CN116621931A - 一种放线菌环脂肽类化合物及其提取方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种放线菌环脂肽类化合物，结构为以下化合物1‑3中的一种：本发明提供的放线菌环脂肽类化合物的提取方法简单，抗菌活性显著。本发明为研究和开发新抗菌药提供了新的先导化合物，为含有非常见氨基酸的环脂肽类活性物质立体构型的确定提供了新思路，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。

Description

一种放线菌环脂肽类化合物及其提取方法与应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体地说，涉及一种放线菌环脂肽类化合物及其提取方法与应用。
背景技术
环脂肽是指一类具有两亲性的环状结构分子，一般由肽片段和至少一个脂肪酸通过酯键或酰胺键形成。环脂肽类成分主要来源于微生物的次生代谢产物，并且具有广泛的抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎等生物活性，从而引起人们的广泛关注。来源于土壤玫瑰孢链霉菌的达托霉素作为第一个用于临床用药的环脂肽类抗生素，2003年9月在美国上市，用于治疗由革兰阳性菌感染所致的并发性皮肤及皮肤结构感染，亦可用于治疗甲氧西林耐药菌金黄色葡萄球菌及对万古霉素抗性的粪肠球菌。近年来，包括多粘菌素和达托霉素在内的几种环脂肽类抗生素已经获得FDA批准，用于治疗多重耐药性超级细菌感染，新型环脂肽分子可能成为一类新的抗菌剂。并且面对越来越多耐药病菌的出现，研究者迫切需要寻找新的抗生素。从海洋菌株来源的环脂肽类分子中发现结构新颖、作用机制独特的活性先导化合物具有广阔的前景。
近年来，液质联用技术的发展，快速推动了海洋天然产物的发现进度，特别是针对紫外吸收较小，TLC不显色的环脂肽类化合物，该技术为从复杂天然提取物中发现微量环脂肽提供了可行的方法，加快了海洋抗菌药物开发的速度。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种放线菌环脂肽类化合物。
本发明的第二目的是提供一种放线菌环脂肽类化合物的提取方法。
本发明的第三目的是提供一种放线菌环脂肽类化合物在制备抗菌药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种放线菌环脂肽类化合物，该化合物是一种具有抗菌活性的环脂肽，并且含有以下特殊β-methyl-leucine片段：
结构为以下化合物1-3中的一种：
本发明第二方面提供了一种所述放线菌环脂肽类化合物的提取方法，包括以下步骤：
第一步，发酵：将附生于棕色扁海绵的蓝灰异壁放线菌培养于A1(酵母浸膏，4g；可溶性淀粉，10g；蛋白胨，2g；海盐，33g；去离子水，1L，pH：7.0)液体培养基，培养21天后，用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液经过减压浓缩，得到乙酸乙酯层；
第二步，萃取分离：第一步获得的乙酸乙酯层经减压浓缩后得到的粗浸膏混悬于90％的甲醇水中，用等体积的石油醚萃取，将90％的甲醇水层稀释至50％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取，合并萃取液并减压浓缩，得到二氯甲烷层浸膏；
第三步，分离富集：将第二步制备的二氯甲烷层浸膏通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的MeOH-CH2Cl2溶剂洗脱，并采用LC-MS定位追踪的方式，将分子量为700-900Da的化合物进行定位追踪；采用ODS中压柱色谱分离，用5％-90％的MeOH/H2O梯度洗脱，采用LC-MS追踪定位分析，获得包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分；
第四步，LC-MS导向分离：在获得分子量信息和色谱保留行为基础上，采用LC-MS导向的液质联用仪对上述包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分进行分离纯化(20-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 780.54，800.51和808.57)，获得化合物1、化合物2、化合物3。
本发明第三方面提供了一种所述放线菌环脂肽类化合物在制备抗菌药物中的应用。
所述抗菌药物中的菌指的是Helicobacter pylori G27、Helicobacter pylori26695、Mycolicibacterium smegmatisATCC607。
本发明的放线菌环脂肽类化合物，其中化合物3对Helicobacter pylori G27、Helicobacterpylori 26695和Mycolicibacterium smegmatis ATCC607这三株细菌显示出中等抑制活性。本发明为研究和开发新的抗菌药物提供了新的先导化合物，为放线菌环脂肽类活性成分的发现提供了新思路，也为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的放线菌环脂肽类化合物的提取方法简单，且该化合物抗菌活性显著。本发明为研究和开发新抗菌药提供了新的先导化合物，为含有非常见氨基酸的环脂肽类活性物质立体构型的确定提供了新思路，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。
本发明从放线菌中分离获得一种具有抗菌活性的含有非常见β-甲基-亮氨酸的新环脂肽类化合物，并且运用先进的Marfey法与生物合成和外消旋法相结合的方式，确定此类化合物的立体构型，为今后的药物活性研究提供了基础。
附图说明
图1是放线菌环脂肽类化合物1-3的发现流程示意图。
图2是放线菌环脂肽类化合物1的结构阐明示意图。
图3是放线菌环脂肽类化合物2的结构阐明示意图。
图4是放线菌环脂肽类化合物3的结构阐明示意图。
图5是放线菌环脂肽类化合物1-3对十三株菌株抑制结果示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
从放线菌中发现并提取放线菌环脂肽类化合物1-3
从环脂肽化合物的质谱裂解机制中发现，经碰撞诱导环脂肽解离后形成的二级碎片离子往往是组成该环脂肽的基本单元—各氨基酸残基的离子。根据这一特点，通过分析二级MS数据，环脂肽类化合物的氨基酸片段鉴定与连接顺序通过碎片离子得到了佐证。如图1所示，在获得其分子量和色谱保留行为基础上，采用LC-MS联用技术将其分离纯化，获得三个新的环脂肽类单体化合物，即放线菌环脂肽类化合物1-3。
1)通过LC-MS分析挑选样品
多株放线菌采用小规模液体培养21天后，用等体积的乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到粗浸膏后，经LC-MS用5％-95％的乙腈/H2O梯度洗脱，发现了一簇集中于700-900Da的分子离子峰。
2)样品前处理
所述粗浸膏通过石油醚除脂，后溶于50％的甲醇和水，用等比例的二氯甲烷萃取，获得二氯甲烷层。
3)样品富集
所述二氯甲烷层通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的MeOH-CH2Cl2溶剂洗脱，并采用质谱定位追踪的方式，主要将大分子量的化合物富集；再通过反相中压柱色谱及LC-MS导向的全制备质谱仪，有效的去除杂质成分，富集环脂肽类成分。
4)质谱引导制备分离
在获得其碎片离子信息和色谱保留行为基础上，结合质谱引导制备液相将m/z780.54，800.51和808.57[M+H]+分离。
从放线菌中提取放线菌环脂肽类化合物1-3的具体步骤如下：
第一步，发酵：将附生于棕色扁海绵(采自中国南海)的蓝灰异壁放线菌培养于A1(酵母浸膏，4g；可溶性淀粉，10g；蛋白胨，2g；海盐，33g；去离子水，1L，pH：7.0)液体培养基，培养21天后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩后得到乙酸乙酯层(40.0g)；
第二步，萃取分离：第一步获得的乙酸乙酯层经减压浓缩后得到的粗浸膏混悬于90％的甲醇水中，用等体积的石油醚萃取4次，将90％的甲醇水层稀释至50％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取4次，合并萃取液并减压浓缩，得到二氯甲烷层浸膏(10.0g)；
第三步，分离富集：将第二步制备的二氯甲烷层浸膏通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的MeOH-CH2Cl2溶剂洗脱，并采用LC-MS定位追踪的方式，将分子量为700-900Da的化合物进行定位追踪；采用ODS中压柱色谱分离，用5％-90％的MeOH/H2O梯度洗脱，采用LC-MS追踪定位分析，获得包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分；
第四步，LC-MS导向分离：在获得分子量信息和色谱保留行为基础上，采用LC-MS导向的液质联用仪对上述包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分进行分离纯化(20-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 780.54，800.51和808.57)。LC-MS条件分别为39-41％乙腈-水，35-38％乙腈-水，28-35％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测到分子离子m/z 780.54(化合物1)；m/z 800.51(化合物2)，m/z 808.57(化合物3)。
图1是放线菌环脂肽类化合物1-3的发现和获得流程示意图。
化合物1-3的结构如下所示：
通过上述步骤制得的放线菌环脂肽类化合物1-3的理化性质和核磁共振数据如下：
化合物1：无色胶；IR(micro-IR)νmax 3274,2958，2873，1739，1648，1533，1467，1386，1234，1062和977cm-1；1H NMR(DMSO-d6，600MHz)和13CNMR(DMSO-d6，150MHz)数据如表1所示；ESIMS/MS数据如图2中C所示：HRESIMS m/z780.5363[M+H]+(calcd for C38H70N9O8，780.5347)。
化合物2：无色胶；(c 0.05，MeOH)；IR(micro-IR)νmax 3274，2959，2874，1737，1641，1525，1468，1384，1231，1163，1061，976和694cm-1，1H NMR(DMSO-d6，600MHz)和13C NMR(DMSO-d6，150MHz)数据如表2所示；ESIMS/MS数据如图3中C所示：HRESIMS m/z800.5052[M+H]+(calcd for C40H66N9O8，800.5034)。
化合物3：无色胶；(c 0.05，MeOH)；IR(micro-IR)νmax 3278，2957，2871，1738，1632，1597，1537，1466，1351，1233和1061cm-1；1H NMR(DMSO-d6，600MHz)和13C NMR(DMSO-d6,150MHz)数据如表3所示；ESIMS/MS数据如图4中C所示：HRESIMS m/z 808.5676[M+H]+(calcd for C40H74N9O8，808.5660)。
放线菌环脂肽类化合物1-3的核磁共振谱数据见表1、表2、表3。
表1：化合物1的核磁共振谱数据(DMSO-d6)
化合物1的平面结构，经分析2D NMR(TOCSY、COSY和HMBC)谱，确定组成它的1个4-甲基戊酸和6个氨基酸残基包括两个β-甲基-亮氨酸、一个甘氨酸、一个苏氨酸、一个精氨酸和一个亮氨酸。
6个氨基酸残基的连接顺序，通过分析HMBC和ROESY相关信号及ESI-MS/MS确定。HMBC相关信号β-Me-Leu1-NH/Gly-CO、Gly-Hα/β-Me-Leu2-CO和ROESY相关信号β-Me-Leu1-NH/Gly-Hα、Gly-NH/β-Me-Leu2-Hα、β-Me-Leu2-NH/Thr-Hα和Thr-Hβ/β-Me-Leu1-Hα确定了结构片段cyclo-(β-Me-Leu1-Gly-β-Me-Leu2-Thr)的存在。HMBC相关信号Thr-Hα/Arg-CO、Arg-NH/Leu-CO、Leu-NH/4-MPA-CO确认了另一个侧链Arg-Leu-4-甲基戊酸的存在，并进一步确定该环脂肽的结构为cyclo-(β-Me-Leu1-Gly-β-Me-Leu2-Thr)-Arg-Leu-4-甲基戊酸。通过ESI-QTOF-MS/MS质谱分析发现，b系碎片离子峰：m/z 653、596、469、368和212，对应母离子依次丢失β-Me-Leu1、Gly、β-Me-Leu2、Thr和Arg这些中性分子的碎片离子峰，这证实了该环脂肽的NMR结构解析结果(如图2所示，图2是放线菌环脂肽类化合物1的结构阐明示意图)。
表2：化合物2的核磁共振谱数据(DMSO-d6)
化合物2和1的肽部分结构是相同的，分析2D NMR(TOCSY、COSY和HMBC)谱，确定组成该化合物的1个苯乙酸和6个氨基酸残基包括两个β-甲基-亮氨酸、一个甘氨酸、一个苏氨酸、一个精氨酸和一个亮氨酸。
6个氨基酸残基的连接顺序，通过分析HMBC和ROESY相关信号及ESI-MS/MS确定。化合物2与化合物1的结构只有脂肪酸侧链不同，化合物2中的苯乙酸取代了化合物1中的4-甲基戊酸，确定该环脂肽的结构为cyclo-(β-Me-Leu1-Gly-β-Me-Leu2-Thr)-Arg-Leu-苯乙酸。
通过ESI-QTOF-MS/MS质谱分析发现，b系碎片离子峰：m/z 653、596、469、368和212，对应母离子依次丢失β-Me-Leu1、Gly、β-Me-Leu2、Thr和Arg这些中性分子的碎片离子峰，这证实了该环脂肽的NMR结构解析结果(如图3所示，图3是放线菌环脂肽类化合物2的结构阐明示意图。)。
表3：化合物3的核磁共振谱数据(DMSO-d6)
化合物3和1的肽部分结构是相同的，经分析2D NMR(TOCSY、COSY和HMBC)谱，可以确定组成该化合物的1个6-甲基庚酸和6个氨基酸残基包括两个β-甲基-亮氨酸、一个甘氨酸、一个苏氨酸、一个精氨酸和一个亮氨酸。
6个氨基酸残基的连接顺序，通过分析HMBC和ROESY相关信号及ESI-MS/MS确定。化合物3与化合物1的结构只有脂肪酸侧链不同，化合物3中的6-甲基庚酸取代了化合物1中的4-甲基戊酸，确定该环脂肽的结构为cyclo-(β-Me-Leu1-Gly-β-Me-Leu2-Thr)-Arg-Leu-6-甲基庚酸。
通过ESI-QTOF-MS/MS质谱分析发现，b系碎片离子峰：m/z 653、596、469、368和212，对应母离子依次丢失β-Me-Leu1、Gly、β-Me-Leu2、Thr和Arg这些中性分子的碎片离子峰，这证实了该环脂肽的NMR结构解析结果(如图4所示，图4是放线菌环脂肽类化合物3的结构阐明示意图)。
化合物1-3的绝对构型通过先进的Marfey方法确定。图2是放线菌环脂肽类化合物1的结构阐明示意图，其所有的氨基酸β-Me-Leu、Leu、Thr和Arg的立体构型分别为(2S,3R)-β-Me-Leu、L-Leu、L-Thr和D-Arg；图3是放线菌环脂肽类化合物2的结构阐明示意图，其所有的β-Me-Leu、Leu、Thr和Arg的立体构型分别为(2S,3R)-β-Me-Leu、L-Leu、L-Thr和D-Arg；图4是放线菌环脂肽类化合物3的结构阐明示意图，其所有的β-Me-Leu、Leu、Thr和Arg的立体构型分别为(2S,3R)-β-Me-Leu、L-Leu、L-Thr和D-Arg。
实施例2
本发明制备的化合物1-3的细胞毒实验
CTG法被用于评估本发明的环脂肽类化合物1-3的体外细胞毒活性。所用肿瘤细胞株为人非小细胞肺癌细胞(PC9)、人卵巢癌细胞(A2780)、组织细胞淋巴瘤细胞(U-937)、淋巴瘤细胞(Raji)、Burkitt's淋巴瘤细胞(Daudi)、人***癌细胞(PC-3)、人结肠癌细胞(HT-29)和人急性早幼粒细胞白血病细胞(NB4)。DMEM用于培养A2780和HT-29，而RPMI 1640用于培养PC9、U-937、Raji、Daudi、PC-3和NB4。这些培养基均加入1％抗生素、10％FBS和1％丙酮酸钠，置于温度为37℃，含5％CO2的培养箱培养。样品用DMSO溶解后低温保存，DMSO的最高浓度控制在不影响检测活性的范围之内，倍比稀释为1-100μg/mL的工作浓度。待细胞株培养至对数生长期时，取培养液将其制成单细胞悬液1×106个/mL，并将该悬液加到96孔板中，每孔100μL。并将96孔板于5％CO2，37℃培养箱中培养24h后，加入受试药物(本发明的环脂肽类化合物1-3和阳性对照顺铂)，使其终浓度分别为0.01，0.03，0.10，0.30，1.0，3.0，10.0，20.0μM。所述受试药物设3个复孔，阴性对照为等体积培养基及溶媒对照为相应浓度的DMSO，以消除DMSO对细胞生长的影响。添加受试药物后的96孔板于5％CO2，37℃培养箱中培养48h后，每孔加入10μL CTG溶液，继续培养4h，在450nm处测定各孔吸光值(OD值)。抑制百分数通过线性回归方法确定，并进而计算出IC50值。结果显示，本发明的环脂肽类化合物1-3在IC50值为20μM时均未显示出对肿瘤细胞的生长抑制活性，说明这三个环脂肽在浓度为20μM时，对这八株肿瘤细胞的抑制率皆未达到50％，为今后此类化合物抗肿瘤活性方面的研究提供了参考。
本发明化合物1-3的抗菌实验
菌株来源：购自南京医科大学。
MIC通过肉汤微稀释法来进行评估。首先，幽门螺杆菌菌株在含有10％胎牛血清(FCS)的brain heart infusion(BHI)培养基中，使用三气培养箱(Binder，型号CB160；德国)，在85％N2、5％O2、10％CO2和90％相对湿度条件下进行培养，而其他细菌病原体则在Mueller-Hinton(MH)肉汤中进行常氧培养。白念珠菌在含有L-谷氨酰胺的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640培养基(Sigma)中培养。随后，挑选上述细菌，在BHI/MH肉汤中连续培养，使细菌达到对数生长期，用MH肉汤稀释到5×106CFU/ml，用RPMI肉汤将白色念珠菌稀释到(0.5～2.5)x104 CFU/mL。然后，将测试化合物1-3溶解在DMSO中，在96孔板中从32μg/mL的浓度开始连续稀释2倍体积至不同浓度，倍比稀释后，每孔有90μL含有受试化合物的培养基，在每个孔中加入等量(10L)的微生物悬浮液。幽门螺杆菌在37℃下培养72小时，其他细菌或白色念珠菌培养24小时后，检查平板，并记录MIC。甲硝唑、两性霉素B、氨苄青霉素和万古霉素分别用作幽门螺杆菌、真菌、其他细菌的阳性对照。图5是放线菌环脂肽类化合物1-3对十三株菌株抑制结果示意图。结果显示，本发明的环脂肽类化合物3对Helicobacter pylori G27、Helicobacter pylori 26695和Mycolicibacteriumsmegmatis ATCC607菌株具有中等生长抑制活性，其有效抑制浓度MIC值为32μg/mL，因此可用于制备抗菌药物。本发明为研制新的抗菌药物提供了新的先导化合物。
以上所述仅是本发明的较佳实施例，不对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，但该等披露并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例。未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (6)

1.一种放线菌环脂肽类化合物，其特征在于，结构为以下化合物1-3中的一种：
2.一种权利要求1所述的放线菌环脂肽类化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，发酵：将附生于棕色扁海绵的蓝灰异壁放线菌培养于A1液体培养基，培养21天后，用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液经过减压浓缩，得到乙酸乙酯层；
第二步，萃取分离：第一步获得的乙酸乙酯层经减压浓缩后得到的粗浸膏混悬于90％的甲醇水中，用等体积的石油醚萃取，将90％的甲醇水层稀释至50％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取，合并萃取液并减压浓缩，得到二氯甲烷层浸膏；
第三步，分离富集：将第二步制备的二氯甲烷层浸膏通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的MeOH-CH2Cl2溶剂洗脱，并采用LC-MS定位追踪的方式，将分子量为700-900Da的化合物进行定位追踪；采用ODS中压柱色谱分离，用5％-90％的MeOH/H2O梯度洗脱，采用LC-MS追踪定位分析，获得包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分；
第四步，LC-MS导向分离：在获得分子量信息和色谱保留行为基础上，采用LC-MS导向的液质联用仪对上述包含大分子量的环脂肽类化合物的精细馏分进行分离纯化，获得化合物1、化合物2、化合物3。
3.根据权利要求2所述的放线菌环脂肽类化合物的提取方法，其特征在于，所述A1液体培养基是由以下组分制成：酵母浸膏，4g；可溶性淀粉，10g；蛋白胨，2g；海盐，33g；去离子水，1L，pH：7.0。
4.根据权利要求2所述的放线菌环脂肽类化合物的提取方法，其特征在于，所述LC-MS导向的液质联用仪的条件：20-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 780.54，800.51和808.57。
5.一种权利要求1所述的放线菌环脂肽类化合物在制备抗菌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的放线菌环脂肽类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述抗菌药物中的菌指的是Helicobacter pylori G27、Helicobacter pylori 26695、Mycolicibacterium smegmatisATCC607。
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