CN116622816A

CN116622816A - 聚合酶链式反应检测***

Info

Publication number: CN116622816A
Application number: CN202310686840.7A
Authority: CN
Inventors: 尼沙·吉恩; 约翰·E·霍尔梅
Original assignee: LGC Genomics Ltd
Current assignee: LGC Genomics Ltd
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2023-08-22
Also published as: MY182547A; CY1123180T1; ES2795679T3; NZ711109A; GB2515990B; US10155975B2; RS60515B1; GB2515990A; GB201304030D0; BR112015021615B8; SI2964784T1; AU2014224378A1; LT2964784T; ZA201505950B; PL2964784T3; EP2964784A1; AU2014224378B2; CA2902920A1; PT2964784T; CN105051212A

Abstract

本发明涉及用于测定***中的核酸检测的方法和试剂盒。

Description

聚合酶链式反应检测***

本申请是申请日为2014年3月5日、申请号为201480012662.9、发明名称为“聚合酶链式反应检测***”的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于测定***中的核酸检测的方法和试剂盒。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)是用于靶核酸序列的快速扩增的强有力的方法。PCR已经促进了基因表征(包括基因表达和/或调控)和分子克隆技术(包括PCR扩增的DNA的直接测序、等位变异的确定和感染性和遗传性疾病紊乱的检测)的发展。PCR是通过重复以下循环进行的：含有靶序列的DNA模板的热变性、相对引物与互补DNA链的退火和用DNA聚合酶对退火的引物进行延伸。多个PCR循环导致由侧翼扩增引物界定的核苷酸序列的扩增。向PCR操作步骤中引入热稳定性DNA聚合酶避免了重复添加酶的需要并允许退火和引物延伸温度的升高，其增强了引物:模板结合的特异性。因此，热稳定性聚合酶(诸如Taq DNA聚合酶)用于提高PCR的特异性和简便性。

在许多基于PCR的扩增中，采用了信号产生***，例如来检测所扩增的产物的产生。在基于PCR的反应中使用的一类信号产生***是荧光共振能量转移(FRET)***，其中核酸探测器包括荧光供体和受体基团。FRET标记***具有许多优于其他标记***的优点，包括进行均相测定的能力，在该测定中不需要分离结合的和未结合的标记核酸探测物的步骤。许多现有技术的主要问题与双荧光标记的寡核苷酸的合成有关。欧洲专利申请EP1726664公开了一种检测***，其通过使用不同熔融温度(Tm)的单标记的寡核苷酸序列来克服该问题，所述序列在自由溶液中互相杂交以形成荧光淬灭对(荧光团/淬灭剂盒)，一旦向所述序列之一引入互补序列则产生可测量的信号，所述序列之一具有低于所述PCR方法的退火温度(Ta)的Tm。在该***中，所述单标记的寡核苷酸序列之一优选比其它的长超过10碱基并且更优选长至少15个碱基。

在使用标记的核酸探测物的检测***中，高保真扩增是关键。由于PCR方法和TaqDNA聚合酶的性质，这样的方法可能遭受期望的聚合反应之外的替代性的副反应。例如，当该反应在室温进行时PCR可能遭受非特异性扩增。Taq聚合酶在所有温度下均保持其部分活性并因此能够延伸没有发生互补退火的引物，导致不期望的产物的形成。然后新合成的区域作为模板而进一步引物延伸和合成不期望的扩增产物。但是，如果在聚合开始之前将反应加热至大约50℃或更高的温度，则增加了引物退火的严格性，并且避免或减少了不期望的PCR产物的合成。

引物二聚体也是影响PCR的常见副反应。由于引物互相杂交并延伸，发生了引物二聚体的积累。引物二聚体的形成导致试剂耗尽并因此导致PCR效率的总体下降和/或假阳性结果的产生。

热启动PCR是减少非特异性扩增的方法并因此限制了包括引物二聚体的非特异性PCR产物的形成。已经开发了许多不同的方法来实现；参见例如Moretti,T.etal.Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq GoldDNApolymerase.BioTechniques 25,716–22(1998)和Hot Start PCR with heat-activatable primers:a novel approach for improved PCR performance NucleicAcids Res(2008)36(20):e131。这样的方法减少了PCR开始之前非特异性杂交之后的引物延伸。但是，这样的技术仅部分解决了这样的问题，因为在PCR扩增期间仍然可能发生包括引物二聚体形成的错误引发(mis-priming)事件(尽管已经为更少的程度)。使用PCR探针检测PCR引物内部的序列的存在有助于阻止任何这样的非特异性产物的检测但给该过程增加了显著的费用，因为每个所要被检测的单独序列都需要专用探针。成本划算的高通量遗传分析需要使用通用检测***但原则上这会被非特异性扩增产物的检测所影响。

需要易于合成、费用低并且可靠的特异性检测***用于引物延伸产物的检测中(例如在均相PCR测定中)，其解决了现有用于PCR的检测***所遇到的问题。术语均相PCR测定是本领域公知的，并且是不必物理上互相分离反应成分以得到反应结果的测定。本发明是基于以下发现：互相杂交形成荧光淬灭对的标记的寡核苷酸序列的相对长度的选择导致核酸检测测定***的改良，特别是当被用于实时背景(setting)下时。在本发明中，荧光团/淬灭剂盒的Tm被设计为大于扩增的Ta，使得任何没有掺入的荧光寡核苷酸与淬灭剂寡核苷酸在荧光获取温度进行杂交，使反应被实时监测或在终点进行监测。通过调整淬灭剂寡核苷酸的长度和Tm，可以预期的是提高的荧光团/淬灭剂盒的稳定性将简单地抑制PCR。但是，意外地发现来自荧光引物的扩增的特异性得到提高，如在实时情况下样品和无模板对照之间的Cq值(也称为Ct值)的差异的显著增加所显示，或者在终点应用中无模板对照的降低的检测所显示。

发明概述

本发明提供一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集，每个引物集的特征在于

i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其具有靶特异性部分(portion)和5'上游荧光盒特异性部分，以及

ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，

其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适合于在相应靶核苷酸序列的互补链上的杂交以允许引物延伸产物的形成，例如PCR产物，

并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交；

b)提供一个或多个盒(cassette)寡核苷酸集，每个集的特征在于

i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(moiety)(供体部分)标记，并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交的序列，以及

ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记，

其中每个盒寡核苷酸集互相杂交形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有TmA；

c)起始引物延伸反应，从而产生与相关的第一寡核苷酸引物互补的序列(如果存在相关的靶多核苷酸)，

这样，相关的第二(受体，例如淬灭剂，被标记)盒寡核苷酸与相关的第一(荧光标记)盒寡核苷酸杂交的能力较低，藉以产生信号；以及

d)检测所产生的信号，

其中所述引物延伸反应至少部分在小于一个或多个荧光淬灭对的Tm A的Ta进行。

本发明还提供了用于这样的方法的合适的试剂盒。

附图简述

图1是用于在实施本发明方法的SNP基因分型中检测DNA序列的简单反应流程图。

图2显示使用如下面实施例2中所述的测定所产生的数据。用于荧光团/淬灭剂盒5(左图)和荧光团/淬灭剂盒1(右图)的扩增产物的实施例基因分型数据。在每个实施例中存在的三个簇代表了能被检测的三种可能的基因型。无模板对照由黑实线表示并且为了清晰而圈上。

图3显示使用如下面实施例3中所述的测定所产生的数据。用于荧光团/淬灭剂盒5(左图)和荧光团/淬灭剂盒1(右图)的扩增产物的实施例基因分型数据。在每个实施例中存在的两个簇代表能被检测的两种可能的基因型。无模板对照由黑实线表示并且为了清晰而圈上。

图4显示使用如下面实施例4中所述的测定所产生的数据。

用于荧光团/淬灭剂盒1-4的扩增产物的实施例基因分型数据。在所有情况下，在不存在无模板对照检测的情况下等位基因特异性扩增得到证实。无模板对照由黑实线表示并且为了清晰而圈上。

图5显示用于本发明的可能的寡核苷酸组合的图解例。用于分析基因的多个等位基因所示的反向引物可以是常见的，但并不必须为常见的。

发明详述

本发明第一个方面提供一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，

并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交；

b)提供一个或多个盒寡核苷酸集，每个引物集的特征在于

i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记，并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交的序列，以及

ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记，

这样，相关的第二(受体，例如淬灭剂，被标记)盒寡核苷酸不太能够与相关的第一(荧光标记)盒寡核苷酸杂交，藉以产生信号；以及

d)检测所产生的信号，

该信号可被实时测量。备选地，该信号可以在反应的终点进行测量。

用荧光部分标记的所述或第一盒寡核苷酸可以能够作为引物延伸反应的引物(例如可以具有3’OH基团)。备选地，用荧光部分标记的所述或第一盒寡核苷酸可以不能够作为引物延伸反应的引物(或者其是否能够作为引物不是重要的)。据认为，如果用荧光部分标记的所述或第一盒寡核苷酸能够作为所述引物延伸反应的引物，则通常形成更多的引物延伸产物，并因此获得更好的信号。受体/淬灭剂标记的荧光盒寡核苷酸可以通常不能用作引物延伸反应的引物，例如因为所述受体/淬灭剂可以阻止所述寡核苷酸作为引物。

寡核苷酸的Tm是这样的℃形式的温度：在该温度时单链寡核苷酸群体中50％的分子与其互补序列杂交并且该群体中50％的分子没有与所述互补序列杂交。(例如)荧光淬灭对的Tm可以根据经验进行测量，例如可以使用熔解曲线分析，例如使用Roche LightCycler480仪器在96孔白板上测量Tm。可以优选使用如进行所述引物延伸反应所使用的同样的仪器测量所述Tm。可以在没有聚合酶的情况下在标准反应缓冲液中测试所述荧光淬灭对(盒)的Tm。标准反应缓冲液示于实施例中。进一步的代表性细节也提供于实施例中。通过LightCycler 480分析函数(-dF/dt)可以从熔解曲线数据产生熔解峰。通过使用手动Tm选项鉴别反向熔解峰中的最低点来计算Tm。

当提及用于涉及寡核苷酸的部分的杂交的Tm时，相关Tm被认为是针对使用与第一寡核苷酸的相关部分对应的测试寡核苷酸的杂交能够确定的Tm。

荧光淬灭对(一对或多对)的Tm(Tm A)优选比引物延伸反应的Ta高小于或等于15℃，例如高小于或等于10℃，例如，比引物延伸反应的Ta高1至15℃，诸如高1至10℃。所选择的Tm A应当足够高以防止非特异性检测同时应当足够低以不抑制检测(被认为是通过抑制引物延伸反应而抑制)。术语Ta是本领域技术人员熟知的，并且是指这样的温度(通常设置或编程入控制反应参数的设备)：在引物延伸反应过程中在该温度下发生显著扩增。通常同样的Ta将基本上被用于整个引物延伸反应。有时，不同的Ta(通常更高)会被用于引物延伸反应的最初几轮。荧光淬灭对(如果使用多个荧光淬灭对，则为多个荧光淬灭对)的Tm通常高于在引物延伸反应过程期间所使用的任何Ta，或高于引物延伸反应的占优势的循环所使用的Ta，例如比所述引物延伸反应的最高或占优势的Ta高小于或等于15℃，例如高小于或等于10℃，例如比所述引物延伸反应的最高或占优势的Ta高1至15℃，诸如高1至10℃。通常所述Ta可以在大约46和65℃之间，例如在50和60℃之间。

在本发明中，标记的荧光盒寡核苷酸对(或所述引物寡核苷酸)的一个或二者可以含有修饰的碱基，如硫代磷酸酯修饰的碱基。在任何给定的寡核苷酸/引物中被硫代磷酸酯所取代的磷酸二酯键的数量范围可以从无到所有的磷酸二酯键被硫代磷酸酯所取代，例如一个、两个、三个、四个或更多个。所述寡核苷酸/引物可以在5’和/或3’末端含有硫代磷酸酯，但是优选的是，作为此类末端修饰的替代或除了此类末端修饰外，寡核苷酸/引物的至少一个内部碱基为硫代磷酸酯。例如所述碱基的10-90％、20-80％、30-70％或40-60％可以为硫代磷酸酯。在一个实施方案中，所述硫代磷酸酯修饰的碱基(其中有多于一个)被至少一个(例如一个至三个)未修饰的(磷酸二酯)碱基所分开，例如在所述寡核苷酸/引物内的替代碱基可以为硫代磷酸酯。在一个例子中，所述荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸或寡核苷酸含有硫代磷酸酯修饰的碱基可能是特别有用的。据认为，硫代磷酸酯修饰的碱基的存在可有助于减少异常产物的形成，所述异常产物可以产生荧光并因此导致产生错误的荧光信号。参见例如PCT/GB2012/050645，讨论硫代磷酸酯掺入模式，其也被认为相对于本发明是有用的。

在本发明的方法中产生的信号可以通过测量在所述引物延伸反应过程中或之后的任一点的信号来进行检测。所述信号的测量可以是定性的或定量的。不认为有必要为了能够测量所述信号而必须专门适应所述反应的温度。可以在所述引物延伸反应的正常过程期间检测所述信号。

本发明可用于各种不同应用，并且特别适用于基于PCR的反应，以及用于包括SNP检测应用、等位基因变异检测应用、基因表达研究、拷贝数变异研究、实时和终点PCR等的应用。

如上所示，本发明可用于模板依赖性引物延伸反应和用于确定引物延伸反应混合物中引物延伸产物的产生，例如检测引物延伸产物是否在引物延伸反应中产生。引物延伸产物是指由模板依赖性引物延伸反应所得到的核酸分子。模板依赖性引物延伸反应是这样的反应，其中聚合酶延伸与模板核酸分子杂交的核酸引物分子，其中加到所述引物核酸分子末端的碱基的序列由所述模板链中碱基的序列确定。模板依赖性引物延伸反应既包括扩增又包括非扩增的引物延伸反应。在本发明的一些实施方案中，其中检测到引物延伸产物的产生的所述模板依赖性引物延伸反应是扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)。

可以使用本发明的方法鉴定的核酸靶标包括任何含有核酸的靶标，诸如天然DNA或RNA。在适当的情况下所述核酸包括这样的序列：所述序列包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物，诸如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙叮基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤；或者它们可以含有PNA。

尽管这不是通常情况，但是在本发明的方法中所使用的寡核苷酸可以适当地包括这样的碱基类似物或PNA。

在实践本发明的方法时，第一步是产生引物延伸混合物，例如包括发生引物延伸反应所必需的所有元素的组合物。在一个例子中，所述引物延伸混合物通常包括至少一对标记的寡核苷酸(所述盒寡核苷酸集)用于引物延伸反应，所述寡核苷酸互相杂交形成荧光淬灭对，其中一个寡核苷酸用荧光部分进行标记并且另一个寡核苷酸用淬灭部分进行标记，其中所述荧光淬灭对具有大于所述引物延伸反应的Ta的Tm(Tm A)。每集的荧光标记的寡核苷酸包含能够与特定组的每个引物集的第一寡核苷酸引物(正向引物)的5’上游荧光盒特异性区域的互补物杂交的序列。组中正向引物的每一个均具有(通常不同的)靶特异性部分和(通常相同或密切相关的)5’上游荧光盒特异性部分。一旦引入(例如当特定引物集的引物所指向的靶核酸存在时，通过所述引物延伸反应过程)所述5'上游荧光盒特异性部分(所述荧光标记的荧光盒寡核苷酸能够与其杂交)的互补序列，则产生可检测的信号，原因是受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸结合并淬灭来自荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸的信号的能力较低。随着引物延伸反应进行并且荧光标记的荧光盒寡核苷酸能够杂交的延伸产物产生越多，一般产生的信号越强。

因此，除了荧光团结构域外，荧光标记的寡核苷酸还包含能够与给定组的第一寡核苷酸引物(正向引物)的5'上游尾部分(荧光盒特异性部分)的互补物杂交的序列。该“标签”序列结合核酸序列(延伸产物)，所述核酸序列作为反应中包含的标签引物的互补物而产生(其可以是未标记的，或者其可以例如在引物延伸反应的后续轮中为荧光标记的盒寡核苷酸本身)，例如在严谨杂交条件下，例如在引物延伸反应混合物中，温度为Ta或高于Ta，例如Tm温度至少为Ta。

如上所述，在特定组中的每一个第一寡核苷酸引物(正向引物)的荧光盒特异性部分或“标签”序列通常可以是相同的或密切相关的，例如为相同的长度或长度差别小于大约10个、更典型地5、4、3、2或1个核苷酸，并且在重叠区域互相具有至少大约80、85、90、更典型地至少大约95、96、97、98、99或100％的同一性。例如，可以有不超过3、2或1个不相同的核苷酸。可能最明确的是这些荧光盒特异性部分是相同的，但这并不是必须的，这样允许在寡核苷酸设计中具有更多的灵活性。

对于本领域技术人员明显的是，一个组的荧光盒特异性部分或标签序列或序列通常会与不同组的那些序列显著不同，从而一个组的荧光盒特异性部分和另一个组的荧光盒特异性部分的互补物之间实际上没有相关杂交。

除了受体结构域之外，受体部分标记的盒寡核苷酸能够与相应的荧光标记的盒寡核苷酸杂交从而形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有Tm A。

通常，荧光标记的盒寡核苷酸不包含靶序列特异性部分，即不包含与靶多核苷酸杂交(在引物延伸反应的Ta下)的序列，其中第一寡核苷酸引物的靶特异性部分旨在与所述靶多核苷酸杂交。因此，在这样的安排下，所述荧光标记的盒寡核苷酸不依赖于特定的靶序列但可以被用于(与合适的寡核苷酸引物集)检测由任一靶序列产生的引物延伸产物。荧光标记的盒寡核苷酸(和相应的受体/淬灭剂标记的盒寡核苷酸)可以被包含于“主(master)”测定混合物中，与(靶特异性)“测定”混合物并排使用。通常，所述受体/供体标记的盒寡核苷酸也不包含靶序列特异性部分。

通常，荧光标记的盒寡核苷酸由荧光部分(供体部分)和能够与第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物杂交的序列组成。通常，所述受体/淬灭剂标记的盒寡核苷酸由受体/淬灭剂部分和能够与荧光标记的盒寡核苷酸的荧光盒特异性部分杂交的序列组成。

可以期望的是，荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸之间的相互作用的稳定性低于荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和延伸产物之间的相互作用的稳定性，所述延伸产物与相关组的每个引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游荧光盒特异性部分互补。这样的安排可能用于在避免产生异常信号和允许引物延伸反应有效进行之间实现最佳平衡。因此，荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸之间的杂交的Tm可低于荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和延伸产物之间的杂交的Tm、Tm C(或多个Tm、多个Tm C)，其中所述延伸产物与相关组的每个引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游荧光盒特异性部分互补。因此，引物延伸反应的Ta低于荧光淬灭对的Tm A，Tm A可以低于Tm C(例如低大约1至10℃，所述Tm C即针对在荧光标记的寡核苷酸和要形成的引物延伸产物之间的杂交)。

需要注意的是，对于每个引物集可以(但不需要)有不同的Tm C，因此可具有与各组(的引物集)相关的多个Tm C以及与不同组相关的多个Tm C。通常，与特定组(的多个引物集)相关的Tm C高于相关荧光盒集的Tm A。通常，特定引物延伸反应中的所有Tm A高于该反应的Ta。通常，特定引物延伸反应的所有Tm C会在彼此的大约10、更通常是5、4、3、2或1℃内，通常，特定引物延伸反应的所有Tm A会在彼此的大约10、更通常是5、4、3、2或1℃内。

在一个例子中(例如当荧光标记的盒寡核苷酸不包含靶特异性序列)，淬灭剂标记的盒寡核苷酸比荧光标记的盒寡核苷酸短1至5个核苷酸碱基。通常，荧光标记的盒寡核苷酸的未配对(相对于淬灭剂标记的盒寡核苷酸)的部分位于荧光标记的盒寡核苷酸的3'端或淬灭剂标记的盒寡核苷酸的5'端“对面”。通常，相关寡核苷酸引物(或多个引物)的部分(其互补物与荧光标记的盒寡核苷酸杂交)是荧光标记的盒寡核苷酸长度的大约5个核苷酸以内(例如比其短5、4、3、2或1个核苷酸以及长5、4、3、2或1个核苷酸,例如相同长度)，例如通常在寡核苷酸引物和荧光标记的盒寡核苷酸的5'端具有任意长度差异。在随后几轮引物延伸反应中，荧光标记的盒寡核苷酸本身能够作为引物，因此在引物延伸过程中形成的互补物将通常延伸至荧光标记的盒寡核苷酸的5'端。因此，与淬灭剂标记的盒寡核苷酸杂交的互补物的部分通常与淬灭剂标记的盒寡核苷酸一样长。

在其它例子中，可选地或者除此之外，淬灭剂标记的盒寡核苷酸和荧光标记的盒寡核苷酸之间的错配比相关寡核苷酸引物(或多个引物)的互补物和荧光标记的盒寡核苷酸之间的错配多(或更显著)。正如对于本领域技术人员众所周知的是，错配在寡核苷酸对内的位置和错配的性质(例如A:T配对是否破坏或者是G:C配对)会影响错配对稳定性的改变/Tm的改变的重要性。

在又一些例子中，相对于在引物延伸反应混合物中所使用的那些，可选的或者额外的不同核苷酸/碱基可用于淬灭剂标记的盒寡核苷酸(并因此被掺入引物互补物中)，从而改变所述淬灭剂标记的盒寡核苷酸和所述荧光标记的盒寡核苷酸和引物延伸产物之间杂交的相对稳定性。通常，对于本领域技术人员明显的是，“非标准”碱基可以用于淬灭剂标记的盒寡核苷酸，“标准”碱基可以用于引物延伸混合物，但是其它安排也是可能的。

应当理解的是，在不同的安排中，如果荧光标记的盒寡核苷酸不仅包含“标签”序列，而且包含与要检测的靶核酸互补的序列(参见后文所述的“直接”实施方案)，那么与荧光标记的盒寡核苷酸具有“标签”序列但没有与要检测的靶核酸互补的序列的安排相比，荧光标记的盒寡核苷酸和延伸产物之间存在更长的互补性区域。认为在这种安排下，来源于被降低的荧光淬灭对的Tm A的益处较少，因此，不认为提供了特定的益处给例如与受体标记的盒寡核苷酸中的“标签”对应的区域，所述区域与荧光团标记的盒寡核苷酸相比较短或具有错配或具有不同的碱基组成。值得注意的是，这种安排(下文被称为“直接”安排)被认为是潜在有用的，但是意味着至少不同的荧光/供体标记的寡核苷酸是每个要检测的靶序列通常所需要的，而在之前(“间接”)的安排中没有靶特异性序列(例如能够在引物延伸反应的Ta下进行杂交)，没有必要针对每个要检测的靶序列(其中可以有成百或成千的可能性)合成不同的荧光/供体标记的寡核苷酸(或受体/淬灭剂标记的核苷酸)。在给定的引物延伸反应中，针对在该特定引物延伸反应中要被分析的每个靶序列，需要不同的荧光/供体标记的寡核苷酸(例如2、3、4或5，如下文所进一步讨论的)，但是同样集合的荧光盒寡核苷酸可能能够与任一靶序列一起使用。

根据寡核苷酸和测定本身的性质(例如是否使用“直接”或“间接”的安排)，至少荧光标记的盒寡核苷酸的“标签”区域可以与引物延伸产物的区域杂交。例如，当测定是SNP基因分型测定时，例如其中采用了通用(“间接”)盒报告***的测定时，所述标签区域在严谨条件下与引物延伸产物的标签区域杂交。

如上所述，在实例中，受体部分标记的盒寡核苷酸中的杂交区域可以短于(例如短1-5个核苷酸)与延伸产物杂交的荧光团标记的盒寡核苷酸中的序列，或者可以具有错配，或者不同的碱基类型，使得盒寡核苷酸之间杂交的Tm A低于荧光标记的盒寡核苷酸和延伸产物(或多个延伸产物)之间杂交的Tm C(或多个Tm C)。

当合适的荧光能量供体和能量受体部分彼此非常接近时，发生荧光能量转移。供体所吸收的激发能量被转移至受体，然后受体可以通过荧光发射(如果是荧光团)或通过非荧光手段(如果是淬灭剂)进一步消散该能量。供体-受体对包含两个具有重叠光谱的基团——荧光基团和荧光改性基团，其中供体(荧光基团)发射与受体(荧光改性)吸收重叠，使得从激发的荧光团向该对中的其它成员存在能量转移。因此，本发明的标记的寡核苷酸对(荧光盒寡核苷酸集)是核酸检测物，其在单独的寡核苷酸上包括荧光团结构域(荧光能量供体(即供体)定位于此)和具有受体结构域的第二寡核苷酸(荧光能量受体(即受体)定位于此)。如上所述，供体寡核苷酸包括供体荧光团。供体荧光团可以被定位于核酸检测物的任一位置，但是通常存在于所述寡核苷酸的5'端。

受体结构域包括荧光能量受体。所述受体可以被定位于受体结构域的任一位置，但是通常存在于所述寡核苷酸的3'端。

在本发明中，在一对标记的寡核苷酸中，每个盒寡核苷酸可以含有一个或多个标记，例如1、2或3个标记。所述盒寡核苷酸中的一者或二者均优选含有单个标记，更优选所述寡核苷酸的二者均含有单个标记。

例如，荧光标记的盒寡核苷酸优选含有位于所述寡核苷酸的5'端或内部的标记并且淬灭剂标记的盒寡核苷酸含有位于所述寡核苷酸的3'端或内部的标记。

可以选择用于标记的寡核苷酸对的荧光团，从而使所述荧光团来自类似的化学家族或不同的化学家族，诸如花青染料、氧杂蒽(xanthene)等。感兴趣的荧光团包括但不限于荧光素染料(例如5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、2',4',1,4,-四氯荧光素(TET)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(HEX)和2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE))、花青染料如Cy5、丹酰衍生物、罗丹明染料(例如四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)和四丙醇-6-羧基罗丹明(ROX))、DABSYL、DABCYL、花青如Cy3、蒽醌、硝基噻唑和硝基咪唑化合物或其它非嵌入染料。在国际专利申请WO 01/42505和WO 01/86001中进一步描述了感兴趣的荧光团。

如果使用了超过一个引物组(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)和因此若干个盒寡核苷酸集，所述荧光团组可以典型地针对所述1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)盒寡核苷酸对而不同。所述受体(例如淬灭剂)组可以相同或不同，只要它们能够以令人满意的形式调控所配对的荧光团组的荧光。通常，1、2、3或4个不同引物组(每个引物组可具有一个或多个引物集，通常为一个引物集)并因此可在单个反应管中使用1、2、3或4个盒寡核苷酸集。限制因素可以是可区分的不同光谱的数量，这可能取决于可用荧光产生/测量设备的特征。选择相容的荧光团和受体/淬灭剂集时的考虑因素是本领域技术人员已知的。

在本发明的方法中,在引物延伸反应中所采用的聚合酶包括至少一个A家族聚合酶,其中术语“A家族”和“B家族”对应于Braithwaite&Ito,Nucleic Acids Res.(1993)21:787-802中所报道的分类方案。感兴趣的A家族聚合酶包括：栖热水生菌(Thermusaquaticus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物，如Klentaq(如Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220中所述)；栖热嗜热菌(Thermusthermophilus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物等。用于本发明的聚合酶可以纯化的或未纯化的形式使用。通常，聚合酶缺乏外切酶活性。对于本领域技术人员明显的是，这样可以提供更好的特异性，例如在SNP分型测定中。

在所述方法的第一步中所产生的反应混合物的另一成分是模板核酸。作为模板的核酸可以是单链的或双链的，其中核酸通常为脱氧核糖核酸(DNA)。模板核酸的长度可以短至20bp，但通常至少长大约50或100bp，并且更通常至少长大约150bp，并且可以长至1,000或10,000bp或更长，例如长50,000bp或更长，包括基因组DNA提取物、其消化物或粗裂解物等。所述核酸可以游离于溶液中，在一端或两端侧接非模板核酸，存在于载体(例如质粒等)中，唯一的标准是所述核酸可参与所述引物延伸反应。模板核酸可以纯化的形式存在，或者与其它非模板核酸以复杂混合物的形式(例如以细胞的DNA制剂的形式)存在。

根据实施PCR的应用，模板核酸可以源自各种不同来源，其中此类来源包括含有核酸的生物，即病毒；原核生物，例如细菌、古细菌和蓝藻；以及真核生物，例如原生动物界的成员，诸如鞭毛虫、变形虫及其近亲、类变形虫寄生虫、纤毛虫等；真菌界的成员，诸如粘菌、无细胞粘菌、细胞粘菌、水霉菌、真粘菌(true mold)、接合真菌、囊真菌(sac fungi)、担子菌(club fungi)、半知菌等；植物，诸如藻类、苔藓类、苔类、金鱼藻、石松、问荆、厥类、裸子植物和有花植物、单子叶和双子叶植物；以及动物，包括海绵、腔肠动物门，例如水母、珊瑚等，栉水母，蠕虫，轮虫，蛔虫，环节动物，软体动物，节肢动物，棘皮动物，柱头虫和脊椎动物，包括爬行类、鱼类、鸟类、蛇类和哺乳动物，例如啮齿类、灵长类，包括人。如本领域已知的，模板核酸可以从其天然存在的来源直接使用，例如作为粗裂解物和/或可以许多不同的方式对其进行预处理。在一些实施方案中，模板核酸可以来自合成的来源。

在本发明方法的第一步中所产生的反应混合物的一个成分是在引物延伸反应中所采用的引物，例如PCR引物(诸如在几何扩增中所采用的正向和反向引物)。正如早已指出的，可以使用一个或多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集。每个引物集可通常具有正向和反向引物。如上所述，通常可以使用1、2、3、4或更多个引物组。每组可通常包括一个引物集(除非例如有原因希望测量由两个单独的引物集所产生的合并的扩增产物)。在SNP基因分型反应的情况下，每个引物延伸反应混合物通常会包含至少一个正向引物且通常包含两个或三个正向引物且更通常包含五个或七个正向引物。还可存在针对每个正向引物的相应的反向引物，但是这些反向引物可不存在差异，例如在SNP基因分型反应中，通用反向引物可以与数个不同的正向引物一起使用。引物延伸反应混合物会包含至少一个荧光标记的(供体)引物和一个互补受体、淬灭剂标记的寡核苷酸(其通常不能用作引物，例如原因是淬灭剂位于3'端并阻止寡核苷酸能用作引物)。

更通常地，例如在指数扩增的情况下，引物延伸混合物可通常包含至少一个荧光/供体标记的引物和一个互补受体/淬灭剂标记的寡核苷酸，以及一个反向未标记的引物，其中所述寡核苷酸或引物之一或任意一个均可以含有至少一个改性的基团(例如硫代磷酸酯)。最通常地，在使用通用报告***指数扩增的情况下，引物延伸混合物会包含至少一个荧光受体标记的引物和一个互补供体、淬灭剂标记的寡核苷酸、一个反向未标记的引物和一个未标记的加标签的正向引物。所述引物可以长至少15bp，例如长至少20bp或22bp。引物可以长30bp或更长，例如引物的长度可以是18-60bp，诸如长约20-35bp。加标签的引物通常会比荧光盒寡核苷酸长(因为其通常会需要含有标签序列，所述标签序列足够长以在引物延伸反应的Ta下与其互补物杂交；以及靶序列特异性部分，所述靶序列特异性部分具有足够长度以在引物延伸反应的Ta下与其互补物杂交)或比所述(通常未加标签的)反向引物更长。

可以期望的是，相对于荧光团标记的盒寡核苷酸，在引物延伸反应中(并因此在开始所述引物延伸反应之前在反应混合物中)存在过量的受体标记的盒寡核苷酸。在盒寡核苷酸集中受体标记的盒寡核苷酸与荧光团标记的盒寡核苷酸之间的比例至少是1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1或5:1(例如在1:1和10:1或15:1之间、例如在1.5:1和5:1之间)时，对于优化获得的信号和/或最小化在“无模板对照”(NTC)中所产生的信号是有用的。

如本文所使用的，“核酸”是指DNA、RNA(单链或双链)及其任意化学修饰。修饰包括但不限于提供其它化学基团的那些修饰，所述化学基团给核酸掺入额外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能性。这样的修饰包括但不限于2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘尿嘧啶的取代；骨架修饰，甲基化，非常见碱基配对组合，如异碱基、异胞苷和异胍等。修饰还可以包括3'和5'修饰，如加帽。

如本文所使用的，“互补”是指含氮碱基对(由通过氢键与嘧啶连接的嘌呤组成)，其连接DNA的互补链或含DNA和RNA的杂交分子。

如本文所使用的，“荧光基团”是指当用具有选定波长的光激发时发射不同波长的光的分子。荧光基团还可以被称为“荧光团”。

如本文所使用的，“荧光改性基团”是指能够以任意方式改变来自荧光基团的荧光发射的分子。荧光改性基团一般通过能量转移机制实现这一点。根据荧光改性基团的情况，荧光发射可以进行许多改变，包括但不限于衰减、完全淬灭、增强、波长转变(shift)、极性转变、荧光寿命的变化。荧光改性基团的一个例子是淬灭基团。

如本文所使用的，“能量转移”是指这样的过程：荧光基团的荧光发射通过该过程而被荧光改性基团改变。如果荧光改性基团是淬灭基团，那么来自荧光基团的荧光发射被削弱(被淬灭)。能量转移可通过荧光共振能量转移或通过直接能量转移发生。在这两种情况下的确切能量转移机制是不同的。应当理解的是，在本申请中提及能量转移时涵盖了所有机制上不同的现象。在本文中能量转移也被称为荧光能量转移或FET。

如本文所使用的，“能量转移对”是指参与能量转移的任意两个分子。通常，所述分子之一作为荧光基团，并且另一个作为荧光改性基团。例如，这样的对可以包含两个荧光基团(其可以互相不同)和一个淬灭基团，两个淬灭基团和一个荧光基团，或者多个荧光基团和多个淬灭基团。在有多个荧光基团和/或多个淬灭基团的情况下，个体荧光和/或淬灭基团可以互不相同。本发明的优选的能量转移对包含荧光基团和淬灭基团。在一些情况下，荧光基团和荧光改性基团之间的区分可能是模糊的。例如，在某些情况下，两个相邻荧光素基团可以经直接能量转移而淬灭互相的荧光发射。因为这个原因，在本申请中对所述能量转移对的个体成员的身份没有限制。所有需要的是，如果个体成员之间的距离发生某种临界量的改变，能量转移对的光谱性质作为整体以某种可测量的方式发生改变。

如本文所使用的，“引物”是指当置于能够发生与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，能够作为合成起点的寡核苷酸。因此，能够作为引物的寡核苷酸通常可以具有3'OH基团。

如本文所使用的，“淬灭基团”是指能够至少部分衰减由荧光基团所发射的光的任何荧光改性基团。在本文中我们称这种衰减为“淬灭”。因此，在淬灭基团存在下的荧光基团发光产生了比所预期的强度更低或者甚至完全不存在的发射信号。淬灭通过荧光基团和淬灭基团之间的能量转移而发生。

如本文所使用的，“荧光共振能量转移”或“FRET”是指其中由被激发的荧光基团所发射的光至少部分地被荧光改性基团吸收的能量转移现象。如果荧光改性基团是淬灭基团，那么该基团或者可以放射出所吸收的光作为不同波长的光，或者可以作为热将其消散。FRET取决于荧光基团的发射光谱和淬灭基团的吸收光谱之间的重叠。FRET还取决于淬灭基团和荧光基团之间的距离。高于某一临界距离，淬灭基团不能吸收由荧光基团发射的光，或者仅能极少吸收。

如本文所使用的，“加尾引物”是指含有至少两个结构域的寡核苷酸，一个特异性针对感兴趣的靶核酸(例如DNA)，即能够与所述靶核酸杂交，另一个序列(典型地靶特异性序列的5'端)作为产生包含“标签”序列的互补物的延伸产物的模板。然后所述“标签”序列的互补物可以结合例如相应荧光标记的盒寡核苷酸的“标签”部分(其可以缺少除了“标签”部分之外的任何序列)。加标签的引物还可以包含额外的区域，诸如在上文所述的两个结构域和/或标签之间的接头。

如本文所使用的，“直接能量转移”是指其中不发生在荧光基团和荧光改性基团之间的光子传递(passage)的能量转移机制。不受限于单个机制，认为在直接能量转移中，荧光基团和荧光改性基团干扰彼此的电子结构。如果荧光改性基团为淬灭基团，这会导致淬灭基团阻止荧光基团发射光。

一般而言，通过直接能量转移的淬灭比通过FRET的淬灭更有效。实际上，不通过FRET淬灭特定荧光基团的一些淬灭基团(因为它们与荧光基团不具有必需的光谱重叠)能够通过直接能量转移而有效进行淬灭。此外，如果足够接近其它荧光基团而引起直接能量转移时，一些荧光基团本身能够作为淬灭基团。例如，在这些情况下，两个相邻荧光素基团可以有效淬灭彼此的荧光。由于这些原因，对于可用于实施本发明的荧光基团和淬灭基团的性质没有限制。

当提及“杂交”或寡核苷酸和/或引物与另一个核苷酸序列“杂交”的能力时，本领域技术人员可以理解的是这样的杂交能够在模板延伸反应中常见的条件下发生，所述模板延伸反应是例如PCR反应，在其中利用了寡核苷酸和/或引物。

本发明还提供一种用于检测引物延伸产物的方法中的试剂盒，所述方法包括以下步骤：

a)两个或更多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集，每个引物集的特征在于

i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其具有靶特异性部分和5'上游荧光盒特异性部分，以及

ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，

其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适用于在相应靶核苷酸序列的互补链上的杂交以允许形成引物延伸产物，例如PCR产物，

并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物杂交；以及

b)两个或更多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于

ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记，

其中每集的盒寡核苷酸互相杂交形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有TmA，

其中所述荧光淬灭对的各Tm A均高于适合用作使用所述试剂盒的寡核苷酸的引物延伸反应的Ta的温度，例如高于在46和65℃之间的温度，例如在50和60℃之间的温度。

第一寡核苷酸引物可以通常为未标记的。所述荧光标记的盒寡核苷酸通常不含有靶特异性序列。荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸之间的杂交的Tm A可以低于荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和延伸产物之间的杂交的Tm、Tm C(或多个Tm、多个Tm C)，其中所述延伸产物与相关组的各引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游荧光盒特异性部分互补。所述淬灭剂标记的盒寡核苷酸可以比所述荧光标记的盒寡核苷酸短1至5核苷酸碱基。

寡核苷酸和引物延伸反应的进一步偏好如上所述。

本发明的试剂盒还可以含有聚合酶和/或适用于引物延伸反应的其它成分，如二价阳离子(例如源自镁盐)、脱氧核糖核苷酸5'三磷酸(dNTP)、缓冲剂等。

所述试剂盒可以包含第一容器中的一个或多个盒寡核苷酸，任选地其中所述第一容器包含用于进行引物延伸反应的其它成分，诸如缓冲液、热稳定DNA聚合酶，并且任选地其中所述第一盒寡核苷酸不含有靶特异性部分；和在分开的进一步的容器或多个容器中的一个或多个寡核苷酸引物组。

本发明又一个方面提供一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)第一标记的寡核苷酸引物(正向引物)，其具有靶特异性部分和5'上游荧光盒特异性部分，以及

ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，

b)提供一个或多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于

i)用荧光部分(供体部分)标记的第一盒寡核苷酸(一个或多个)，其是引物组的第一标记的寡核苷酸引物(一个或多个，正向引物)，

ii)用受体部分(例如淬灭剂部分)标记的第二盒寡核苷酸，

其中每集盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有TmA；

c)起始引物延伸反应，从而产生相关第一寡核苷酸引物的互补序列(如果存在相关的靶多核苷酸)，

d)检测所产生的信号，

这可以通过“直接”检测方法确定。

本发明的方法或试剂盒被认为可用于各种情况，例如用于基于等位基因特异性PCR的SNP基因分型、基因表达研究或拷贝数变异研究。

本发明的用途包括以下例子：

PCR产物的直接(实时)检测：

该实施方案利用荧光标记的加尾寡核苷酸引物来启动PCR过程并产生荧光。因此，第一寡核苷酸引物和用荧光部分标记的相应的第一盒寡核苷酸通常相同。该引物针对所述感兴趣的模板(靶多核苷酸)区域并因此引导所述反应的特异性。还使用了本发明的互补的淬灭剂标记的寡核苷酸。因为淬灭剂标记的寡核苷酸的长度足以产生高于反应的Ta的Tm，因此产物的产生可以在任何实时PCR设备(诸如ABI 7900Prism设备)上PCR过程的每个循环进行评估或在所述反应的终点进行评估。

由于两个标记的寡核苷酸(淬灭剂和荧光标记的加尾引物)的互补性，它们互相杂交。当在合适的波长(例如当所述荧光团为FAM时为488nm)被激发时，这种杂交使得淬灭剂标记非常接近于荧光团，从而使得来自荧光团的所有荧光信号被淬灭。

所述反应中还包括常规反向引物，以产生PCR引物对。然后，启动PCR过程并且开始产生PCR产物。

在PCR扩增和PCR形成过程中，产生荧光引物的互补序列。缺乏淬灭剂的该被扩增序列与淬灭剂寡核苷酸竞争结合荧光标记的加尾引物。那些荧光标记的掺入的加尾引物不再被淬灭而是产生荧光信号，其与所产生的PCR产物的量成正比。

PCR产物的间接(实时)检测

该实施方案利用常规(未标记的)寡核苷酸(引物)来启动PCR过程。该常规引物用不涉及感兴趣的扩增子区域的DNA序列进行加尾。该标签序列位于所述引物的5'部分。所述反应中还包括单个荧光标记的寡核苷酸，其能够与所述反应中产生的常规引物的标签序列区域的互补物进行杂交。存在许多合适的荧光团，普通的选择是FAM(荧光素衍生物)。最后，所述反应还包括与FAM标记的寡核苷酸反义的3'淬灭剂标记的寡核苷酸。存在许多合适的标记，其中普通的选择是Black Hole淬灭剂系列的标记。

因为淬灭剂寡核苷酸的长度足以产生高于所述反应的Ta的Tm，产物产生可以在任何实时PCR设备(诸如Roche LC480或ABI 7900Prism设备)上在PCR过程的每个循环进行评估。

由于两个标记的寡核苷酸的互补性，它们互相杂交。该杂交使得淬灭剂标记非常接近于荧光团，从而使得来自荧光团的所有荧光信号被淬灭。然后，启动PCR过程并且开始产生PCR产物。在PCR的开头几个循环之后，产生荧光引物的互补序列。然后，荧光PCR引物能够在PCR过程中启动合成并如此。荧光寡核苷酸能够作为引物不是必需的，但是认为如果荧光寡核苷酸作为引物则可以产生更多的PCR产物，其可以提供更好的信号。这产生含有荧光分子的扩增子。一旦发生，淬灭寡核苷酸与荧光标记的寡核苷酸杂交的能力较低，原因是PCR过程产生了双链扩增子DNA。由于淬灭寡核苷酸不再与荧光标记的寡核苷酸杂交，所产生的信号与所产生的PCR产物的量成正比并可以基于逐个循环来进行测量。

加尾引物的标签区域不需要与单个荧光标记的寡核苷酸相同，只要所产生的尾区域的互补序列与荧光标记的寡核苷酸杂交即可。

PCR产物的间接(终点)检测——SNP基因分型：

如图1所示，该实施方案利用了如上所述相同的荧光团-和淬灭剂-标记的寡核苷酸对。

SNP基因分析利用了至少两个标记的寡核苷酸对，例如2、3或4对，其中每对优选包含不同的荧光团，所述荧光团互相之间是光谱上可解析的，例如FAM和HEX。所述加尾引物(如上所述，每个对应于不同的寡核苷酸引物组)用不同的序列进行加尾，引物的非加尾部分(一般称为正向)针对感兴趣的DNA。在引物的该部分中，它们可以互相之间仅有单个核苷酸不同，例如在其3'末端碱基。如本领域技术人员公知的，每个引物针对感兴趣的DNA中的多态性碱基。进行PCR，由此当引物匹配感兴趣的靶序列时(例如当3'碱基完全匹配时)，它们仅启动合成。当发生错配时，并不进行合成。

在所述反应过程中，依赖于基因型的非尾(靶特异性)部分能够启动合成(或者在杂合子的情况下，二者均能启动合成)。这导致所述引物的不同荧光尾部分掺入到PCR产物中，从而阻碍淬灭剂寡核苷酸与相应荧光寡核苷酸的杂交。因此产生信号，根据该信号，等位基因特异性寡核苷酸已经启动了合成。然后掺入一个或多个荧光团的扩增产物可以在荧光孔板检测仪上进行读取。然后所得结果可以进行作图并产生一个荧光团在其它之上的一簇点。然后所得基因分型能够基于多个簇点进行确定。

在本发明的说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外明确表明，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数。除非另外定义，否则本文所使用的所有科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

应当理解的是，除非上下文另外明确表明，否则当提供数值范围时，本发明涵盖了在该范围的上下限之间的每个中间值至下限的单位的十分之一，以及在该陈述范围中的任何其它所述值或中间值。这些较小范围的上下限可以独立地被包括于所述范围中，并且还涵盖于本发明之中，用于所述范围中任何具体排除的限。当所述范围包括所述限值之一或二者时，不含那些所包含的限值的任一或二者的范围也涵盖于本发明中。

在本文中所提到的所有出版物通过以可能用于描述和公开被描述于本公开文本中并且可用于所描述的发明中的这些元素的最完整的程度而引入本文中。

以下，本发明将通过引用下文的实施例进行记载，所述实施例用于说明目的而不应被解释为对本发明范围的限制。

实施例

缩写：

6FAM：6-羧基荧光素

HEX：2',4',5',7',1,4-六氯荧光素

Dab：非荧光暗淬灭剂

*：掺入硫代磷酸酯(硫代磷酸酯(或S-寡核苷酸)是正常DNA的变体，其中非桥键氧之一被硫取代)。

T_m：寡核苷酸熔解温度

T_a：扩增反应的退火温度

使用一系列的五个荧光团/淬灭剂盒来证实盒熔解温度对控制非特异性扩增的作用。这些荧光团/淬灭剂盒的序列详述如下。

盒对1：

FAM荧光寡核苷酸：/6FAM/TGA GCG ATT AGC CGT TAG GAT GA

FAM互补淬灭寡核苷酸：AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA/Dab/

HEX荧光寡核苷酸：/HEX/GCT GGT CGG TGA ACA GGT TAG AGA

HEX互补淬灭寡核苷酸：TAA CCT GTT CAC CGA CCA GC/Dab/

盒对2：

FAM荧光寡核苷酸：/6FAM/TCA GTG AGC GAT TAG CCG TTA GGA TGA

FAM互补淬灭寡核苷酸：AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG A/Dab

HEX荧光寡核苷酸：/HEX/TAC AGC TGG TCG GTG AAC AGG TTA GAG A

HEX互补淬灭寡核苷酸：TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA/Dab/

盒对3：

FAM荧光寡核苷酸：/6FAM/TGT CTC AGT GAG CGA TTA GCC GTT AGG ATG A

FAM互补淬灭寡核苷酸：AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG AGA CA/Dab

HEX荧光寡核苷酸：/5HEX/ATG CTA CAG CTG GTC GGT GAA CAG GTT AGA GA

HEX互补淬灭寡核苷酸：TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA GCA T/Dab/

盒对4：

FAM荧光寡核苷酸：/6FAM/ATG CTG TCT CAG TGA GCG ATT AGC CGT TAG GAT GA

FAM互补淬灭寡核苷酸：AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG AGA CAG CAT/Dab/

HEX荧光寡核苷酸：/5HEX/AAG CAT GCT ACA GCT GGT CGG TGA ACA GGT TAG AGA

HEX互补淬灭寡核苷酸：TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA GCA TGC TT/Dab/

盒对5：

FAM荧光寡核苷酸：/6FAM/G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A

FAM互补淬灭寡核苷酸：CCTAACGGCTAATCGC/Dab/

HEX荧光寡核苷酸：/5HEX/G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A

HEX互补淬灭寡核苷酸：5’AACCTGTTCACCGAC/Dab/

掺入到荧光团/淬灭剂盒的硫代磷酸酯描述于专利申请PCT/GB2012/050645中。除了列出的那些，还可以使用盒5的许多变体。能够选择用于代替所列的那些的序列变体是：

1)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATGA

2)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATG*A

3)/6FAM/G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A

4)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAGA

5)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAG*A

6)/5HEX/*G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A

7)C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C/3Dab/

8)CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC/3Dab/

9)C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C/3Dab/

10)AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA*/3Dab/

11)A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC/3Dab/

12)A*A*C*C*T*G*T*T*C*A*C*C*G*A*C/3Dab/

实施例1：确定荧光团/淬灭剂盒的熔解温度

实验确定所述荧光团/淬灭剂盒的熔解温度。盒1-5被掺入含有以下最终浓度的成分的反应混合物：

1)0.1uM FAM-标记的寡核苷酸

2)0.1uM HEX-标记的寡核苷酸

3)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对FAM标记的寡核苷酸为反义)

4)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对HEX标记的寡核苷酸为反义)

5)8.5mM Tris/HCl pH 8.3

6)42.5mM KCl

7)1.8mM氯化镁

8)165.2uM dNTPs

9)212.5nM 5-羧基-X-罗丹明,SE(5-ROX,SE)

10)0.04％ Igepal

在不存在DNA聚合酶的情况下确定每个盒的熔解温度。在Roche LightCycler 480设备上在96孔白板上使用每孔10ul的反应混合物，进行每个荧光团/淬灭剂盒的熔解曲线分析。

通过加热混合物至95°℃30秒来进行熔解曲线分析。以0.06℃/秒的速度从40-95度进行熔解曲线分析。对于每个盒测试六个重复。通过LightCycler480分析函数(-dF/dt)从熔解曲线数据产生熔解峰。通过使用手动Tm选项以鉴别反向熔解峰中的最低点，来计算Tm(这是必须的，原因是使用该软件不能在反向峰中进行Tm的自动计算)。实验确定的每个荧光团/淬灭剂盒的Tm列举如下：

FAM标记的荧光核苷酸和相应的淬灭剂：

	1	2	3	4	5
						平均值	63.22	67.42	70.33	73.20	55.81
最小值	63.13	67.27	70.31	73.07	55.68
						最大值	63.27	67.55	70.45	73.41	55.95

HEX标记的荧光核苷酸和相应的淬灭剂：

	1	2	3	4	5
						平均值	68.65	69.95	72.57	74.88	56.60
最小值	68.50	69.81	72.44	74.72	56.53
						最大值	68.91	70.09	72.72	74.93	56.80

实施例2——荧光1的终点检测

在盒1和盒5之间进行直接比较。盒1具有实验确定的高于用于该扩增反应的退火温度的Tm。盒5具有实验确定的低于所述扩增反应的退火温度的Tm(参见实施例1)。

所有寡核苷酸冷冻干燥购买并重悬于10mM Tris/HCl pH 8.0中至200μM的初始浓度。在该稀释剂中进行所有进一步的稀释。

在384孔黑板中以4μl反应体积进行扩增。1x反应混合物(mix)含有以下成分：

1)0.16uM等位基因特异性引物1

2)0.16uM等位基因特异性引物2

3)0.41uM反向(通用)引物

4)0.1uM FAM-标记的寡核苷酸

5)0.1uM HEX-标记的寡核苷酸

6)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对FAM标记的寡核苷酸为反义)

7)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对HEX标记的寡核苷酸为反义)

8)8.5mM Tris/HCl pH 8.3

9)42.5mM KCl

10)1.8mM氯化镁

11)165.2uM dNTPs

12)212.5nM 5-羧基-X-罗丹明,SE(5-ROX,SE)

13)0.04％ Igepal

除了所列的成分外，每个混合物应当含有2-50μl/ml没有外切酶活性的N-末端截短的聚合酶。所述酶没有外切酶活性不是必需的，但是优选的，特别是用于SNP分析。

所使用的测定特异性引物是：

等位基因特异性引物1：5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCA AT3’

等位基因特异性引物2：5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA3’

通用反向引物：5’CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3’

将硫代磷酸酯加入寡核苷酸被描述于专利申请PCT/GB2012/050645中。还可以使用硫代磷酸酯标记的测定引物。针对以上列出的那些能够被取代的可选引物的例子是：

1)5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*T3’

2)5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*A3’

3)5’G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*AT*GA*AG*CT*CC*AC*AA*TT*TG*GT*GA*AT*TA*TC*AA*T3’

4)5’G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*AT*GA*AG*CT*

CC*AC*AA*TT*TG*GT*GA*AT*TA*TC*AA*A3’

5)5’CA*CT*CT*AG*TA*CT*AT*AT*CT*GT*CA*CA*TG*GT*A

3’

6)5’G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*A*G*G*A*T*G*A*A*T*

G*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A*A*T*T*T*G*G*T*G*A*A*T*T*A*T*C

*A*A*T3’

7)5’G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A*T*G

*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A*A*T*T*T*G*G*T*G*A*A*T*T*A*T*C*

A*A*A3’

8)5’C*A*C*T*C*T*A*G*T*A*C*T*A*T*A*T*C*T*G*T*C*A*

C*A*T*G*G*T*A3’

在基于水浴的Hydrocycler PCR仪上进行扩增反应。扩增条件为：

94℃15分钟(热启动激活)

60个循环的：

94℃20秒

57℃60秒(即57℃的Ta)

在反应完全后在BMG Pherastar荧光孔板分析仪上在室温下读取终点荧光。

图2提供了使用上述引物对能够产生的三个等位基因各自的实施例数据。该图还显示了无模板对照(NTC)样品(圆圈)相对于三个基因型簇的每一个的位置。在所示实施例中，来自其中Tm低于扩增反应的Ta的反应(左图)的NTC明显互相不同并提供了非特异性扩增的证据。盒1的实施例数据(右图)，其中Tm高于扩增反应的Ta，显示在该反应中的NTC保持紧密簇集，荧光低于适当扩增的样品簇的荧光。这表明没有产生非特异性产物。

实施例3——荧光2的终点检测

在盒1和盒5之间进行直接比较。盒1具有实验确定的高于该扩增反应的退火温度的Tm。盒5具有实验确定的低于所述扩增反应的退火温度的Tm(参见实施例1)。

在384孔黑板中以4μl反应体积进行扩增。1x反应混合物含有以下成分：

1)0.16uM等位基因特异性引物1

2)0.16uM等位基因特异性引物2

3)0.41uM反向(通用)引物

4)0.1uM FAM-标记的寡核苷酸

5)0.1uM HEX-标记的寡核苷酸

6)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对FAM标记的寡核苷酸为反义)

7)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对HEX标记的寡核苷酸为反义)

8)10mM Tris/HCl pH 8.3

9)10mM KCl

10)1.8mM氯化镁

11)165.2uM dNTPs

12)212.5nM 5-羧基-X-罗丹明,SE(5-ROX,SE)

除了所列的成分外，每个混合物应含有2-50μl/ml没有外切酶活性的N-末端截短的聚合酶。

所使用的测定特异性引物是：

等位基因特异性引物1：

5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATCATTCTCATAATCGCCCACGGA 3’

等位基因特异性引物2：5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATCATTCTCATAATCGCCCACGGG 3’

通用反向引物：5’GTAGTTTGAGTTTGCTAGGCAGAATAGTA 3’

在Hydrocycler PCR仪上进行扩增反应。扩增条件为：

94℃15分钟(热启动激活)

10个循环的：

94℃20秒

61℃-55℃Touch Down 60秒(0.6℃/循环)

35个循环的：

94℃20秒

55℃60秒

图3提供了使用上述引物对能够产生的两个等位基因各自的实施例数据。该图还显示了无模板对照(NTC)样品(圆圈)相对于两个基因型簇的每一个的位置。在所示的实施例中，来自其中Tm低于所述扩增反应的Ta的反应的NTC(左图)具有的FAM荧光基本上高于使用HEX引物所扩增的产物的FAM荧光，具有的HEX荧光基本上高于使用FAM引物所扩增的产物的HEX荧光。该数据给非特异性扩增提供了证据。盒1的实施例数据(右图)，其中Tm高于扩增反应的Ta，显示该反应中的NTC保持向该图左下角的紧密簇集。这表明很少或没有产生非特异性产物。

实施例4——荧光的实时检测

结合实时荧光检测进行扩增反应，以证实提高所述荧光团/淬灭剂盒的熔解温度的作用。

在96孔白板中以10μl反应体积进行实时扩增。1x反应混合物(mix)含有以下成分：

14)0.16uM等位基因特异性引物1

15)0.16uM等位基因特异性引物2

16)0.41uM反向(通用)引物

17)0.1uM FAM-标记的寡核苷酸

18)0.1uM HEX-标记的寡核苷酸

19)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对FAM标记的寡核苷酸为反义)

20)0.5uM淬灭剂标记的寡核苷酸(对HEX标记的寡核苷酸为反义)

21)8.5mM Tris/HCl pH 8.3

22)42.5mM KCl

23)1.8mM氯化镁

24)165.2uM dNTPs

25)212.5nM 5-羧基-X-罗丹明,SE(5-ROX,SE)

26)0.04％ Igepal

所使用的测定特异性引物是：

通用反向引物：5’CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3’

在Roche LightCycler 480实时PCR设备上在96孔白板中测试所述混合物的实时扩增。将5μl的2x测定混合物加入5μl预先稀释至浓度3-4ng/μl的人基因组DNA。该板使用LC480 QPCR密封进行密封。该板在LC480实时PCR仪(Roche)中在下面的循环条件下进行热循环；FAM和HEX荧光的变化在每个循环进行实时记录。

94℃15分钟(热启动激活)

60个循环的：

94℃10秒

57℃60秒(在该温度进行读板)

进行60个循环的PCR以证实更高的Tm荧光团/淬灭剂盒对NTC扩增降低的效率。实时检测结果示于图4中。无模板对照结果为圆圈。非特异性NTC产物的实时检测没有实时发生，原因是荧光团-淬灭剂盒的Tm高于扩增反应的Ta。

Claims

1.一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法用于非诊断或治疗目的，所述方法包括以下步骤：

i)第一寡核苷酸引物，其作为正向引物，其具有靶特异性部分和5'上游荧光盒特异性部分，以及

ii)第二寡核苷酸引物，其作为反向引物，其具有靶特异性部分，

其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适用于在相应靶核苷酸序列的互补链上的杂交以允许形成包括PCR产物在内的引物延伸产物，

b)提供一个或多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于

i)第一盒寡核苷酸，其用作为供体部分的荧光部分标记，并且由能够与给定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交的序列组成，以及

ii)第二盒寡核苷酸，其用包括淬灭剂部分在内的受体部分标记，并且由能够与第一盒寡核苷酸的荧光盒特异性部分进行杂交的序列组成，并且所述第二盒寡核苷酸比相应的第一盒寡核苷酸短1至5个核苷酸碱基；

其中每个盒寡核苷酸集互相杂交以形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有Tm A；

c)起始引物延伸反应，从而当存在相关的靶多核苷酸时产生与相关的第一寡核苷酸引物互补的序列，

这样，包括淬灭剂在内的相关的第二盒寡核苷酸与相关的荧光标记的第一盒寡核苷酸杂交的能力较低，藉以产生信号；以及

d)检测所产生的信号，

其中全部的引物延伸反应循环或者占优势的引物延伸反应循环在小于一个荧光淬灭对的Tm A或在存在多个荧光淬灭对时为多个荧光淬灭对的Tm A的Ta进行。

2.权利要求1所述的方法，其中所述相关的第二盒寡核苷酸是被标记的受体。

3.权利要求1所述的方法，其中所述荧光淬灭对的Tm即Tm A比所述引物延伸反应的Ta高小于或等于15℃。

4.权利要求1所述的方法，其中所述荧光淬灭对的Tm即Tm A比所述引物延伸反应的Ta高1℃至15℃。

5.权利要求1所述的方法，其中所述荧光淬灭对的Tm即Tm A比所述引物延伸反应的Ta高小于或等于10℃。

6.权利要求1所述的方法，其中所述荧光淬灭对的Tm即Tm A比所述引物延伸反应的Ta高1℃至10℃。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法防止或降低了非特异性扩增的检测。

8.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述信号被实时测量。

9.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述信号在所述反应的终点进行测量。

10.权利要求1-6任一项所述的方法，其中当存在仅一个盒寡核苷酸集时用荧光部分标记的所述第一盒寡核苷酸能够作为引物延伸反应中的引物，当存在多个盒寡核苷酸集时用荧光部分标记的所述第一盒寡核苷酸之一能够作为引物延伸反应中的引物。

11.权利要求1-6任一项所述的方法，其中当存在仅一个盒寡核苷酸集时用荧光部分标记的所述第一盒寡核苷酸不能够作为引物延伸反应中的引物，当存在多个盒寡核苷酸集时用荧光部分标记的所述盒寡核苷酸之一不能够作为引物延伸反应中的引物。

12.权利要求1-6任一项所述的方法，其中作为供体的所述荧光标记的荧光盒寡核苷酸和包括淬灭剂在内的所述受体标记的荧光盒寡核苷酸之间的相互作用的稳定性小于作为供体的所述荧光标记的荧光盒寡核苷酸和所述延伸产物之间的相互作用的稳定性，其中所述延伸产物与所述相关组的每个引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游荧光盒特异性部分互补。

13.权利要求1-6任一项所述的方法，其中每个寡核苷酸引物组包含一个寡核苷酸引物集。

14.权利要求1-6任一项所述的方法，其中有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个寡核苷酸引物组和相应的盒寡核苷酸集。

15.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述盒寡核苷酸之一或二者均含有单标记。

16.权利要求15所述的方法，其中所述盒寡核苷酸二者均含有单标记。

17.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述荧光标记的盒寡核苷酸在所述寡核苷酸的5'端处或者在所述寡核苷酸的5'端内含有标记。

18.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述淬灭剂标记的盒寡核苷酸在所述寡核苷酸的3'端处或者在所述寡核苷酸的3'端内含有标记。

19.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中至少一个所述寡核苷酸中，至少一个碱基是硫代磷酸酯修饰的碱基。

20.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中至少一个所述盒寡核苷酸中，至少一个碱基是硫代磷酸酯修饰的碱基。

21.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述荧光标记的盒寡核苷酸中，至少一个碱基是硫代磷酸酯修饰的碱基。

22.根据权利要求19所述的方法，其中至少一个所述寡核苷酸中，20-80％的磷酸酯为硫代磷酸酯。

23.根据权利要求20所述的方法，其中至少一个所述盒寡核苷酸中，20-80％的磷酸酯为硫代磷酸酯。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述荧光标记的盒寡核苷酸中，20-80％的磷酸酯为硫代磷酸酯。

25.一种适合用在检测引物延伸产物的方法中的试剂盒，所述方法包括以下步骤：

并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交；以及

b)两个或更多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于

ii)第二盒寡核苷酸，其用包括淬灭剂部分在内的受体部分标记，并且由能够与第一盒寡核苷酸的荧光盒特异性部分进行杂交的序列组成，并且所述第二盒寡核苷酸比相应的第一盒寡核苷酸短1至5个核苷酸；

其中每个盒寡核苷酸集互相杂交以形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有Tm A，

其中一个荧光淬灭对的Tm A或在存在多个荧光淬灭对时为多个荧光淬灭对的Tm A高于全部的引物延伸反应循环的Ta或者占优势的引物延伸反应循环的Ta。

26.权利要求25的试剂盒，其中一个荧光淬灭对的Tm A或在存在多个荧光淬灭对时为多个荧光淬灭对的Tm A高于46-65℃的温度。

27.权利要求25的试剂盒，其中一个荧光淬灭对的Tm A或在存在多个荧光淬灭对时为多个荧光淬灭对的Tm A高于50-60℃的温度。

28.权利要求25-27任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸引物为未标记的并且其中所述淬灭剂标记的盒寡核苷酸比所述荧光标记的盒寡核苷酸短1至5个核苷酸碱基。