CN116622615A - 可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露提供一种可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法，可溶解的微载体包括溶解型聚合物，溶解型聚合物以还原型交联剂将多个溶解型单体彼此键结。本揭露的可溶解的微载体，有助于细胞的贴附，使用还原剂可易于细胞的脱附。

Description

可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法
技术领域
本揭露是有关于一种微载体、其制备方法及其使用方法，特别是关于一种可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法。
背景技术
微载体被认为是实现高密度干细胞扩增、并用于再生医学的最佳技术。微载体的直径通常为100微米(μm)至400微米，可提供高表面积以利细胞扩增。传统的微载体设计以高细胞附着和增殖率为目标，然而，由于细胞回收率低，使得细胞制造过程变得艰难。由此可知，以微载体培养细胞时，在细胞收集步骤的技术上是具有挑战性的。
最近，康宁公司开发了一种可溶解的微载体，它与钙离子交联，表面涂有/>II基质。可溶解微载体的细胞收获可以通过添加入乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、果胶酶(pectinase)和胰蛋白酶(trypsin)来达成。
此外，使用非酶解法可避免细胞损坏及免疫型态改变。其中，温度诱导脱附属于非侵入性行为，将温度敏感性材料表面接枝在培养皿上或是改质在微载体表面上。当温度高于最低临界溶液温度(lower critical solution temperature，LCST)时，为疏水特性可吸附细胞；当调控温度低于LCST时，会由疏水转变成亲水及无规则的卷曲现象，使细胞脱附。热诱导已用于二维细胞培养，使用敏感性材料包括普朗尼克(pluronic)、甲基纤维素(MC)及poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM)。然而，这种脱附方法比酶脱附方法耗时或低效率。
因此，基于上述缺点，现有技术实有待改善的必要。
发明内容
本揭露的一实施方式提供了一种可溶解的微载体，包含溶解型聚合物，溶解型聚合物以还原型交联剂将多个溶解型单体彼此键结。
在一些实施方式中，还原型交联剂包含与该溶解型聚合物的羟基、胺基、硫醇基、或羧酸基键结。
在一些实施方式中，还原型交联剂包含双硫键交联剂、或双硒键交联剂。
在一些实施方式中，双硫键交联剂包含3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(3,3’-dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide ester)，DTSP)、3,3’-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate，DTSSP)、胱胺酸(cystine)或二巯基二琥珀酰亚胺酰胺丙酸(dithiobis(succinimidylpropionate)，DSP)。
在一些实施方式中，双硒键交联剂包含DSeDPA-NHS(3,3'-二硒代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯；3,3’-Dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide ester))、3,3'-二硒代二丙酸(3,3’-diselanediyldipropionic acid)、2,2'-二硒代二乙胺(2,2’-diselanediylbis(ethan-1-amine))、2,2'-二硒代二乙醇(2,2’-diselanediylbis(ethan-1-ol))或其组合。
在一些实施方式中，溶解型聚合物包含纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚醣、玻尿酸、果酸或其组合。
在一些实施方式中，溶解型聚合物与该还原型交联剂的重量比为1：0.08至1：0.8。
在一些实施方式中，微载体还包含感温型聚合物，包覆溶解型聚合物。
在一些实施方式中，感温型聚合物包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)(poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAM、PNIPA、PNIPAAm、NIPA、或PNIPAA)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(poly(N,Ndiethylacrylamide)，PDEAAM)、聚(N-乙烯基己内酰胺(poly(N-vinylcaprolactam)，PVCL)、聚(2-异丙基-2-恶唑啉)(poly(2-isopropyl-2-oxazoline)，PIOZ)、泊咯沙姆(poloxamer)、或其组合。
在一些实施方式中，感温型聚合物还包含丙烯酸(acrylic acid，AAC)、丙烯胺(allylamine，ALA)、丙烯酰胺(acrylamide，AAm)、[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵([2-(Methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide，DMAPS)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(2-(Diethylamino)ethylmethacrylate，DEAEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(2-Hydroxyethyl methacrylate，HEMA)或其组合。
在一些实施方式中，感温型聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)(P(NIPAM-co-ALA))或其组合。
在一些实施方式中，丙烯酸占该聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)的重量百分比为1％至15％。
在一些实施方式中，感温型聚合物以该还原型交联剂键结于该溶解型聚合物之外。
在一些实施方式中，感温型聚合物以物理性结合于该降解型聚合物之外。
本揭露的一实施方式另提供一种制备可溶解的微载体的方法，包含以下步骤：提供一溶解型聚合物；以及将该溶解型聚合物与一还原型交联剂进行一混合制程，当该溶解型聚合物与该还原型交联剂接触时会进行交联，获得该可溶解的微载体。
在一些实施方式中，提供该溶解型聚合物的步骤，包含：加热多个溶解型单体至呈现液态；混和一油与一表面活性剂，获得一混合液；混和该混合液与这些溶解型单体，获得一油包水乳液；以及将该油包水乳液冷却至定型，获得该溶解型聚合物。
在一些实施方式中，方法还包含提供感温型聚合物；以及混合可溶解型的微载体与感温型聚合物，获得可溶解感温型的微载体。
在一些实施方式中，油包含矿物油(mineral oil)、硬酯酸、棉子油、油醇、白蜡油或其组合。
在一些实施方式中，表面活性剂包含山梨糖醇单油酸脂80Sorbitan Monooleate(span 80)、羟基化羊毛脂(hydroxylated lanolin)、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物(polyoxythylene sorbitol beeswax derivative)、丙二醇脂肪酸酯(porpylene glycolfatty acid ester)、丙二醇单月桂酸酯(propylene glycol monolaurate)、二乙二醇单油酸酯(di(ethylene glycol)monooleate)、聚氧乙烯油醇醚(Sodium lauryl ethersulfate，2EO)、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物(polyoxythylene sorbitol beeswaxderivative)、二乙二醇双硬脂酸酯(diethylene glycol distearate)或其组合。
在一些实施方式中，混和该混合液与这些溶解型单体的步骤，包含将该混合液滴入这些溶解型单体。
在一些实施方式中，溶解型单体包含纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚醣、玻尿酸、果酸或其组合。
在一些实施方式中，混合制程包含微流道、滴定、静电纺丝、乳化聚合、薄膜乳化或其组合。
本揭露的一实施方式另提供一种可溶解的微载体的使用方法，当可溶解的微载体接触一还原剂时，则该可溶解还原型的微载体进行瓦解。
在一些实施方式中，还原剂包含二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、半胱胺酸(cysteine)、2-巯基乙醇β-mercaptoethanol(β-ME)、三(2-羧乙基)膦Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)或其组合。
在一些实施方式中，还原剂的浓度介于1mM至50mM。
本揭露的一实施方式另提供一种可溶解的微载体的使用方法，当可溶解的微载体接触还原剂、接触较低临界溶液温度(lower critical solution temperature，LCST)、先接触还原剂再接触较低临界溶液温度、或先接触较低临界溶液温度再接触还原剂时，则可溶解的微载体进行瓦解。
在一些实施方式中，还原剂包含二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、半胱胺酸(cysteine)、2-巯基乙醇β-mercaptoethanol(β-ME)、三(2-羧乙基)膦Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)或其组合。
附图说明
当结合附图阅读以下详细描述时，本揭露的各种态样将最易于理解。应注意的是，根据行业标准操作规程，各种特征结构可能并非按比例绘制。事实上，为了论述的清晰性，可以任意地增大或减小各种特征结构的尺寸。为让本揭露的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的说明如下：
图1绘示本揭露的一实施方式的微载体制备示意图；
图2绘示本揭露的一实施方式的感温型聚合物的1H-NMR光谱图；
图3绘示本揭露的一实施方式的不同ALA比例的感温型聚合物于不同温度下的最低临界的折线图；
图4绘示本揭露的一实施方式的不同ALA比例的感温型聚合物于不同温度下的水接触角的柱状图；
图5绘示本揭露的一实施方式的DSeDPA双硒键交联剂的1H-NMR光谱图；
图6绘示本揭露的一实施方式的DSeDPA-NHS双硒键交联剂的1H-NMR光谱图；
图7绘示本揭露的一实施方式的双硒键交联剂的拉曼光谱图；
图8绘示本揭露的一实施方式的双硒键交联剂的傅立叶转换红外线光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR)光谱图；
图9绘示本揭露的一实施方式的多种可溶解型的微球的拉曼光谱图；
图10绘示本揭露的一实施方式的多种可溶解还原型的微球的拉曼光谱图；
图11绘示本揭露的一实施方式的交联前后可溶解型的微球(Gms)的傅立叶转换红外线光谱图；
图12绘示本揭露的一实施方式的多种可溶解型的微球的傅立叶转换红外线光谱图；
图13绘示本揭露的一实施方式的多种可溶解还原型的微球的傅立叶转换红外线光谱图；
图14a至图14i绘示本揭露的一实施方式的多种微球的扫描电子显微镜(scanningelectron microscope，SEM)的影像图；比例尺皆为100微米(μm)，图14a、b、c、d、h、i为SEI15.0kV、150倍、WD 11.4～12.2，图14d、e、f为SEI 5.0kV 50倍、WD 10.6～11.7；
图15绘示本揭露的一实施方式的不同交联剂浓度的可溶解还原型微球(Gms-DTSP)膨润后的粒径折线图；
图16绘示本揭露的一实施方式的不同微球膨润后的膨胀率折线图；
图17绘示本揭露的一实施方式的含1％ALA感温型聚合物与犬类肾脏上皮细胞(madin-darby canine kidney cell，MDCK cell)培养的细胞存活率柱状图；n＝8；
图18绘示本揭露的一实施方式的含3％ALA感温型聚合物与犬类肾脏上皮细胞培养的细胞存活率柱状图；n＝8；
图19绘示本揭露的一实施方式的含5％ALA感温型聚合物与犬类肾脏上皮细胞培养的细胞存活率柱状图；n＝8；。
图20绘示本揭露的一实施方式的可溶解型与感温型微球的细胞存活率柱状图；
图21绘示本揭露的一实施方式的可溶解还原型与感温型微球的细胞存活率柱状图；
图22绘示本揭露的一实施方式的含不同比例ALA感温型聚合物与犬类肾脏上皮细胞培养的荧光染色图；
图23绘示本揭露的一实施方式的MDCK细胞于可溶解型与感温型微球的的贴附率折线图；
图24绘示本揭露的一实施方式的可溶解还原型与感温型微球以GSH瓦解时的影像图；比例尺为100微米；
图25绘示本揭露的一实施方式的可溶解还原型与感温型微球以L-半胱胺酸瓦解时的影像图；比例尺为100微米；
图26绘示本揭露的一实施方式的可溶解还原型与感温型微球以DTT瓦解时的影像图；比例尺为100微米；
图27绘示本揭露的一实施方式的MDCK细胞于可溶解还原型与感温型微球的的贴附率折线图。
具体实施方式
为使本揭露的叙述更加详尽与完备，下文针对本揭露的实施态样与具体实施例提出说明性的描述，但这并非实施或运用本揭露具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节，以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，亦可在无这些特定细节的情况下实践本揭露的实施例。
另外，空间相对用语，如“下”、“上”等，是用以方便描述一元件或特征与其他元件或特征在附图中的相对关系。这些空间相对用语旨在包含除了附图中所示的方位以外，装置在使用或操作时的不同方位。装置可被另外定位(例如旋转90度或其他方位)，而本文所使用的空间相对叙述亦可相对应地进行解释。
于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则“一”与“该”可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、元件与/或组件，但不排除其所述或额外的其一个或多个其它特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件，与/或其中的群组。
在一些实施方式中，制备可溶解还原型的微载体或可溶解型的微载体，包括将溶解型聚合物与交联剂进行混合制程，当溶解型聚合物与交联剂接触时会进行交联，获得可溶解还原型的微载体或可溶解型的微载体。在一实施方式中，微载体可呈现包括、但不限于近似圆球形的微球。在一些实施例中，微球在干燥状态下的粒径介于100-300微米(μm)小球适用于贴壁细胞生长，例如，110微米、120微米、140微米、200微米、220微米、250微米、280微米、或这些值之间的任何值。在一些实施例中，微载体浸泡在培养基中膨润后球型变完整，粒径介于150-400微米，例如160微米、170微米、180微米、190微米、200微米、250微米、300微米、310微米、320微米、330微米、340微米、350微米、370微米、或这些值之间的任何值。
微载体表面的电荷和亲水性质影响细胞贴附行为，带正电化学基团，例如胺基(-NH2)比起带负电的羧酸基(-COOH)表面有更好的细胞附着力。另外表面略微亲水，比起疏水性(水接触角>90°)和超疏水性(水接触角>150°)有更好的蛋白质吸附特性。
在一实施方式中，溶解型聚合物包含纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚醣、玻尿酸、果酸或其组合。在一实施方式中，明胶由85％至92％的蛋白质、矿物盐和水组成，从动物皮肤、骨胳和***中细胞外基质胶原蛋白中提取的水溶性混合物，具有高度生物相容性与生物降解性且无毒的大分子，由300-4000个胺基酸组异质单链和多链多肽构成，制作方法通过酸性水解猪肉皮得到的A型明胶(pH 3.8-6.0；等电点6-8)；碱性动物骨胳及皮肤水解的B型明胶(pH 5.0-7.4；等电点4.7-5.3)。明胶有独特的胺基酸序列，由三个平行的左旋α链组成，每条链由重复的胺基酸序列Gly-Xaa-Yaa(Gly:甘胺酸、Xaa:脯胺酸、Yaa:羟脯胺酸)，易溶于高温水性溶剂中冷却后形成凝胶，温度在最高的临界溶液温度(UCST)30-35℃时会发生溶胶-凝胶相转变，属于可逆的胶凝现象。在一实施方式中，胶原蛋白为存在众多组织细胞外基质中的主要结构蛋白，富含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)序列，促进细胞粘附和增殖生长。
在一实施方式中，混合将油与表面活性剂形成混合液。在一实施方式中，油包括矿物油、硬酯酸、棉子油、油醇、白蜡油或其组合。在一实施方式中，表面活性剂包括山梨糖醇单油酸脂80、羟基化羊毛脂、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、丙二醇脂肪酸酯、失水山梨醇单油酸酯、丙二醇单月桂酸酯、二乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯油醇醚、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、二乙二醇脂肪酸酯、二乙二醇脂肪酸酯或其组合。在一实施方式中，亲水亲油平衡值(hydrophilic-lipophilic balance，HLB)为0表示完全亲脂性分子，而值越大表示更加亲水。在一些实施例中，明胶油包水乳化***依据HLB选择恰当的界面活性剂，介于3至5，例如3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、或这些值之间的任何值；其中，山梨糖醇单油酸脂80的HLB为4.3较亲油，适合在油相中分散并避免水相中的液滴合并在一起，提高了乳化液的稳定性。
在一实施方式中，接着，将溶解型聚合物与水加热后配置成溶解型聚合物水溶液，接着将溶解型聚合物水溶液缓慢滴入混合液中，获得油包水(W/O)乳液(油:水v/v从10:1～4:1，包括，但不限于9:1、8:1、7:1、6:1、5:1或这些值之间的任何值)。此处油量不可太低，避免塑型效果不佳。在一实施方式中，溶解型聚合物与水加热使多个溶解型聚合物或其单体呈现液态，加热温度包括，但不限于30℃至90℃，例如40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、或这些值之间的任何值。
在一实施方式中，接着，将油包水乳液降温促使微球定型冷却后，加入交联剂并搅拌进行交联反应，直到微球固化。本文中，“定型”是指稳定水在油中的型态。本文中，“固化”是指水珠的型态不再改变；乳化态材料进行微量表面与特性改质，依改质特性将材料塑型型态不再改变。在一实施方式中，此处所述的将油包水乳液降温，其温度小于前述加热温度。在一实施方式中，制备可溶解还原型的微载体中，交联剂为还原型交联剂，还原型交联剂与溶解型聚合物的羟基、胺基、硫醇基、或羧酸基键结。在一些实施例中，还原型交联剂包含，但不限于双硫键交联剂、或双硒键交联剂。双硫键交联剂包含，但不限于3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DTSP)、3,3’-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、胱胺酸、或二巯基二琥珀酰亚胺酰胺丙酸(DSP)。双硒键交联剂包含，但不限于DSeDPA-NHS、3,3’-diselanediyldipropionicacid、2,2’-diselanediylbis(ethan-1-amine)、2,2’-diselanediylbis(ethan-1-ol)或其组合。在另一实施方式中，制备可溶解的微载体中，交联剂包含零长度交联剂与非零长度交联剂。所谓零长度交联剂，在催化降解型聚合物交联完成后会被去除；零长度交联剂包含，但不限于碳二亚胺(EDC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DSC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、或其组合。非零长度的交联剂最终会被并入聚合物网络中，交联剂与降解型聚合物反应，在降解型聚合物之间形成共价键，非零长度交联剂包含，但不限于甲醛、戊二醛、丙烯酰胺、异氰酸酯、栀子素、DTSP、DSeDPA-NHS、BSSS、DSG、sulfo-EGS、DSS、EGS、BS2G、DTSSP、DST、BSOCOES、DPDPB、sulfo DST、或DSP。
在一实施方式中，接着，微球固化、交联反应完后过滤去除油相并洗涤，将微球干燥即得到可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)或可溶解型的微球(Gms)。在一些实施例中，交联反应完后以抽气过滤装置去除油相，再用丙酮/水溶液(v/v,5:1～1:1，例如4:1、3:1或2:1)洗涤数次，最后将微球冷冻干燥。在一些实施例中，此处丙酮/水溶液比例可以是固定或是依序递减，在高浓度丙酮/水溶液下可快速将油去除，但不可全丙酮清洗，会破坏微球表面或形态。
在一实施方式中，溶解型聚合物与该还原型交联剂的重量比为1：0.08至1：0.8。
在一实施方式中，溶解型聚合物与该还原型交联剂的重量比为1：0.32至1：0.8。
在一些实施方式中，经由元素分析仪量测，干燥后的可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)中，明胶与DTSP的重量比为约99:1～1.86:1，例如约90:1～2:1、80:1～2:1、70:1～2:1、60:1～2:1、50:1～2:1、40:1～2:1、30:1～2:1、20:1～2:1、10:1～2:1、7:1～2:1、5.67:1～1.86:1、5:1～1.86:1、4:1～1.86:1、3:1～1.86:1、或者这些值中任意两者之间的任何值。
在一些实施方式中，制备感温型聚合物包括：通过自由基聚合方法聚合温度敏感高分子与亲水性单体，获得感温型聚合物。在一实施方式中，温度敏感高分子包含，但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(poly(PDEAAM)、聚(N-乙烯基己内酰胺(PVCL)、聚(2-异丙基-2-恶唑啉)(PIOZ)、泊咯沙姆、或其组合。在一实施方式中，亲水性单体包含，但不限于丙烯酸(AAC)、丙烯胺(ALA)、丙烯酰胺(AAm)、[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(DMAPS)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)或其组合。在一实施方式中，自由基聚合方法包括，但不限于稳定自由基聚合(SFRP)、原子转移自由基聚合(ATRP)、或可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)。在一实施方式中，亲水性单体包括，但不限于丙烯酸、丙烯胺、丙烯酰胺、[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(DMAPS)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)或其组合。在一些实施例中，感温型聚合物包含N-异丙基丙烯酰胺与丙烯胺，其中丙烯胺占以感温型聚合物的重量百分1％至5％，例如2％、3％、4％、或这些值之间的任何值。
在一实施方式中，通过可逆加成断裂链转移聚合法将温度敏感高分子、亲水性单体、起始剂、链转移剂溶于有机溶剂中，放置超音波震荡器溶解获得混合物。将混合物加入反应瓶并通入氮气吹扫后，接着加热并持续搅拌进行聚合反应。反应瓶上方装置冷凝管使***维持回流，避免温度过高反应物受热挥发损失。当于反应瓶加热后的混合物的粘度不再增稠之后，将反应瓶放入液态氮中以终止反应，获得聚合溶液。在一些实施例中，加热的温度可在50℃至90℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、或这些值之间的任何值。在一些实施例中，反应时间为4小时至48小时，例如6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、或这些值之间的任何值。在一些实施方式中，通常的链转移剂包括硫醇、十二烷基硫醇DDM、或者卤代烷，比如四氯化碳。链转移剂又被称为改性剂和控制剂。
在一实施方式中，将聚合溶液再沉淀于冷***中以确保去除未反应的单体及链转移剂。沉淀后得到固体并干燥，以去除***。接着使用透析膜进行纯化步骤，将干燥后的固体于水中透析纯化获得半成品，并将半成品去除水分，得到干燥的感温型聚合物，或称温敏性嵌段共聚物。
在一些实施方式中，以物理方式制备可溶解还原感温型的微球(Gms-DTPS-pnipam)或可溶解感温型的微球(Gms-pnipam)，包括：混合可溶解还原型的微载体与该感温型聚合物，获得该可溶解还原感温型的微载体；或是，混合可溶解型的微载体与该感温型聚合物，获得该可溶解感温型的微载体。在一实施方式中，配置感温型聚合物水溶液后，加入可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)或可溶解型的微球(Gms)于低温下搅拌直到可溶解型的微球或可溶解还原型的微球表面上覆盖感温型聚合物。将改质完成后的微球洗涤以去除残留的感温型聚合物，接着再干燥去除水分，获得可溶解还原感温型的微球(Gms-DTPS-pnipam)或可溶解感温型的微球(Gms-pnipam)。在一些实施例中，微球于0℃～15℃低温下搅拌，例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、10℃、12℃、14℃、或这些值之间的任何值。在一些实施例中，将微球冷冻干燥去除水分。在一实施方式中，以物理涂覆感温型聚合物于微载体表面，是通过分子间作用力达成，例如范德瓦利(Van der Waals force)、次级键(secondary bond)包括但不限于氢键等。
在一些实施方式中，制备双硒键交联剂包括：配置10毫莫尔(mmol)的硒(Se)粉末于3毫升水中并保持于氮气环境中。在一些实施例中，将含硒的水注入三颈反应瓶并保持于氮气中。随后将20毫莫尔的硼氢化钠(NaBH4)于8毫升水中缓慢滴入到含硒的水中，并搅拌至无色使硒粉末完全溶解，获得第一混合液。之后下等量10毫莫尔硒粉末到第一混合液中并加热，直到呈现红棕色获得第二混合液。在一些实施例中，加热温度介于80℃至130℃，例如85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、或这些值之间的任何值。接着，将20毫莫尔3-氯丙酸(3-chloropropionic acid)加入第二混合液于室温氮气环境下搅拌，获得第三混合液。将第三混合液暴露于大气中搅拌，接着过滤除去未反应物质，得到黄色上清液。将黄色上清液用1M盐酸(HCl)将pH值调节至3.5，并用无水乙酸乙酯(ethylacetate，EA)萃取两次，得到上层有机层后再用水洗涤萃取并去除水分(例如，以无水硫酸镁粉末吸收水分)并以乙酸乙酯后，得到DSeDPA。
在一实施方式中，接着将1.2毫莫尔DSeDPA溶于5毫升无水四氢呋喃中(tetrahydrofuran，THF)，再滴入氮气环境下的容器中，随后再加入2.88毫莫尔N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)搅拌获得初始溶液。之后将2.88毫莫尔的二亚胺溶于5毫升无水四氢呋喃，滴加到低温的初始溶液，以控制反应速度避免过快。在一些实施例中，低温介于0℃至20℃，例如5℃、10℃、15℃、或这些值之间的任何值。接着，将含有四氢呋喃的初始溶液于室温搅拌至完全反应后、再经过过滤杂质与去除四氢呋喃后，获得DSeDPA-NHS。DSeDPA-NHS亦可于真空烘箱干燥24小时后收集保存。
在一些实施方式中，以化学法制备可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam)或可溶解感温型的微球(Gms-Se-pnipam)，包括混合可溶解还原型的微载体、该还原型交联剂与该感温型聚合物，获得该可溶解还原感温型的微载体；或是，混合可溶解型的微载体、该还原型交联剂与该感温型聚合物，获得该可溶解感温型的微载体。在一实施方式中，配置感温型聚合物水溶液后，加入0.18mM DSeDPA-NHS及可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)或可溶解型的微球(Gms)，于低温下搅拌直至可溶解还原型的微球的表面上覆盖感温型聚合物且化学键结完成。在一些实施例中，微球于0℃至15℃低温下搅拌，例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、10℃、12℃、14℃、或这些值之间的任何值。键结完成后将微球洗涤以去除残留感温型聚合物，接着再干燥以去除多余水分，即获得可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam)或可溶解感温型的微球(Gms-Se-pnipam)。
在一些实施例中，以化学法制备可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam)中，pnipam、Se、Gms重量浓度百分比(wt％)对应为：pnipam 3～10％、Se 1～3％、Gms 87～96％。pnipam、Se、Gms的重量分为3～10：1～3：87～96，例如：pnipam重量分为3、4、5、6、7、8、9、10或这些值之间的任何值；Se重量分为1、2、3或这些值之间的任何值；Gms的重量分为87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或这些值之间的任何值。
虽然下文中利用一系列的操作或步骤来说明在此揭露的方法，但是这些操作或步骤所示的顺序不应被解释为本揭露的限制。例如，某些操作或步骤可以按不同顺序进行及/或与其它步骤同时进行。此外，并非必须执行所有绘示的操作、步骤及/或特征才能实现本揭露的实施方式。此外，在此所述的每一个操作或步骤可以包含数个子步骤或动作。
图1绘示本揭露的一实施方式的微载体制备示意图。
制备例1制备可溶解还原型的微球
混合将矿物油与表面活性剂山梨糖醇单油酸脂80形成混合液。将明胶与水加热后配置成0.25克/毫升(g/mL)的明胶水溶液5毫升，接着将明胶水溶液缓慢滴入混合液中，获得油包水(W/O)乳液(油:水v/v,7:1)。将油包水乳液迅速降温促使微球定型冷却，加入0.1克至1克的双硫键交联剂DTSP并搅拌进行交联反应，直到微球固化(此处DTSP约为0.25mM至1.2mM)。交联反应完后去除油相并洗涤，将微球干燥，即得到可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)。
经由元素分析仪量测，干燥后的可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)中，明胶与DTSP的重量比为约99:1～65:35。
制备例2制备可溶解型的微球
混合将矿物油与表面活性剂山梨糖醇单油酸脂80形成混合液。将明胶与水加热后配置成0.25克/毫升(g/mL)的明胶水溶液，接着将明胶水溶液缓慢滴入混合液中，获得油包水(W/O)乳液(油:水v/v,7:1)。将油包水乳液迅速降温促使微球定型冷却一段时间后，加入戊二醛并搅拌一段时间进行交联反应，直到微球固化。交联反应完后过滤去除油相并洗涤，将微球干燥，即得到可溶解型的微球(Gms)。
制备例3制备感温型聚合物
通过可逆加成断裂链转移聚合法(RAFT)将NIPAM、ALA、起始剂(2,2’-azobis(2-methyl-propionitrile)，AIBN)、链转移剂(4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)acid，CTA)溶于1,4-二恶烷(1,4-Dioxane)，放置超音波震荡器溶解获得混合物。将混合物慢慢加入反应瓶并通入氮气吹扫后，接着加热并持续搅拌进行聚合反应。反应瓶上方装置冷凝管使***维持回流，避免温度过高反应物受热挥发损失。当于反应瓶加热后的混合物的粘度不再增稠之后，将反应瓶放入液态氮中以终止反应获得聚合溶液，并将聚合溶液再沉淀于冷***中以确保去除未反应的单体(如NIPAM、ALA)及链转移剂。沉淀后得到浅黄色固体并干燥，以去除***。接着使用透析膜(截留分子量(molecular weight cut off，MWCO)＝1000)进行纯化步骤，将干燥后的浅黄色固体于水中透析纯化获得半成品，将半成品去除水分，得到干燥的感温型聚合物P(NIPAM-co-Allylamine)，或称温敏性嵌段共聚物(产率：约90％)。
制备例4制备可溶解还原感温型的微球-物理法(Gms-DTSP-pnipam)
配置3wt％P(NIPAM-co-Allylamine)乙醇水溶液后，加入由制备例1所制备的可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)于低温0～5℃下搅拌直到可溶解型的微球上覆盖P(NIPAM-co-Allylamine)。将改质完成后的微球洗涤以去除残留P(NIPAM-co-Allylamine)，接着再干燥去除水分，获得可溶解还原感温型的微球(Gms-DTPS-pnipam)。
制备例5制备可溶解感温型的微球-物理法(Gms-pnipam)
配置重量百分比3％(wt％)P(NIPAM-co-Allylamine)乙醇水溶液后，加入由制备例2所制备的可溶解型的微球(Gms)于低温0～5℃下搅拌直到可溶解型的微球上覆盖P(NIPAM-co-Allylamine)且物理性键结完成。将改质完成后的微球洗涤以去除残留P(NIPAM-co-Allylamine)，接着再干燥去除水分，获得可溶解感温型的微球(Gms-pnipam)。
制备例6双硒键交联剂的制备
配置10毫莫尔(mmol)的硒(Se)粉末于3毫升水中并保持于氮气环境中，随后将20毫莫尔的硼氢化钠(NaBH4)于8毫升水中缓慢滴入到含硒的水中，并搅拌至无色使硒粉末完全溶解，获得第一混合液。之后下等量10毫莫尔的硒粉末到第一混合液中并加热，直到呈现红棕色获得第二混合液。将20毫莫尔的3-氯丙酸加入第二混合液于室温氮气环境下搅拌，获得第三混合液。将第三混合液暴露于大气中搅拌，接着过滤除去未反应物质，得到黄色上清液。将黄色上清液用1M盐酸将pH值调节至3.5，并用无水乙酸乙酯萃取，得到上层有机层后再用水洗涤萃取两次并去除水分及乙酸乙酯后，得到DSeDPA(产率：85％)。
将1.2毫莫尔DSeDPA溶于5毫升无水四氢呋喃中，再滴入氮气环境下的容器中，随后再加入2.88毫莫尔N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)搅拌获得初始溶液。之后将2.88毫莫尔的二亚胺溶于5毫升无水四氢呋喃，滴加到低温的初始溶液，控制反应速度避免过快。将含有四氢呋喃的初始溶液于室温搅拌至完全反应后、再经过过滤杂质与去除四氢呋喃后，获得DSeDPA-NHS。DSeDPA-NHS亦可于真空烘箱干燥24小时后收集保存。
制备例7制备可溶解还原感温型的微球-化学法(Gms-DTSP-Se-pnipam)
配置3wt％P(NIPAM-co-Allylamine)乙醇水溶液后，加入1wt％DSeDPA-NHS及制备例1的96wt％可溶解还原型的微球(Gms-DTSP)，于低温下搅拌直至可溶解还原型的微球上覆盖P(NIPAM-co-Allylamine)且化学键结完成。键结完成后将微球洗涤以去除残留P(NIPAM-co-Allylamine)，接着再干燥以去除多余水分，即获得可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam)。
实施例1感温型聚合物的合成
感温型聚合物取自于制备例3以ALA单体与NIPAM聚合，使结构中具有正电性质的胺基，有利于细胞贴附应用。以下分为三组比例1％ALA、3％ALA、5％ALA实验合成比例配方如下表1，合成的聚合物经由FT-IR与1H-NMR，确认成功接枝并经由凝胶渗透层析法(gelpermeation chromatography，GPC)量测分子量。
表1、P(NIPAM-co-Allylamine)合成配方
1.1 1H-NMR鉴定与组成元素
首先确认P(NIPAM-co-Allylamine)聚合物的化学结构。反应时加入起始剂AIBN，温度到达70℃时，开始产生自由基，促使单体双键(C＝C)聚合反应。利用核磁共振光谱仪(NMR)进行氢谱(1H-NMR)分析鉴定分子结构(如图2所示)，对应到结构式δ＝0.95–1.24ppm(a,CH3来自NIPAM)，δ＝1.34–1.75ppm(b,CH2来自NIPAM与Ala)(h,CH2来自CTA)，δ＝1.82–2.13ppm(c,CH来自NIPAM与Ala)(i,j,CH来自CTA)，δ＝2.66ppm(d,CH2来自Ala)，δ＝3.82ppm(e,CH来自NIPAM)，δ＝7.32–7.79ppm(f,CH来自CTA)，δ＝8.38ppm(g,NH来自NIPAM)。将1H-NMR信号积分推算出接枝率及组成(如下表2)。
表2、P(NIPAM-co-Allylamine)的组成比
1-2分子量量测鉴定
使用凝胶渗透层析法鉴定合成的高分子分子量大小及分子量分布。表3为P(NIPAM-co-Allylamine)感温型聚合物经凝胶渗透层析法测量所得的分子量大小及分子量分布。表3得知分子量分散度(polydispersity index，PDI)合成的聚合物都有狭窄分子量分布，其值大多介于1.2-1.3之间，而P(NIPAM-co-Allylamine)的重量平均分子量(Mw)分别为37666、42803、43056，证明单体经由RAFT成功聚合为共聚物。
表3、P(NIPAM-co-Allylamine)的性质分析
配比 Mn*(g/mol) Mw(g/mol) PDI
1％ALA 29739 37666 1.26
3％ALA 32341 42803 1.32
5％ALA 33959 43056 1.26
*Mn：数均分子量
1-3最低临界溶液温度LCST量测
将单体ALA崁入NIPAM共聚物中后，因静电排斥力增加，PNIPAM疏水力影响LCST。共聚物的LCST可通过紫外光/可见光光谱仪测定，为50％穿透率下对应的温度：当温度上升共聚物大量聚集，从溶液态形成非流动的凝胶态，光的穿透值相对降低。图3是PNIPAM及1％ALA、3％ALA、5％ALA于不同温度下的穿透率，得知PNIPAM的LCST为31.4℃；1％ALA、3％ALA、5％ALA的LCST分别为32.3℃、32.5℃、33.4℃，因此LCST随ALA比例而增加。此证实疏水单体的加入共聚物中会降低LCST，反之亲水单体会增加LCST，主要原因取决于聚合物尾端基的亲疏水性质。
1-4水接触角测试
感温型聚合物的水接触角随温度而变化。水通过自身表面张力在气-液界面产生圆形水滴状，透过影像图根据Young公式:γsv＝γsl+γlvcosθ计算水接触角。请参阅图4，以市售PNIPAM作为对照组，PNIPAM在室温下水接触角为44.83±0.47°，嵌入ALA后1％ALA、3％ALA、5％ALA的水接触角为37.13±0.55°、32.65±0.28°、29.4±0.95°。当温度从室温上升至40℃时，PNIPAM、1％ALA、3％ALA、5％ALA的水接触角分别为63.23±1.85°、64.91±0.89°、63.45±1.04°、53.83±1.17°，得知对照组PNIPAM低温转变成高温时角度相差18.4°，嵌入ALA后P(NIPAM-co-Allylamine)相差25°以上，证实此共聚物有温度反应特性。另外ALA为亲水单体，在低温时5％ALA水接触角度较小，最为亲水。随共聚物ALA含量提升，接触角逐渐下降。1％ALA、3％ALA在高温时较趋近于对照组PNIPAM疏水接触角度，吻合略微亲水(水接触角<90°)有更好的蛋白质吸附特性，证实利于细胞吸附增殖。
实施例2双硒键交联剂的合成
合成双硒键的其中一个目的，在于将P(NIPAM-co-Allylamine)聚合物以化学键结与微球结合形成热响应(thermos-sensitive)微球，并与微球表面以物理性涂层温感性高分子进行比较。双硒键属于氧化还原敏感性材料，易受到环境变化而断裂，DSeDPA两端的羧酸基(-COOH)中的氧受EDC亲核攻击，形成高活性中间体(O-acylisourea)，随后与NHS反应形成的第二个中间体(O-acylisourea)，在水中水解为DSeDPA-NHS，并与胺基(-NH2)快速反应产生稳定的酰胺键，此时与P(NIPAM-co-Allylamine)尾端胺基发生反应交联成聚合物。
2.1 1H-NMR鉴定与组成元素
结构的正确性用1H-NMR鉴定。DSeDPA活化前(如图5所示)发现对应到结构式δ＝2.69～2.72ppm(a)；δ＝3.04～3.06ppm(b)，两点的结构式皆为CH2，b点旁边是羧酸基(–COOH)，受到较大电负度拉扯位移至左方符合核磁共振中共振频率变大信号位于低场区，活化后(如图6所示)DSeDPA-NHS结构式δ＝2.69–2.71ppm(a,CH2来自DSeDPA)；δ＝3.03–3.06ppm(b,CH2来自DSeDPA)；δ＝2.59ppm(c,CH来自NHS)，从c点可证明在NHS活性基团上有四个CH信号强度高于a及b点，以上NMR结果分析证明双硒键交联剂DSeDPA-NHS官能基成功合成无误。
2-2拉曼光谱仪分析
硒属于空气敏感的元素。图7为硒元素对称结构的拉曼光谱谱图。分析后290cm-1、310cm-1位置出现Se-Se双硒键信号，且276cm-1左右有明显的Se-C官能基，因此证明经由EDC活化，提高羧酸的活性及反应效率，使NHS连接在羧酸基(–COOH)，成功合成的DSeDPA-NHS，由拉曼确认硒元素存在于结构中。
2-3傅立叶转换红外线光谱(FT-IR)分析
使用FT-IR可以更准确观察无机官能基结构。从图8的图谱分析得知活化前DSeDPA羧酸基与NHS结合后，在1688cm-1属于C＝O官能基；活化后因NHS结合受到拉扯，变动至1776cm-1峰值。另外，两者其他官能基信号N-O、C-N、C-O分子振动的光谱有明显差异，代表反应成功。
实施例3明胶微球鉴定
明胶溶于热水而不溶于冷水，但进行人体细胞培养需处于37℃环境，因此需将网络交联稳固，通过乳化反应加入交联剂获得微球。其中，以还原型交联剂制备出的微球为可溶解还原型的微球(Gms-DTSP，如制备例1)、以非还原型交联剂制备出的微球为可溶解型的微球(Gms，如制备例2)。接着再以物理涂覆或化学键结方式将感温型聚合物结合于微球表面，分别获得物理涂层的可溶解还原感温型的微球(Gms-DTPS-pnipam，如制备例4)与可溶解感温型的微球(Gms-pnipam，如制备例5)、及化学键结的可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam，如制备例7)。
3.1拉曼光谱仪分析
利用拉曼仪器分析各组微球，依照使用交联剂分为：
第一组：可溶解型的微球(Gms，如制备例2)、物理涂层的可溶解感温型的微球(Gms-pnipam，制备例5)；
第二组：可溶解还原型的微球(Gms-DTSP，如制备例1)、化学键结的可溶解还原感温型的微球(Gms-DTSP-Se-pnipam，制备例7)、物理涂层的可溶解还原感温型的微球(Gms-DTPS-pnipam，制备例4)。
由于明胶没有固定结构式，但结构中有大量羟基和胺基，因此拉曼峰值无法指出实际改质后的结构，但还是能透过峰值位移观察各微球差异。图9所示，为第一组2000-2500cm-1范围内有两根信号，明胶经由戊二醛交联后(Gms)，能确认三个反应阶段中的两根峰值皆有左右位移。图10所示为第二组用DTSP交联的微球。观察出趋近1400cm-1位置，明胶由DTSP交联后各组微球多出此信号，推断DTSP确实将明胶交联稳固住成为微球。另外，2000-2500cm-1范围内的两根信号有些微的变动。
3.2傅立叶转换红外线光谱分析
拉曼光谱仪与FT-IR呈现互补，且较适于检测对称键结。微球属于非对称性结构，使用FT-IR分析两大组微球，相对有较强的红外线吸收峰值。图11显示明胶在未交联前amide I在1629cm-1是受到C＝O伸缩振动影响，在1634cm-1发生希夫碱反应(Schiff base)的C＝N伸缩振动，经交联后amide I和未反应的醛基混合物的C＝O伸缩所导致，确认明胶的胺基和戊二醛的羰基(C＝O)之间形成的希夫碱反应，证实了明胶与戊二醛交联的成功。
明胶中主要峰值有1600-1700cm-1的amide I(C＝O键的拉伸)、1500-1590cm-1的amide II(NH弯曲振动和CN伸缩振动)和1200cm-1附近的amide III(NH弯曲振动和CN伸缩振动)，均在图12、图13观察到特征峰。特别是，使用DTSP交联剂在3500-3000cm-1处观察到O-H和N-H振动的峰，在2940cm-1处观察到-CH3基团的对称伸缩振动峰，而DTSP带有NHS活性基团，与明胶网络中胺基(-NH2)反应后形成稳定的酰胺键。同时NHS结构被释放，及在1390cm-1处并观察到S＝O的特征峰。
3.3扫描电子显微镜(SEM)分析
使用SEM分析干燥交联固化的明胶微球的尺寸并观察表面形貌。图14a显示未使用交联剂得到的微球；图14b显示使用戊二醛交联可溶解型的微球(Gms)，形成团聚，无法过筛，粒径范围不均一；图14c显示可溶解感温型的微球(Gms-pnipam)经由表面物理涂层后，微球具有分散性，颗粒明显分散改善团聚现象，并同时观察出表面有粉末状态被感温型聚合物包覆住；图14d显示使用DTPS交联剂0.25mM(Gms-0.25mM DTSP)；图14e显示DTPS交联剂0.6mM(Gms-0.6mM DTSP)；图14f(50倍放大)、图14g(150倍放大)显示DTPS交联剂1.2mM(Gms-1.2mM DTSP)，得知随交联剂浓度增加，微球表面从平滑逐渐粗糙。接着观察具有感温型聚合物的微球：图14h显示使用物理涂层(Gms-DTSP-pnipam)，发现微球使用物理涂层表面由原先的粗糙，被感温型聚合物包覆后呈现平滑状态；另一组图14i显示化学键结(Gms-DTSP-Se-pnipam)使用硒交联剂将P(NIPAM-co-Allylamine)化学键结于明胶表面，有明显变化的收缩孔洞。
除了使用SEM外，同时使用能量分散式光谱仪(energy-dispersive X-rayspectroscopy，EDS)得知元素分析组成。使用戊二醛交联的微球组成元素为C、N、O元素，使用双硫键DTPS交联剂得到C、N、O、S元素，用双硒键交联剂将P(NIPAM-co-Allylamine)化学键结于明胶得到C、N、O、S、Se元素，皆有交联剂元素再次证实交联成功。为了了解微球在干燥状态的尺寸，使用Image J分析粒径大小，表4为各组明胶微球的平均粒径。
表4、各组明胶微球的平均粒径
样品 平均直径(μm)
(a)Gms 142.19±107.68
(b)Gms-pnipam 123.08±51.75
(c)Gms-0.25mM DTSP 222.31±169.13
(d)Gms-0.6mM DTSP 226.37±69.25
(e)Gms-1.2mM DTSP 251.13±81.14
(f)Gms-DTSP-pnipam 208.56±85.96
(g)Gms-DTSP-Se-pnipam 230.17±71.36
3.4膨润状态粒径分析
微球粒径定义范围为100-300微米。首先使用筛网分离小于100微米的明胶微球，随后浸入温热培养基保持37℃环境中持续5天，模拟真实细胞培养环境。然后使用光学显微镜观察微球膨胀尺寸及稳定性。表5显示Gms及Gms-pnipam粒径分布。Gms干燥时粒径型态为团聚现象，不能初次过筛，有小颗的微球无法分离，尺寸分散较大；而Gms-pnipam表面涂层P(NIPAM-co-Allylamine)后，改善团聚现象能顺利通过筛网，微球尺寸分布区间较小。
表5、明胶微球(Gms)、(Gms-pnipam)膨润后的粒径
另一组为以0.25mM、0.6mM、1.2mM DTSP交联的微球。图15与表6显示，0.25mM DTSP微球在0.5小时观察到尺度膨润至900微米并逐渐上升，于48小时微球膨胀破裂，此组交联剂不能稳定明胶网络，导致微球稳定性不佳。0.6mM DTSP观察到48小时内尺寸在稳定范围中，于72小时观察微球尺寸下降，随着时间缓慢溶化消失，而1.2mM DTSP交联微球在120小时内，尺度曲线平稳，粒径范围约300微米，证实交联剂浓度增加，得到网络稳固尺寸的微球。明胶与0.6-1.2mM DTSP的重量比为1.25：0.4～1.25：1(1:0.32～1:0.8)。
表6、不同交联剂浓度的可溶解还原型微球膨润后的粒径
表7是使用Gms-1.2mM DTSP与感温型聚合物P(NIPAM-co-Allylamine)结合后形成的Gms-DTSP-pnipam及Gms-DTSP-Se-pnipam微球。经过120小时观察，尺寸稳定变化，无破裂及溶胀现象，因此这三组适合进行细胞培育实验，证实成功合成还原感温可溶解型明胶微球。
表7、可溶解还原型与感温型微球膨润后的粒径
3.5微球膨胀度测试
将10毫克干重微球(W1)放在15毫升离心管浸入37℃培养基中，在不同的时间点去除培养基，并使用拭镜纸去除多余液体，留下湿样品秤量重量(W3)，每组重复三次。微球膨胀率(swelling ratio)计算公式为：
Swelling ratio＝(W3-W2)/W1
含水率(water content)计算公式为：
Water content(％)＝[1-W1/(W3-W2)]×100
W1:干燥样品重量；W2:干样品与离心管重量；W3:湿样品与离心管重量。
比较微球膨润度可用于评估聚合物微球37℃下吸水特性。实验将干燥的微球浸泡于培养基24小时后，秤量膨润后的重量。图16是不同明胶微球膨胀性质，观察出0.6mM与1.2mM DTSP浓度增加膨胀度随之下降，0.25mM DTSP于24小时内膨胀率达18.05，然于如前述表6所示于48小时后微球膨胀破裂，此组交联剂不能稳定明胶网络。表面物理涂层感温型聚合物膨胀度随之增加，同时水含量提高。将P(NIPAM-co-Allylamine)掺入明胶微球中会显著提升吸水能力，最明显者为GMS-DTSP-Se-pnipam微球，溶胀率12.62±0.07，水含量93.32±0.97％。
表8、不同微球膨润后的膨胀率及含水率
样品 膨胀率(w/w) 含水率(％)
Gms 3.24±0.05 67.14±0.26
Gms-pnipam 4.59±0.43 80.82±1.27
Gms-0.25mM DTSP 18.05±1.04 93.57±1.88
Gms-0.60mM DTSP 8.08±0.61 88.95±0.76
Gms-1.20mM DTSP 6.94±0.17 89.13±2.71
Gms-DTSP-pnipam 7.29±0.31 90.02±0.57
Gms-DTSP-Se-pnipam 12.62±0.07 93.32±0.97
3.6溶解型微球瓦解行为
双硫键(-S-S-)通常为半胱胺酸侧基之间两个硫原子自然交联形成，使用化学还原剂DTT活性游离半胱胺酸的烷基化来还原二硫键，使双半胱胺酸断裂成半胱胺酸，而双硒键与双硫键有类似氧化还原机制。双硒键氧化响应性能力大于双硫键，硒具有较大的原子半径和较弱的电负性，其较低的键能可轻易被还原，使双硒键断裂，生成硒酸盐的中间体(RSe-)。
本揭露将对氧化溶解型微球进行瓦解实验。为了模拟细胞培养环境，将Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam浸泡于培养基中，并维持在37℃下，随后加入25mM还原剂DTT，观察明胶聚合网络瓦解的变化。表9显示，Gms-DTSP-Se-pnipam在15分钟内就消失了，只剩下清澈溶液，其余两组于30分钟内皆完全瓦解。
表9、还原型微球于25mM DTT的瓦解行为
样品 瓦解时间(分钟)
Gms-DTSP 30
Gms-DTSP-pnipam 30
Gms-DTSP-Se-pnipam 15
实施例4细胞存活率
4.1敏感性嵌段共聚物
图17、图18、图19分别显示1％ALA、3％ALA、5％ALA感温型聚合物与MDCK细胞共培养24小时，三种共聚物浓度在最高1000μg/mL下细胞存活率分别为97.4％、96.5％、96.3％，证实此感温型聚合物具有与MDCK细胞(生医研究中作为标准的哺乳动物细胞系)的良好生物相容性。由于细胞受到有毒物质刺激时会引起细胞型态改变导致细胞凋亡，而通过MTT试验会与活细胞粒线体琥珀酸脱氢酶作用，还原反应下产生紫色结晶，并利用盘式分光光谱仪570nm，透过吸光度的检测得到定性活细胞数。
4.2明胶微球
微球属于载体，不能溶于培养基，其样品形状不均一。依照ISO-10993，将微球以0.1g/mL浸泡37℃培养基中持续24小时，萃取不同百分比浸泡微球过后的培养基与MDCK共培养24小时。图20显示使用戊二醛交联的可溶解型微球，在最高浓度0.1g/mL下细胞存活率可达82％。Gms-pnipam最高浓度下细胞存活率提升达96.3％。由于表面物理涂层感温型聚合物，故此感温型聚合物有良好生物相容性。图21显示使用DTSP交联的另一组可溶解还原型微球，三种类型微球也得到良好的生物相容性，皆能够大于90％以上。在最高的浓度下细胞存活率也达到94％，证实各组微球不具有毒杀细胞的能力，利于后续贴附培养实验。
实施例5细胞贴附脱附的测试
5.1感温型聚合物细胞脱贴附测试
细胞在P(NIPAM-co-Allylamine)的吸脱附特性实验中，将依照1％ALA、3％ALA、5％ALA分组，经旋转涂布于塑胶盖玻片上，各与0.5×106cells/mL MDCK共培养。光学显微下观察在37℃下，细胞贴满于P(NIPAM-co-Allylamine)膜上，以紧密铺平簇状形态生长，充分表现良好附着特性(图未示)。当温度降至4℃，共聚物膜表面上亲水基团与细胞带电基团相互作用，使细胞呈块状飘起，悬浮于PBS溶液中。另外使用空白塑胶盖玻片(未经温度敏感性嵌段共聚物涂层)作为对照组，将温度调至低温时，细胞形貌则未发生改变且未发生脱附，细胞仍粘附于盖玻片上(图未示)。
经由温度脱附下来的细胞，其活性使用活/死细胞成像试剂染色。活细胞可透过Calcein-AM钙黄绿素轻易进入渗透于活细胞膜中，遭水解后钙黄绿素存留在细胞内发出强烈绿色荧光，而死细胞受BOBOTM-3Iodide穿过破损细胞膜对细胞核染色释放出红色荧光。图22显示从荧光显微镜观察由三组P(NIPAM-co-Allylamine)膜脱附下的细胞，其重叠影像中绿色荧光比例居多，证明温度诱导脱附的细胞仍保持良好活性。
使用温度调控简易的手法，将细胞从感温响应性表面P(NIPAM-co-Allylamine)脱附下来，细胞不遭受伤害，同时也避免使用传统酶解法脱附造成的损伤疑虑。以工程医学角度而言，细胞通过传统酶解法切断细胞间连结，收获下来的细胞为独立的单颗，无法再生连续的细胞片，而透过温度敏感凝胶层能获得细胞间连接完整的细胞片，属于非侵入性脱附，汇合培养后的细胞需降低温度成功地收获为组织结构的细胞片，进而达到生医组织再生修复目的。
5.2感温型微球的温度诱导脱附行为
对于感温型聚合物P(NIPAM-co-Allylamine)，ALA浓度会增加结构中胺基(-NH2)，使正电荷及亲水性随之上升。细胞培养方式，同上述5.1所述。对于5％ALA的共聚物，细胞在贴附时有较粘的培养表面。在低温时细胞脱附，5％ALA的脱附时间比其他两组更长，显示ALA含量较多有助于细胞粘附，但嵌入过多的ALA单体，会使共聚物过于亲水而丧失感温特性。因此在制备感温型明胶微球时，经由以上细胞的吸脱附评估，最终选择5％ALA共聚物进行明胶微球表面感温修饰。
为检测P(NIPAM-co-Allylamine)于微球上的温度诱导细胞脱附能力，先测试Gms-pnipam、Gms-DTSP-pnipam的脱附行为。明胶微球通过温度诱导细胞脱附，在低温4℃下进行脱附30及60分钟后，可以看出细胞只有些微掉落(图未示)，证实此明胶微球使用温度诱导进行细胞脱附有较差的效果，需要的时间较长。因此需使用传统酶解及瓦解法，提升其细胞与载体脱附的效率。
5.3可溶解型微球细胞的脱贴附测试
以荧光显微经观察，用Hoechst 33342观察细胞有无粘附在微球表面进行生长。Hoechst 33342可以穿透细胞膜发出蓝色荧光，荧光显微镜观察后证实蓝色细胞贴附于五种微球上(包括Gms、Gms-pnipam、Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam，图未示)，以便后续评估五款微球于吸附细胞的能力。
为了评估微球细胞吸脱附测试，将Gms、Gms-pnipam膨润后，每组以0.5×106cells/mL MDCK细胞培养，在1、3、5、7、24小时用光学显微镜观察MDCK于微球上贴附情况，计算细胞贴附率。结果显示，1小时就能观察到细胞开始贴附微球边缘上，但Gms因微球团聚，尺寸不均一，尺寸小颗的微球较难观察出有无贴附细胞。而Gms-pnipam尺寸较均匀，能看出细胞均有明显贴附上去，因此Gms-pnipam的细胞贴附效果优于改质前，故pnipam有利于细胞粘附(图未示)。另外，结果亦显示，胰蛋白酶解法完全进行细胞脱附实验。将微球浸泡胰蛋白酶、37℃中5分钟后观察，Gms表面有细胞掉落，随着时间增加，胰蛋白酶能断开赖胺酸或精胺酸形成的肽键，细胞脱附效果随胰蛋白酶消化作用而增加。10分钟后以PBS清洗微球收回细胞，清洗过后的微球表面还是残存很多的细胞，脱附效果不佳。另一组Gms-pnipam经5分钟胰蛋白酶作用，可以看到细胞及感温型聚合物同时切断下来，10分钟后看出细胞几乎完全掉落于悬浮液中，由PBS清洗微球收回细胞后，微球表面趋近光滑平坦状态，证实此感温型聚合物有助于细胞脱附效果(图未示)。
此外，将贴附细胞的Gms、Gms-pnipam，加入活/死染剂来辨识明胶微球表面上细胞死活程度。染活细胞的钙黄绿素(Calcein-AM)会激发绿色荧光，而染死细胞的BOBO-3Iodide激发红色荧光。结果显示细胞贴附于微球上有大量绿色荧光细胞与少数死细胞，而细胞在使用胰蛋白酶脱附时间太长会有破坏膜蛋白造成的损伤。另外，Gms-pnipam脱附下来的细胞呈绿色荧光，红色细胞占少数，而Gms则是脱附10分钟后，细胞未能完全脱附，许多健康细胞仍然贴附于微球上。因此证明Gms具有吸附细胞的能力，但微球表面物理涂层感温型聚合物后，可提升载体释放细胞的脱附能力。
5.4可溶解型微球的细胞贴附率及脱附行为
图23显示微球Gms、Gms-pnipam吸附细胞的能力。培育1小时后Gms-pnipam达到约40％细胞贴附率、Gms为23％细胞贴附率，而24小时后Gms、Gms-pnipam分别为74％、85％。经表面感温型聚合物涂层后，贴附率提升11％。接着评估明胶微球Gms、Gms-pnipam脱附特性，上节5.3已提到Gms、Gms-pnipam经胰蛋白酶消化相同时间，Gms脱附效率小于Gms-pnipam。收集脱附下来的细胞经清洗离心计算后，Gms、Gms-pnipam所收获细胞数分别为192500cell/mL、355750cell/mL，经表面感温型聚合物涂层后，其脱附比例提升45.8％。
5.5可溶解还原型微球的脱贴附测试
本揭露于制作微球时使用氧化还原特性的双硫键结构的交联剂DTSP，合成出Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSPSe-pnipam培养两天后用光学显微镜观察MDCK细胞于微球上贴附的情况。
Gms-DTSP-pnipam还原型明胶微球使用三种GSH、L-半胱胺酸(L-cysteine)、DTT还原剂(浓度皆为25mM)进行瓦解行为的评估，观察细胞脱附的情形。从图24可知，使用GSH还原剂60分钟后微球均无胀破、溶解等变化；从图25可知，使用L-半胱胺酸还原剂经过30分钟后微球肿大且细胞成团块状掉落，60分钟时微球完全溶解消失；从图26可知，使用DTT还原剂5分钟就能观察到微球肿大变形快速瓦解，于30分钟时只剩下团状细胞。在三种测试的还原剂中，DTT含双硫醇在切断双硫键表现出最佳的效果，比起GSH和L-半胱胺酸有更高的氧化还原电位，GSH和L-半胱胺酸则为单硫醇需要其他含硫醇的分子催化才能加速提升双硫键断裂还原。
Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam使用DTT还原剂需要30分钟使微球降解消失，特别的是Gms-DTSP溶解型态属于DTT将微球胀破，交联网络遭还原剂切断使球体破裂细胞最终为单颗型态。表面涂层的Gms-DTSP-pnipam微球瓦解型态为DTT将细胞以团状的方式脱离，推断有外层感温型聚合物涂层保护导致涂层与细胞先从外脱落，才能看到球体自身慢慢瓦解。最后的细胞呈团状型态，于是将团聚的细胞与感温型聚合物涂层一起脱落下来(图未示)。
另外，感温型聚合物涂层于低温下属于亲水性质，Gms-DTSP-pnipam放置于低温(如4℃)于5分钟逐渐崩解，于10分钟细胞成为分散状态。而Gms-DTSP-Se-pnipam瓦解时间最短(图未示)。
将贴附细胞的Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam，加入活/死染剂来辨识明胶微球表面上细胞死活程度。结果显示，细胞贴附于微球被大量绿色荧光细胞包附，瓦解后脱附下来的细胞被激发成绿色荧光(图未示)，证明还原型明胶微球具有吸附细胞能力、且瓦解时细胞仍存活的能力。
5.6还原型明胶微球的细胞贴附率及脱附行为
图27显示可溶解还原型与感温型微球Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam吸附细胞的能力。培养1小时后Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam的细胞贴附率分别为40％、39％、29.5％；8小时后Gms-DTSP最先达到88％；24小时后Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam细胞吸附率分别为95％、90％、47％。从实施例3.3的SEM观察微球表面具有微小凹凸孔洞增加细胞贴附，其中Gms-DTSP-pnipam吸附细胞的能力优于Gms-DTSP-Se-pnipam。
5.7收获细胞的回养测试
为了证明使用明胶微球收获下来的细胞具有活性及后续的医学应用的能力，将细胞从Gms、Gms-pnipam、Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam、Gms-DTSP-Se-pnipam脱附后，收获的细胞经由清洗离心后放入至培养皿进行回养。结果显示，培养一天后观察得知由Gms、Gms-DTSP-Se-pnipam培养的细胞，原始收回下来的细胞较少导致生长能力较慢，而其余Gms-pnipam、Gms-DTSP、Gms-DTSP-pnipam皆呈现八分满的状态，细胞紧密铺平簇状形态生长，表现良好的细胞活性(图未示)。因此，本揭露的微球脱附下来的细胞具有重复培养的能力。
本揭露的可溶解还原型的微载体通过还原型交联剂，有助于细胞的贴附，使用还原剂可易于细胞的脱附。在一些实施方式中，使用还原剂30分内就能脱附细胞，且细胞脱附后均为活细胞，证明此方式并无毒性。
本揭露的可溶解感温型的微载体通过感温型聚合物的包覆，培养温度高于LCST时有助于细胞的贴附；通过温度低于LCST时，有助于细胞的脱附。在一些实施方式中，浸泡在培养基中膨润后球型变完整，粒径稳定控制在280-350微米间，同时微球表面经感温型聚合物保护，有助于微球在37℃的稳定性。在一些实施方式中，经由感温型聚合物改质，细胞贴附率提升11％，使用酶解法细胞脱附率提升45.8％，有效提升微载体的贴附与脱附能力。
虽然本揭露已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭露，任何熟悉此技艺者，在不脱离本揭露的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本揭露的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (20)

1.一种可溶解的微载体，其特征在于，包含：
一溶解型聚合物，该溶解型聚合物以一还原型交联剂将多个溶解型单体彼此键结。
2.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，该还原型交联剂包含与该溶解型聚合物的羟基、胺基、硫醇基、或羧酸基键结。
3.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，该还原型交联剂包含双硫键交联剂、或双硒键交联剂。
4.根据权利要求3所述的微载体，其特征在于，该双硫键交联剂包含3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)、3,3’-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)、胱胺酸或二巯基二琥珀酰亚胺酰胺丙酸。
5.根据权利要求3所述的微载体，其特征在于，该双硒键交联剂包含3,3'-二硒代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)、3,3'-二硒代二丙酸,2,2'-二硒代二乙胺,2,2'-二硒代二乙醇、或其组合。
6.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，该溶解型聚合物包含纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚醣、玻尿酸、果酸或其组合。
7.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，该溶解型聚合物与该还原型交联剂的重量比为1：0.08至1：0.8。
8.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，还包含一感温型聚合物，包覆该溶解型聚合物。
9.根据权利要求8所述的微载体，其特征在于，该感温型聚合物包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯基己内酰胺、聚(2-异丙基-2-恶唑啉)、泊咯沙姆、或其组合。
10.根据权利要求9所述的微载体，其特征在于，该感温型聚合物还包含丙烯酸、丙烯胺、丙烯酰胺、[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯或其组合。
11.根据权利要求10所述的微载体，其特征在于，该感温型聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)或其组合。
12.根据权利要求11所述的微载体，其特征在于，该丙烯酸占该聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)的重量百分比为1％至15％。
13.根据权利要求8所述的微载体，其特征在于，该感温型聚合物以该还原型交联剂键结于该溶解型聚合物之外。
14.根据权利要求8所述的微载体，其特征在于，该感温型聚合物以物理性结合于该降解型聚合物之外。
15.一种制备可溶解的微载体的方法，其特征在于，包含以下步骤：
提供一溶解型聚合物；以及
将该溶解型聚合物与一还原型交联剂进行一混合制程，当该溶解型聚合物与该还原型交联剂接触时会进行交联，获得该可溶解的微载体。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，该提供该溶解型聚合物的步骤，包含：
加热多个溶解型单体至呈现液态；
混和一油与一表面活性剂，获得一混合液；
混和该混合液与所述多个溶解型单体，获得一油包水乳液；以及
将该油包水乳液冷却至定型，获得该溶解型聚合物。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，还包含：
提供一感温型聚合物；以及
混合该可溶解的微载体与该感温型聚合物，获得一可溶解感温型的微载体。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，该混合制程包含微流道、滴定、静电纺丝、乳化聚合、薄膜乳化或其组合。
19.一种如权利要求1所述的可溶解的微载体的使用方法，其特征在于，当该可溶解的微载体接触一还原剂时，则该可溶解还原型的微载体进行瓦解。
20.一种如权利要求8所述的可溶解的微载体的使用方法，其特征在于，当该可溶解的微载体接触一还原剂、接触一较低临界溶液温度、先接触该还原剂再接触该较低临界溶液温度、或先接触较低临界溶液温度再接触该还原剂时，则该可溶解的微载体进行瓦解。
CN202210127504.4A 2022-02-11 2022-02-11 可溶解的微载体、其制备方法及其使用方法 Pending CN116622615A (zh)

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