CN116593701A - 一种含有生物阻断剂的肌酸激酶同工酶检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有生物阻断剂的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。本发明的生物阻断剂包含了针对嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子等干扰的多种动物免疫蛋白物质，对常规含量的内源干扰因素具有良好的阻断效果，能有效减少由于内源干扰造成检测的假阳性结果。通过向检测试剂中按v/v计0.1％至2％引入所述阻断剂，来改善检测中嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子、RF干扰以及改善检测结果假阳性。
Description
技术领域
本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及免疫比浊法对肌酸激酶同工酶的检测。
背景技术
1960年CK首先被研究并认为可以用来诊断ACS，但是由于其特异性较差于1970年
后被肌酸激酶同工酶(CKMB)取代。随之，CKMB由于其具有较好的特异性和灵敏度被推荐为上一代心肌梗死(AMI)的诊断金标准。
胶乳增强免疫比浊法是一种抗原抗体结合动态测定方法，通过将待测的目的抗原
相对应的抗体包被在胶乳微球上，使抗原抗体结合物的体积增大，在检测光路中，透射光和
散射光的强度变化更为显著，从而提高检测的灵敏度。还可以将不同平均粒径的胶乳微球
组合使用，进一步提高检测的灵敏度和线性范围。但是，发明人在研究中发现，将胶乳增强
免疫比浊法应用于血液样本中的CK-MB的检测时，样本中存在的类风湿因子(rheumatoid
factor ,RF)会对检测造成干扰。另外，样品中的蛋白质等成分与抗体的非特异性结合导致背景信号，也会对检测造成干扰。
鉴于上述，本领域仍需要一种特异性高、假阳性低、抗RF干扰且价格低廉的CKMB的检测试剂盒。
发明内容
本发明提供了一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含缓冲液、促凝剂、生物阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂，R2试剂包含缓冲液、CK-MB抗体包被纳米微球、保护剂、防腐剂；
其中，R2试剂中的缓冲液为TAPS，R1中的生物阻断剂包括动物免疫蛋白小鼠IgG、小鼠IgM、兔IgG、山羊IgG、牛IgG、马IgG中的至少一种；R2试剂的CK-MB抗体包被纳米微球中的纳米微球，为平均直径在100-200nm之间的小直径微球和平均直径在200-400nm之间的大直径微球按1:20-20:1体积比混合的复合纳米微球，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间。
其中R1缓冲液选自HEPES缓冲液、TRIS-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液的至少一种。
在一些实施方案中，R1防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300的至少一种。
在一些实施方案中，所述R1表面活性剂选自Tween20、Tween80、NP40、thesit的至少一种。
在一些实施方案中，所述R2保护剂选自牛血清蛋白、卵清蛋白、脱脂乳、小牛血清的至少一种。
在一些实施方案中，R1中促凝剂为聚乙二醇，选自PEG6000、PEG8000、PEG12000、PEG20000的至少一种，优选PEG20000。
在一些实施方案中，所述R2中防腐剂为叠氮钠。
在一些实施方案中，R2中保护剂为牛血清蛋白、卵清蛋白、脱脂乳、小牛血清。
在一些实施方案中R1中的生物阻断剂为兔IgG（1%）+山羊IgG（1%）。
根据一些实施方案，提供了阻断剂在改善检测结果假阳性中的用途。
在一些实施方案中，所述阻断剂为生物复合阻断剂。在一些实施方案中，所述检测是指肌酸激酶同工酶乳胶增强免疫比浊法检测。
根据一些实施方案，提供了阻断剂在改善检测中嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子、RF干扰的用途。在一些实施方案中，所述阻断剂为生物复合阻断剂。
在一些实施方案中，所述检测是肌酸激酶同工酶乳胶增强免疫比浊法检测。在一些实施方案中，通过向检测试剂中按v/v计0.1％至2％引入所述阻断剂，来改善检测中嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子、RF干扰以及改善检测结果假阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本申请公开了一种含有生物阻断剂的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，通过向检测试剂中按v/v计0.1％至2％引入所述阻断剂，来改善检测中嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子、RF干扰以及改善检测结果假阳性，当生物阻断剂为兔IgG+山羊IgG的组合时二者存在协同作用，能够更好地提高检测效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
实施例1
第一试剂的制备
1、称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、15mL生物阻断剂(5mg/ml)，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L即得试剂第一试剂（1）。
2、称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、10mL阻断剂(5mg/ml)，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂(2)。
3. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、5mL阻断剂(5mg/ml)，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（3）。
4. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（4）。
5. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、15mL IIR阻断剂，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（5）。
6. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、15mL HBR阻断剂，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（6）。
7. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、15mL 小鼠IgG阻断剂，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（7）。
8. 称取4.766g HEPES、5.844g NaCl、12g PEG20000、15g Tween80、1.0g叠氮钠、7.5g BSA、15mL RF阻断剂，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L制备第一试剂（8）。
实施例2
抗体包被颗粒纳米微球的制备
1.用MES缓冲液将颗粒(80nm，羧基)稀释至1％(w/v)；2.用MES缓冲液将抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；5.再加入封闭剂，常温过夜放置；6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。步骤1和步骤2顺序可互换。
实施例3
第二试剂的制备
将实施例2制备的颗粒加入400mL双蒸水，补加4.87g TAPS、5g BSA、1g叠氮钠、50g蔗糖，搅拌混匀，调节ph至7.5，补加双蒸水至500mL，超声至主波长吸光度基本不变化即得第二试剂(1) 。
实施例4
试剂盒的制备按照下表将前述试剂组装成试剂盒。
试剂盒的组装第一试剂第二试剂
试剂盒1 第一试剂(1)第二试剂(1)
试剂盒2 第一试剂(2)第二试剂(1)
试剂盒3 第一试剂(3)第二试剂(1)
试剂盒4 第一试剂(4)第二试剂(1)
试剂盒5 第一试剂(5)第二试剂(1)
试剂盒6 第一试剂(6)第二试剂(1)
试剂盒7第一试剂(7)第二试剂(1)
试剂盒8 第一试剂(8)第二试剂(1)
测试例1
灵敏度测试对上述实施例所制备的8个试剂盒采用全自动生化仪(比如，日立7180)进行测试。测定波长为660nm，样本取样量为10μL，加入150μL的第一试剂，37℃恒温5min，然后加入50μL的第二试剂，42秒后读取吸光度A1，37℃孵育4分18秒后读取吸光度A2，反应吸光度为ΔA＝A2-A1；
对上述的8个实施例进行性能验证，其结果如下：
；
检测限结果根据如上测定，可知试剂盒1至8均实现了良好的灵敏度。
测试例2
阻断剂对假阳性结果的影响按照试剂盒的制备方法配制对比试剂盒，差别仅在于不含阻断剂。用制备的各个试剂盒测试含有或者不含嗜异性抗体5mg/ml、小鼠IgG10mg/ml、RF 500IU/ml的样本。结果如下，显示阻断剂能够显著改善试验结果的假阳性，避免RF干扰。
；
结论：由以上对比实验，结果表明本发明的生物复合阻断剂效果良好，可有效控制样本中的嗜异性抗体、抗动物抗体、RF的干扰，使试剂盒更加安全有效。
测试例3
以试剂盒1为例，用市售的类风湿因子标准品配制含600IU/ml RF的CK-MB样本和不含600IU/ml RF的CK-MB样本和不含600IU/ml RF的CK-MB样本，作为测试样本，测定CK-MB含量，并计算回收率，计算公式：回收率= CMKB样本（含500IU/ml RF）测定值÷CMKB样本测定值（不含500IU/ml RF），结果如下表3所示。
；
表3显示了在试剂盒不包含阻断剂的情况下，含500IU/ml RF的CK-MB样本与不CKMB含500IU/ml RF的CK-MB样本检测到的CK-MB含量分别为140.36ng/ml和75.92ng/ml，回收率高达184.88％，说明RF对CK-MB的检测干扰严重。而在试剂盒包含兔IgG抗体或山羊IgG抗体的情况下，回收率分别为121.19%和117.92%，说明二者可以阻断RF对CKMB检测的干扰。而实验者在尝试了多种阻断剂复合的组合后，惊喜的发现兔IgG+山羊IgG的阻断剂组合二者存在协同作用，回收率可低至104.74%。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其他方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含缓冲液、促凝剂、生物阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂，R2试剂包含缓冲液、CK-MB抗体包被纳米微球、保护剂、防腐剂；
其中，R2试剂中的缓冲液为TAPS，R1中的生物阻断剂包括动物免疫蛋白小鼠IgG、小鼠IgM、兔IgG、山羊IgG、牛IgG、马IgG中的至少一种；R2试剂的CK-MB抗体包被纳米微球中的纳米微球，为平均直径在100-200nm之间的小直径微球和平均直径在200-400nm之间的大直径微球按1:20-20:1体积比混合的复合纳米微球，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间；其中所述生物阻断剂按v/v计0.1％至2％。
2.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中缓冲液选自HEPES缓冲液、TRIS-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中表面活性剂选自Tween20、Tween80、NP40、thesit的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中保护剂选自牛血清蛋白、卵清蛋白、脱脂乳、小牛血清的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中促凝剂为聚乙二醇，选自PEG6000、PEG8000、PEG12000、PEG20000的至少一种。
7.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中防腐剂为叠氮钠。
8.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中保护剂为牛血清蛋白、卵清蛋白、脱脂乳、小牛血清。
9.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中的生物阻断剂为兔IgG1%+山羊IgG1%。
10.根据权利要求1所述的一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒在改善检测中嗜异性抗体、抗动物抗体、类风湿因子、RF干扰的用途。
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