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶、降解脂多糖的方法，其特征在于，采用权利要求1所述植物乳植杆菌LY4菌株和/或其菌液对样品进行处理。