CN116589533A

CN116589533A - 南极磷虾小分子活性肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116589533A
Application number: CN202310729962.XA
Authority: CN
Inventors: 董平; 刘学; 张静; 于慧洋
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2023-06-19
Filing date: 2023-06-19
Publication date: 2023-08-15

Abstract

本发明公开了南极磷虾小分子活性肽及其制备方法和应用。本发明利用脱脂南极磷虾粉制备XOD抑制肽，所获得的多肽具有较高的XOD抑制率。通过LC‑MS/MS鉴定，从脱脂南极磷虾粉酶解液中筛选得到了5种具有XOD抑制活性的小分子多肽：LPPYSKE、EDVEGAVR、LDLPGWVK、LDDAFNHL和WDRPLVE。这5种多肽均具有不同程度的XOD抑制活性。本发明制备获得的南极磷虾肽具有良好的XOD抑制能力，可以应用于保健品、药品等深加工领域。本发明对水产品加工副产物进行高值化利用，能够有效提高资源利用率和工业化经济价值。

Description

南极磷虾小分子活性肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及南极磷虾小分子活性肽及其制备方法和应用。

背景技术

高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是由人体嘌呤代谢异常或尿酸***过少所致的一种代谢性疾病，主要表现为血清尿酸含量异常升高（男性血尿酸＞7 mg/dl，女性血尿酸＞6 mg/dl）。随着社会经济的发展，生活方式和饮食结构的改变，HUA 作为一种常见的疾病逐渐受到公众关注。相关数据表明，中国成年人高尿酸血症的合并患病率高达13.3%，并呈年轻化趋势。此外，HUA 在相关代谢疾病中也起着重要作用，血尿酸过高通常被视为慢性肾脏疾病、糖尿病、心血管疾病和炎症的预后指标。目前临床上使用的降尿酸药物如别嘌呤醇、非布司他、苯溴马隆等有明显的治疗效果，但其具有严重的过敏反应和肝肾损害等不良反应，且价格昂贵。因此，开发出安全、高效且经济的降尿酸药物已成为现阶段研究的重点和热点。

生物活性肽是指通过发酵、酶解、化学水解等方式获得的具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、镇痛、抗炎症等特殊生理作用的多肽。近年来，生物活性肽因具有易吸收、制备成本低、安全性高等特点，成为降尿酸研究领域的热点。

在人体的代谢过程中，黄嘌呤氧化酶（XOD，EC 1.17.3.2）是调控尿酸生成的关键酶。XOD主要存在于人体的肝脏和小肠中，可以连续氧化次黄嘌呤和黄嘌呤产生尿酸，同时还可将食物中摄取的嘌呤类物质转化为尿酸。此外，在XOD催化嘌呤代谢的过程中，还会生成超氧阴离子自由基和过氧化氢等活性氧分子参与机体的氧化应激，进一步损害身体健康。因此，通过抑制XOD活性来降低尿酸水平，是治疗高尿酸血症的重要方法。

南极磷虾（Antarctic krill）生物储藏量巨大，是地球上最大的动物性蛋白资源。脱脂南极磷虾粉是磷虾油生产过程中产生的一种经济副产品，含有优质蛋白质，蛋白含量高，但这些产品主要用作食品、饲料添加剂等，其资源利用率较低。如何有效利用脱脂南极磷虾粉中的优质蛋白质成为了一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供南极磷虾小分子活性肽及其制备方法，另一目的是提供了其应用。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种南极磷虾小分子活性肽，该活性肽的氨基酸序列为：LPPYSKE，或EDVEGAVR，或LDLPGWVK，或LDDAFNHL，或WDRPLVE。

其中，LPPYSKE具体为：Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Lys-Glu；

EDVEGAVR具体为：Glu-Asp-Val-Glu-Gly-Ala-Val-Arg；

LDLPGWVK具体为：Leu-Asp-Leu-Pro-Gly-Trp-Val-Lys；

LDDAFNHL具体为：Leu-Asp-Asp-Ala-Phe-Asn-His-Leu；

WDRPLVE具体为：Trp-Asp-Arg-Pro-Leu-Val-Glu。

所述南极磷虾小分子活性肽的制备方法包括以下步骤：

（1）酶解脱脂南极磷虾粉得到酶解液；

（2）高温灭酶；

（3）离心分离得到南极磷虾酶解上清液；

（4）将南极磷虾酶解上清液进行脱盐冻干得到南极磷虾酶解冻干粉，即南极磷虾小分子活性多肽混合物。

进一步的，所述制备方法还包括进一步纯化，选用亲和超滤方法：将南极磷虾酶解冻干粉溶解与XOD酶共同孵育，孵育结束后超滤离心得到截留液，进行洗脱，使XOD酶变性解除与小分子肽的结合，收集得到的透过液干燥即得纯化后的南极磷虾活性多肽混合物。

作为优选的，所述步骤（5）中的冻干粉酶解液浓度50-250mg/ml，XOD酶浓度0.1-0.5U/ml，酶解液与XOD酶的体积比为1：1-1：5，赋予时间20-60min。优选地，酶解液浓度为200 mg/mL，XOD酶浓度为0.2 U/mL，酶解液与XOD酶的体积比为1：2，孵育温度为37℃，孵育时间30 min。

进一步的，基于LC-MS/MS质谱鉴定南极磷虾小分子活性肽，再进行筛选，最终得到所述的5种南极磷虾小分子活性肽。

作为优选的，所述步骤（1）中将脱脂南极磷虾粉和水按一定的质量比（1:1-10）混匀，调到最适酶解pH值，加入酶启动酶解反应，反应过程中维持溶液的pH值恒定；所述蛋白酶选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶。

作为优选的，蛋白酶选用碱性蛋白酶，酶解pH 9.5，酶解温度55℃，蛋白酶酶活力2×10⁵ U/g；所用的碱性蛋白酶质量分数为1.6%；酶解时间为4.6 h。

作为优选的，所述步骤（2）中的灭酶温度为100℃，灭酶时间10-20 min，优选15min。

作为优选的，所述步骤（3）中的离心速度2000-5000r/min，离心时间20-60min，优选离心速度为4000 r/min，离心时间30 min。

作为优选的，所述步骤（4）中的脱盐方法为透析脱盐，选择200 Da的透析袋在纯水中脱盐48 h，冷冻温度为-80℃，干燥时间24 h。

所述南极磷虾小分子活性肽在抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）中的应用。

进一步的，所述南极磷虾小分子活性肽在制备降低高尿酸制品中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用脱脂南极磷虾粉制备XOD抑制肽，所获得的多肽具有较高的XOD抑制率。通过LC-MS/MS鉴定，从脱脂南极磷虾粉酶解液中筛选得到了5种具有XOD抑制活性的小分子多肽：LPPYSKE、EDVEGAVR、LDLPGWVK、LDDAFNHL和WDRPLVE。这5种多肽均具有不同程度的XOD抑制活性。

本发明制备获得的南极磷虾肽具有良好的XOD抑制能力，可以应用于保健品、药品等深加工领域。本发明对水产品加工副产物进行高值化利用，能够有效提高资源利用率和工业化经济价值。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1为实施例6中样品质谱Basepeak图。

图2为氨基酸序列为LPPYSKE的小分子活性多肽二级质谱图。

图3为氨基酸序列为EDVEGAVR的小分子活性多肽二级质谱图。

图4为氨基酸序列为LDLPGWVK的小分子活性多肽二级质谱图。

图5为氨基酸序列为LDDAFNHL的小分子活性多肽二级质谱图。

图6为氨基酸序列为WDRPLVE的小分子活性多肽二级质谱图。

图7为肽段LPPYSKE与XOD的分子对接结果图。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实例仅以解释本发明，并不仅限于此。

以下各实施例中，测定各样品对XOD抑制率的实验方法如下：

（1）溶液配制：

黄嘌呤氧化酶溶液（0.05 U/mL）：取77μL酶液用1×PBS缓冲液定容至10 mL；

黄嘌呤溶液（0.40 mmol /L）：称取6.08 mg黄嘌呤粉末，用400μL 1 mol/L NaOH溶解后，用缓冲液定容至100 mL。

（2）实验方法：

于96孔板中每孔加入50 μL待测样品（稀释至9 mg/mL）及50 μL浓度为0.05 U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，振荡30 s，25℃保温5 min，加入150 μL 0.40 mM的黄嘌呤溶液，振荡30 s后，25℃保温25 min，测定290 nm处的吸光值。

（3）计算公式：

黄嘌呤氧化酶抑制活性计算公式如下：

式中，A₁表示样品溶液加酶的吸光度；A₂表示样品溶液不加酶吸光度；A₃表示缓冲液代替样品溶液的空白组的吸光度；A₄表示空白组不加酶的吸光度。

实施例1：

一种具有XOD抑制活性的南极磷虾活性肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

（1）酶解：将脱脂南极磷虾粉和水按1：5的质量比混匀，经高速分散机分散均匀，预热至50℃，pH调至9，加入碱性蛋白酶启动酶解反应，水浴震荡，反应过程中维持溶液的pH值恒定；

（2）高温灭酶：100℃沸水浴灭酶15min；

（3）离心分离：4000 r/min离心30 min，过滤得到酶解液；

（4）脱盐冻干：将步骤（3）中得到的上清液脱盐冻干后得到南极磷虾酶解冻干粉。

实施例2

一种具有XOD抑制活性的南极磷虾肽制备方法，该制备方法包括以下步骤：

（1）酶解：将脱脂南极磷虾粉和水按1：5的质量比混匀，经高速分散机分散均匀，预热至50℃，pH调至7，加入中性蛋白酶启动酶解反应，水浴震荡，反应过程中维持溶液的pH值恒定；

（2）高温灭酶：100℃沸水浴灭酶15 min；

（3）离心分离：4000 r/min离心30 min，过滤得到酶解液；

实施例3

（1）酶解：将脱脂南极磷虾粉和水按1：5的质量比混匀，经高速分散机分散均匀，预热至55℃，pH调至6.5，加入木瓜蛋白酶启动酶解反应，水浴震荡，反应过程中维持溶液的pH值恒定；

（2）高温灭酶：100℃沸水浴灭酶15 min；

（3）离心分离：4000 r/min离心30 min，过滤得到酶解液；

实施例4

（1）酶解：将脱脂南极磷虾粉和水按1：5的质量比混匀，经高速分散机分散均匀，预热至50℃，pH调至7，加入风味蛋白酶启动酶解反应，水浴震荡，反应过程中维持溶液的pH值恒定；

（2）高温灭酶：100℃沸水浴灭酶15 min；

（3）离心分离：4000 r/min离心30 min，过滤得到酶解液；

实施例5

本发明采用UV法测定酶取液的XOD抑制活性。

分别取实施例1-4中得到的南极磷虾冻干肽粉进行XOD抑制率分析。四种产品冻干肽粉的XOD 抑制率如表1所示。测定结果表明，碱性蛋白酶酶解得到的产物，其XOD抑制活性显著高于其他三种条件下获得的酶解产物，使用碱性蛋白酶酶解脱脂南极磷虾粉更有利于制备XOD抑制肽。因此，本发明方法制备的XOD抑制肽实现了对水产品加工副产物的高效利用，可作为治疗和预防HUA的药物或保健食品原料，有效的提高了脱脂南极磷虾粉的利用效率，并且使用蛋白酶酶解的方法得到活性肽粉，价格低廉，经济环保，安全性高，应用前景良好。

表1 不同蛋白酶得到的南极磷虾肽XOD抑制率

对上述实施例1制备的南极磷虾酶解冻干粉再进行纯化：将南极磷虾酶解冻干粉溶解与XOD酶共同孵育，孵育结束后超滤离心得到截留液，利用70%（v/v）的甲醇溶液进行洗脱，使XOD酶变性解除与小分子肽的结合，收集得到的透过液干燥即得纯化后的南极磷虾小分子活性多肽混合物。冻干粉酶解液浓度为200 mg/mL，XOD酶浓度为0.2 U/mL，酶解液与XOD酶的体积比为1：2，孵育温度为37℃，孵育时间30 min。

实施例6

LC-MS/MS质谱鉴定南极磷虾XOD小分子抑制肽，包括以下步骤：

（1）溶液定量，取实施例1经过纯化后得到的样品，使用C18 StageTip 脱盐，真空干燥。干燥后肽段用 0.1% FA复溶，OD280测定肽段浓度，以备LC-MS分析。

（2）使用LC-MS/MS方法测定XO抑制肽序列。基于之前的方法进行检测。缓冲液A液为 0.1%甲酸（v/v）水溶液， B液为 0.1%甲酸、80%的乙腈（v/v）水溶液。色谱柱以100%的A液平衡。样品进样到C18毛细管捕获柱（100 μm*20 mm, 5 μm，Dr. Maisch GmbH）后经过C18分离柱（75 μm*150 mm，3 μm，Dr. Maisch GmbH）进行梯度分离，流速为 300 nl/min。液相分离梯度如下：

2−5% B相持续0−2 min，5−28% B相持续2−44 min，28−40% B相持续44−51 min，40−100% B相持续51−53 min，B相保持100%持续53−60 min。

肽段分离后用 Q-Exactive质谱仪进行DDA（数据依赖采集）质谱分析。分析时长为60 min，检测模式：正离子，母离子扫描范围： 350-1800 m/z；一级质谱分辨率：60000 @m/z200； AGC target：3e6；一级Maximum IT：50 ms，样品经过质谱分析得到的一级质谱图如图1所示。

肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱（ MS2 scan）。二级质谱分辨率：15000 @ m/z 200；AGCtarget: 1e5；二级 Maximum IT：50 ms；MS2 Activation Type：HCD；Isolation window：1.6m/z；Normalized collision energy：28。

（3）利用PEAKS Studio 10.6软件对Uniprot蛋白质数据库进行分析，最终得到鉴定的肽。

表2 PEAKS Studio分析参数设置

质谱数据检索后采用 PSM FDR≤0.01和 Protein FDR≤0.01分别为肽段、位点与蛋

白鉴定的筛选标准。最终样品鉴定得到943条肽段和13条蛋白序列。

实施例7

通过分子对接对肽段进行筛选，包括以下步骤：

（1）将实施例6得到的多肽在ChemDraw 21.0.0软件中进行3D建模，将其作为配体进行能量最小化。

（2）蛋白质数据库PDB（http：//www.rcsb.org/）中下载获取含有配体TEI的XOD（PDB ID:1N5X）。将得到的XOD晶体结构导入Discovery Studio 2019 Client（DS2019），并对其进行分子对接前的去水加氢原子等一些准备操作。

（3）以1N5X作为受体蛋白，以虚拟酶解的多肽为配体，以（X：96.574，Y：55.310，Z：39.332）为对接中心，以15 Å为对接半径进行分子对接。采用Dock Ligands中的半柔性对接LibDock进行分子对接，并且设置参数为刚性优化、快速筛选，其余设置为默认值进行分子对接。按打分将筛选出的多肽进行下一步操作。

结果：从实施例6中的943条肽段选择了82条肽段与XOD进行DS2019模拟对接，根据LibDock Score得分，筛选得到5条肽段进行合成；5条肽段的二级质谱图如图2-6所示，对接示意图如图7所示。

实施例8

将实施例7筛选得到的肽段进行固相合成及活性验证，包括以下步骤：

（1）肽段LPPYSKE、EDVEGAVR、LDLPGWVK、LDDAFNHL和WDRPLVE均由生工生物工程（上海）股份有限公司采用Fmoc固相合成方法合成。

（2）将多肽配成0.1-5mg/mL溶液，采用UV法测定合成多肽的体外XO抑制率。

表3 肽段信息与XOD抑制率

注：（1）由于分子对接结果具有随机性，表中显示的LibDock Score得分为5次对接结果最高值的平均值。

（2）多肽的毒性通过http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/计算。

如表3所示，5个肽段均具有较高的XOD抑制活性，其中，氨基酸序列为LPPYSKE的肽段表现出最高的XOD抑制活性。且制备得到的南极磷虾酶解冻干粉的IC₅₀值是3.11 mg/mL，即经本发明制备的5种小分子活性肽的XOD抑制活性与其相比，可高达10倍，5种小分子活性肽具有极为显著的XOD抑制活性。

以上所述实施例仅为本发明较佳的实施方式，并不构成对权利要求范围的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都在本发明的保护范围。

Claims

1.一种南极磷虾小分子活性肽，其特征在于，该活性肽的氨基酸序列为：LPPYSKE，或EDVEGAVR，或LDLPGWVK，或LDDAFNHL，或WDRPLVE；其中，LPPYSKE具体为：Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Lys-Glu；

EDVEGAVR具体为：Glu-Asp-Val-Glu-Gly-Ala-Val-Arg；

LDLPGWVK具体为：Leu-Asp-Leu-Pro-Gly-Trp-Val-Lys；

LDDAFNHL具体为：Leu-Asp-Asp-Ala-Phe-Asn-His-Leu；

WDRPLVE具体为：Trp-Asp-Arg-Pro-Leu-Val-Glu。

2.南极磷虾小分子活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）酶解脱脂南极磷虾粉得到酶解液；

（2）高温灭酶；

（3）离心分离得到南极磷虾酶解上清液；

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该制备方法还包括进一步纯化，选用亲和超滤方法：将南极磷虾酶解冻干粉溶解与XOD酶共同孵育，孵育结束后超滤离心得到截留液，进行洗脱，使XOD酶变性解除与小分子肽的结合，收集得到的透过液干燥即得纯化后的南极磷虾活性多肽混合物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述南极磷虾酶解冻干粉酶解液浓度50-250mg/ml，XOD酶浓度0.1-0.5U/ml，酶解液与XOD酶的体积比为1：1-1：5，赋予时间20-60min。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，基于LC-MS/MS质谱鉴定南极磷虾小分子活性肽，再进行筛选，最终得到5种南极磷虾小分子活性肽，其氨基酸序列为：LPPYSKE，或EDVEGAVR，或LDLPGWVK，或LDDAFNHL，或WDRPLVE。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中将脱脂南极磷虾粉和水进行混匀，调到最适酶解pH值和温度，加入酶启动酶解反应，反应过程中维持溶液的pH值恒定；所述蛋白酶选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或多种组合。

7.权利要求1所述的南极磷虾小分子活性肽在抑制黄嘌呤氧化酶中的应用。

8.权利要求1所述的南极磷虾小分子活性肽在制备降低高尿酸制品中的应用。