CN116574503A - 一种比率荧光传感器、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比率荧光传感器、其制备方法及应用，属于化学检测技术领域。本发明的比率荧光传感器由如下方法制备而成：将g‑C3N4纳米片溶液、Eu(NO3)3·6H2O溶液和柠檬酸钠溶液依次加入到Tris‑HCl缓冲液中，混合均匀，孵育；待孵育结束后，将孵育溶液进行冻干，获得g‑C3N4/CitNa/Eu纳米探针，即比率荧光传感器。本发明的比率荧光传感器能够实现样品中残留的四环素类抗生素的快速、直观和定量地测定，灵敏度高，可视化效果好，并可与智能手机联用，检测便携。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种比率荧光传感器、其制备方法及应用。
背景技术
四环素类抗生素在畜牧业中被广泛用作饲料添加剂。然而，过量使用抗生素会在动物产品(特别是奶、蛋、肉)和外部环境中产生高水平的药物残留，对食品安全、生态环境和人类健康构成严重威胁。食品中抗生素残留的增加已引起全球关注。欧盟(EU)和美国食品和药物管理局(FDA)规定牛奶中四环素(TC)的最大残留限量为100ng/mL(225nM)和300ng/mL(676nM)。因此，为确保食品安全，保护消费者健康，迫切需要开发一种高效、超灵敏、视觉化以及便携的四环素类抗生素残留检测方案。
目前，已有多种检测四环素类抗生素的方法，包括高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)、酶联免疫分析法(ELISA)、毛细管电泳(CE)、电化学分析、共振散射等。近年来，一些新兴的传感器器件在分析化学领域显示出巨大的潜力，包括电化学传感器、纳米酶传感器、荧光传感器等。其中，荧光传感器因其操作简单、成本低、灵敏度高、响应速度快、易于可视化分析而被认为是一种理想的四环素类抗生素检测手段。然而，传统的荧光传感器对分析物的响应通常基于单一的荧光信号发射，容易受到背景、仪器和环境的干扰。因此，提供一种能够在现场快速、直观、定量地测定四环素类抗生素的方案，具有重要意义。
发明内容
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种比率荧光传感器的制备方法，步骤如下：
将g-C3N4纳米片溶液、Eu(NO3)3·6H2O溶液和柠檬酸钠溶液依次加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，孵育；待孵育结束后，将孵育溶液进行冻干，所得粉末为g-C3N4/CitNa/Eu纳米探针，即比率荧光传感器。
上述制备方法中，g-C3N4纳米片溶液、Eu(NO3)3·6H2O溶液和柠檬酸钠溶液的体积比选自10:1:1；g-C3N4纳米片溶液的浓度选自0.3mg/mL，Eu(NO3)3·6H2O溶液的浓度选自100μM；柠檬酸钠溶液的浓度选自500μM；Tris-HCl缓冲液的浓度选自50mM，pH为8.0；孵育时间选自10min。
上述制备方法中，所述g-C3N4纳米片由如下方法制备而成：
将三聚氰胺置于550～600℃中煅烧2～3h，待煅烧结束后，冷却至室温后，获得黄色固体产物，充分研磨；然后，将黄色固体产物分散于水中，超声粉碎，离心，除去未剥离的聚集体；收集上清液，干燥，获得g-C3N4纳米片。
上述煅烧温度优选自550℃；煅烧时间优选自2h。
上述黄色固体产物与水的质量体积比选自1:180～1:250，g:mL；优选为1:200，g:mL。
本发明提供了由上述方法制备的比率荧光传感器。
本发明提供了上述比率荧光传感器在食品中四环素类抗生素残留检测中的应用。所述四环素类抗生素选自强力霉素、四环素、金四环素和土霉素；优选为四环素。
本发明提供了一种利用上述比率荧光传感器检测食品中四环素类抗生素残留的方法，步骤如下：
向待测样品中加入三氯乙酸溶液，超声反应；待反应结束后，离心，收集上清液，将上清液过滤，然后加入比率荧光传感器，充分混合，置于室温下完全反应；待反应结束后，将反应液置于275nm激发波长下，观察荧光颜色变化；若存在四环素类抗生素，则620nm处的荧光峰会被激发出来，荧光颜色变为红色。
上述检测方法中，比率荧光传感器与过滤液的体积比选自8:25。
上述检测方法中，所述待测样品选自牛奶、鸡蛋、鸡肉、牛肉等常见食品；优选为牛奶。
本发明提供了一种g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的制备方法，步骤如下：
将聚丙烯腈溶解在DMF中，获得聚丙烯腈溶液；然后将g-C3N4/CitNa/Eu粉末加入到聚丙烯腈溶液中，充分搅拌，获得g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺溶液；然后进行静电纺丝，获得g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜。
上述g-C3N4/CitNa/Eu粉末与聚丙烯腈溶液的质量体积比选自10:9～10:11，mg:mL；优选为10:9，mg:mL。
本发明提供了由上述方法制备的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜。
本发明提供了上述g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜在食品中四环素类抗生素残留检测中的应用。所述四环素类抗生素选自强力霉素、四环素、金四环素和土霉素；优选为四环素。
本发明提供了一种利用上述g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜检测食品中四环素类抗生素残留的方法，步骤如下：
将待测样品溶液滴加到g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上，或者，将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜浸入到待测样品溶液中，反应5min，然后将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜用365nm的紫外灯照射，观察荧光颜色变化；若存在四环素类抗生素，则电纺膜在紫外灯的照射下会变为红色。
本发明提供了一种利用智能手机对食品中四环素类抗生素残留进行定量检测的方法，步骤如下：
将待测样品溶液滴加到g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上，或者，将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜浸入到待测样品溶液中，反应5min，然后将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜用365nm的手持式紫外灯照射，利用智能手机对激发体系的荧光进行拍摄，然后使用加载在智能手机中的颜色识别器将照片颜色信号转换为颜色信息(RGB值)，计算绿色和蓝色通道的比率(G/B值)，将G/B值代入标准曲线，获得四环素类抗生素浓度。
上述颜色识别器选自ColorDesk应用程序。
上述标准曲线可选自如下方法构建：
将不同浓度的四环素类抗生素溶液滴加到g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上，或者，将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜浸入到不同浓度的四环素类抗生素溶液中，反应5min，然后将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜用365nm的手持式在外灯照射，利用智能手机对激发体系的荧光进行拍摄，然后使用加载在智能手机中的颜色识别器将照片颜色信号转换为颜色信息(RGB值)，计算绿色和蓝色通道的比率(G/B值)，以四环素类抗生素浓度为横坐标，以G/B值为纵坐标，构建浓度-G/B值标准曲线。
上述四环素类化合物溶液的浓度梯度可选自0μM、0.5μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
本发明的有益效果为：
本发明设计的双信号比率荧光传感器(g-C3N4/CitNa/Eu)可用于四环素类抗生素的现场可视化检测。具备蓝色发光能力的g-C3N4既可以作为Eu3+配位的骨架，也可以作为四环素类抗生素的识别单元。配位的不饱和红色荧光Eu3+(λem＝620nm)结合在g-C3N4表面，由于天线效应(AE)而成为特定的四环素类抗生素识别元素。在四环素类抗生素存在下，比率荧光传感器表现出双响应和反向响应信号，并伴有明显的多色宽度颜色变化(蓝-紫-粉-红)，实现了超高灵敏度检测，检出限为1.961nM。此外，通过在静电纺丝技术将比率荧光传感器加载在纳米纤维薄膜上，可制备获得便携式柔性传感器。柔性传感器与智能手机的成功结合大大降低了检测成本和时间，为现场四环素类抗生素的定性识别和定量检测提供了一种很有前景的方法。
附图说明
图1为块体g-C3N4和g-C3N4纳米片的发射光谱；
图2为g-C3N4纳米片的表征；其中，A图为荧光光谱，插图为g-C3N4纳米片溶液在紫外线和日光下的照片；B图为TEM图像；C图为AFM图像；D图为g-C3N4纳米片的AFM图像高度轮廓；E图为块体g-C3N4和g-C3N4纳米片体的XRD谱图；F图为块体g-C3N4和g-C3N4纳米片体的FT-IR谱图；G图为拟合了g-C3N4纳米片的C1s的高分辨率XPS谱；H图为拟合了g-C3N4纳米片的N1s的高分辨率XPS谱；I图为g-C3N4、Eu3+、g-C3N4/CitNa/Eu、TC、CitNa和g-C3N4/CitNa/Eu/TC的Zeta电位；
图3为g-C3N4纳米片在不同条件下的荧光稳定性；其中，A图为储存时间应力；B图为紫外照射时间；C图为溶液pH；D图为NaCl浓度；
图4为g-C3N4纳米片的XPS谱图；其中，A图为XPS全谱，插图是g-C3N4纳米片中C、N、O原子的相对含量；B图为拟合的g-C3N4纳米片高分辨O1s谱；
图5为TC检测可行性研究；其中，A图为g-C3N4纳米片的荧光激发光谱(a)、发射光谱(b)以及TC的紫外-可见吸收光谱(c)；B图为g-C3N4的CIE色度坐标(a)和Eu/CitNa/TC的CIE色度坐标(b)；C图为g-C3N4和Eu/CitNa/TC的发射光谱(λex＝275nm)，插图显示在365nm紫外灯照射下g-C3N4纳米片溶液(左)和Eu/Cit/TC溶液(右)的照片；D图为所示各种体系的荧光光谱。
图6为加入不同浓度的Eu3+后g-C3N4的荧光光谱(A图)和荧光强度变化(B图)；
图7为TC检测的机理；其中，A图为所示各种体系的吸收光谱；B图为所示各种材料的荧光寿命；C图为观察(Eobsd，a)和校正(Ecor，b)加入不同浓度TC后的荧光猝灭效率；D图为g-C3N4/CitNa/Eu的发射水平示意图以及TC向Eu3+的能量转移；E图为基于g-C3N4/CitNa/Eu的比率荧光法检测TC的原理；
图8为CitNa用量的优化；其中，A图为荧光强度；B图为荧光强度比，插图展示了相应溶液在365nm紫外灯照射下的照片；
图9为比率荧光检测TC传感***pH值的优化；
图10为孵育时间优化；其中，A图为荧光强度；B图为荧光强度比；
图11为比率荧光法检测TC；其中，A图为不同TC用量下g-C3N4/CitNa/Eu溶液的荧光光谱；B图为不同TC用量下g-C3N4/CitNa/Eu溶液的对应的强度变化；C图为荧光强度比(F620/F450)与TC浓度的线性关系；D图为不同TC用量下g-C3N4/CitNa/Eu溶液在紫外灯下的荧光变色照片(λ＝365nm)；E图为不同TC浓度下CIE色度图；F图为不同浓度TC存在时CIE的色度；
图12为TC的单信号测定；其中，A图为加入不同浓度TC后g-C3N4基荧光传感***的荧光光谱；B图为TC浓度与(F0-F)/F0呈线性关系，F0和F分别表示加入TC前后传感***的荧光强度；C图为不同浓度TC在紫外灯照射下(λ＝365nm)下g-C3N4溶液的荧光变色照片；
图13为TC特异性试验；其中，A图为g-C3N4/CitNa/Eu传感器对TC和干扰物的荧光响应；B图为g-C3N4/CitNa/Eu传感器对TC和干扰物的荧光响应；C图为紫外下相关照片，TC和干扰物的浓度均为50μM；D图为紫外下相关照片，TC和干扰物的浓度均为50μM；E图为基于g-C3N4/CitNa/Eu传感器在TC上的抗干扰实验，TC浓度为50μM，干扰物浓度为150μM；F图为基于g-C3N4/CitNa/Eu传感器在TC上的抗干扰实验，TC浓度为50μM，干扰物浓度为150μM；
图14为45μM浓度下的TC、DOX、OXY和CTE的紫外-可见吸收光谱；其中，在325nm处，各曲线从上到下依次代表TC、OXY、DOX、CTE；
图15为四环素类药物的化学结构；其中，左上为四环素(TC)、右上为强力霉素(DOX)、左下为土霉素(OXY)和右下为金四环素(CTE)，四种化合物具有相似的化学结构；
图16为g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜及智能应用；其中，A图为静电纺丝法制备纳米纤维示意图；B图为g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的扫描电镜图像；C图为g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的照片；D图为日光下的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜照片；E图为紫外光下的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜照片；F图为加入15μL不同浓度TC溶液(从左至右分别为0μM、0.5μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM)后的电纺膜照片；G图为加入15μL 200μM不同抗生素溶液后的电纺膜照片，从左至右依次为AmL、ROX、MNZ、LUT、THI、STR、KM、CTR、AMP、SM2、DOX、CTE、OXY和TC；H图为基于g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜和智能手机传感器的TC检测简化流程图；I图为所设计的基于g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的视觉传感器在手持式紫外灯照射下不同浓度TC溶液的荧光彩色图像。
具体实施方式
本发明所采用的试剂、化学品以及仪器，如下所示：
(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、三聚氰胺、Eu(NO3)3·6H2O、柠檬酸钠(CitNa，98％)、聚丙烯腈(PAN，Mw＝150000)、四环素(TC)、金霉素(CTE)、土霉素(OXY)、强力霉素(DOX)、罗红霉素(ROX)、硫酸卡那霉素(KM)、甲砜霉素(THI)、阿莫西林(AmL)、木犀草素(LUT)、甲硝唑(MNZ)、乳糖(Lac)、赖氨酸(Lys)、抗坏血酸(Vc)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、D-酒石酸(D-Ta)、三氯乙酸溶液(10％)等其他离子购自麦克林生化科技有限公司。氨苄青霉素(AMP)、硫酸链霉素(STR)、头孢曲松钠(CTR)购自索莱宝科技有限公司。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、半胱氨酸(Cys)、没食子酸(GAE)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、蔗糖(Suc)、无水葡萄糖(Gl)购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均按原样使用，无需进一步纯化。TD-3700(中国)X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM，JOEL JEM 2001)、原子力显微镜(AFM)SPM-9700HT仪器(中国)、X射线光电光谱(XPS)ESCA-3Mark II spectrometer(VGScientific Ltd.,England)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱Nicolet islo FTIR分光镜上(美国)、SpectraMax i3x多功能酶标仪(美国)、F2700荧光分光光度计(日立，日本)、F4600光谱仪(日本，日立)、XO-1000D超声波细胞粉碎机、蔡司扫描电子显微镜(SEM，日本)、YFSP-T(中国天津云帆)静电纺丝设备。
本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
g-C3N4纳米片的制备：
将3g三聚氰胺放入氧化铝坩埚中，然后置于马弗炉中，以10℃/min的速率升温至550℃，煅烧2h，冷却至室温后，将所获得的黄色固体产物充分研磨。然后，将2.25g黄色固体产物分散于450mL超纯水中，然后用超声波细胞粉碎机在1000w的功率下粉碎48h。然后在3000rpm下离心10min，除去未剥离的聚集体。收集含有g-C3N4纳米片的上清液，干燥，并在4℃中保存备用。
1、g-C3N4纳米片的表征
本发明采用煅烧聚合和超声剥离法制备g-C3N4纳米片，由图1可知，超声剥离增强了g-C3N4纳米片的发射强度。此外，由于量子约束效应的作用，其发射峰的位置比块体g-C3N4略有蓝移，蓝移了约12nm。g-C3N4纳米片的PL激发和发射光谱，如图2A所示，在不同的激发波长下，PL发射位置没有明显的变化；g-C3N4纳米片的最佳发射和激发波长分别为450nm和275nm；此外，所得的g-C3N4纳米片在溶液中表现出良好的分散性，在UV下发出明亮的蓝色荧光。g-C3N4纳米片的荧光稳定性，如图3所示，荧光强度保持相对一致，这说明g-C3N4纳米片溶液具有优异的荧光稳定性；此外，所制备的g-C3N4纳米片溶液的量子产率为5.23％。g-C3N4纳米片的TEM图像，如图2B所示，显示出典型的规则片状结构。g-C3N4纳米片的AFM图像，如图2C和图2D所示，AFM图像进一步验证了g-C3N4纳米片为厚度均匀约为3nm的片状结构。图2E显示了一个明显的特征XRD峰，对应g-C3N4的典型石墨层间沉积(002)峰。与块体g-C3N4相比，超声处理后g-C3N4纳米片的XRD峰由27.3°变为27.5°，表明块体g-C3N4分离成功。本发明利用红外光谱进一步表征了g-C3N4纳米片的官能团，如图2F所示，块状g-C3N4和g-C3N4纳米片显示出相似的吸收峰，证实超声剥离不会改变g-C3N4纳米片的结构。XPS分析进一步证实了g-C3N4纳米片的元素组成，如图4A所示，合成的g-C3N4纳米片由三种主要化学元素(C、N和O)组成。图2G和图2H分别为拟合的高分辨率C1s和N1s，C1s谱分别在284.6eV(石墨碳)、286.2eV(C-OH)和288.0eV(N-C＝N)处出现三个峰。N1s波段分别为四元氮(401.1eV)、三级氮(399.8eV)和C＝N-C(398.44eV)。反卷积的O1s波段表明存在C-OH(532.2eV)，如图4B所示。综上所述，超声剥离减小了g-C3N4块体的尺寸，提高了其发射强度。
2、TC检测可行性研究
首先，本发明测定了TC的吸收光谱和g-C3N4纳米片的激发光谱，如图5A所示，两者具有较大的光谱重叠，这使得g-C3N4的荧光能通过IFE被TC大大地猝灭，因为IFE的效率依赖于猝灭剂的吸收和荧光团的激发或发射的光谱重叠程度。
其次，本发明探究了柠檬酸钠对Eu3+荧光的影响。具体试验过程如下：(1)Eu的浓度：200μL 0.3mg/mL的g-C3N4溶液和20μL不同浓度的Eu3+和780μL 50mMpH＝8的Tric-HCl溶液混合，在275nm激发下，记录荧光光谱。(2)CitNa浓度：200μL 0.3mg/mL的g-C3N4溶液和20μL100μM的Eu3+和20μL不同浓度的CitNa和510μL 50mMpH＝8的Tric-HCl和250μL50μM的TC溶液混合，在275nm激发下，记录荧光光谱。试验结果如图6所示，TC可在CitNa的辅助下有效增强Eu3+的荧光，因为TC和CitNa可与Eu3+螯合并将能量转移至Eu3+，从而使Eu3+发光敏化。与镧系元素离子(Eu3+)螯合的配体(TC)充当“天线”，吸收光子并将能量转移至镧系元素离子(Eu3+)，从而使其发光敏化，这一过程被称为天线效应。因此，g-C3N4纳米片和Eu3+都可以作为TC识别单元，实现双重和反向响应信号(g-C3N4荧光减弱，Eu3+荧光增强)，这为比率荧光传感提供了前提条件。
然后，从国际照明委员会(CIE)色度图可以看出，g-C3N4纳米片(0.15592，0.12369)和Eu3+(0.65324，0.33518)之间的荧光存在较大的色差(图5B)。这种从蓝色到红色的显著颜色演变的现象，为TC的目视分析提供了很大的优势。
最后，g-C3N4纳米片和Eu3+的其他光学性质也有利于开发有效的比率式荧光传感器。例如，Eu/CitNa/TC(将20μL100μM的Eu和20μL 500μM CitNa和710μL 50mMpH＝8的Tric-HCl和250μL50μM的TC溶液混合，在275nm激发下，记录荧光光谱)的最佳激发波长为275nm，g-C3N4和Eu3+在275nm处具有相似的激发波长，因此g-C3N4和Eu3+的荧光均可在275nm下激发且显示出分辨良好的双发射带，以实现TC的有效比率荧光检测。
此外，如图5C所示，g-C3N4在450nm处显示荧光最大值，并在UV灯下显示明亮的蓝色荧光(左图)，而Eu/CitNa/TC的最大发射波长为620nm，为红色荧光(右图)。g-C3N4在450nm处的发射峰与Eu3+在620nm处的发射光谱相比，由于5D0→7F2跃迁，显示出较大的发射光谱偏移(约170nm)，大的峰位移不仅容易实现宽且灵敏的颜色变化，而且可以有效避免不同发射峰的光谱重叠。综上所述，g-C3N4纳米片和Eu3+的性质能够满足开发用于TC的视觉测定的有效比率荧光法的要求。
为了验证g-C3N4、CitNa和Eu3+在TC测定中的可行性，本发明进行了相关实验，具体如下：a：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+510μL pH＝8的Tric-HCl+290μL超纯水混合。b：200μL0.3mg/mL g-C3N4溶液+20μL 100μM Eu3++510μL pH＝8的Tric-HCl+270μL超纯水混合。c：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+20μL 500μM CitNa+510μL pH＝8的Tric-HCl+270μL超纯水混合。d：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+20μL 500μM CitNa+20μL 100μM Eu3++510μL pH＝8的Tric-HCl+250μL超纯水混合。e：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+250μL 50μM TC+510μL pH＝8的Tric-HCl+40μL超纯水混合。f：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+20μL 100μM Eu3++250μL50μM TC+510μL pH＝8的Tric-HCl+20μL超纯水混合。g：200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液+20μL500μM CitNa+20μL 100μM Eu3++250μL 50μM TC+510μL pH＝8的Tric-HCl混合。在275nm激发下，记录荧光光谱。
试验结果如图5D所示：
Eu3+和CitNa对g-C3N4的荧光几乎没有影响(a～d曲线)。在g-C3N4/Eu3+溶液中加入TC后，g-C3N4在450nm处的荧光显著降低，而Eu3+在620nm处的荧光略微增加(曲线f)。这是因为TC与Eu3+的螯合作用敏化了Eu3+的发光，并且TC通过IFE诱导了g-C3N4的荧光猝灭。然而，由于不同步的荧光强度变化，溶液显示不明显的颜色变化(图5D插图)。为了实现有效的比率荧光传感和更明显的视觉分析，将CitNa作为辅助配体引入g-C3N4/Eu3+溶液中。Eu3+在620nm处的荧光显著增加(g曲线)并且溶液呈现出从蓝色到红色的明显颜色变化(图5D的插图)，这可能是由于CitNa取代螯合水分子并与Eu3+/TC螯合以抑制螯合水分子产生的猝灭效应。这些结果表明上述设计是可行的，在g-C3N4/Eu3+检测体系中引入辅助配体可以提高体系的检测限，同时使颜色变化更明显。
基于以上原因，本发明选择g-C3N4纳米片、CitNa和Eu3+来开发用于TC检测的比率荧光传感器。
3、TC检测的机理揭示
TC的引入增强了Eu3+的红色荧光，同时猝灭了g-C3N4的蓝色荧光。
首先，本发明对Eu3+的荧光增强机理进行了证实，如图7A所示，加入Eu3+后TC的吸收峰发生明显红移，且与TC的吸光度相比明显增加，说明Eu3+与含有β-二酮构型的TC发生了特异性螯合作用。在Eu3+/TC溶液中加入辅助配体CitNa后，吸光度进一步增加，表明CitNa与Eu3+/TC形成了络合物。结果表明，TC和CitNa与Eu3+的络合作用和能量转移使Eu3+的发光增敏，从而增强了Eu3+的红色荧光。
其次，本发明阐明了g-C3N4的荧光猝灭机理，并测量了相关的荧光寿命。通常，在荧光共振能量转移(FRET)过程中，由于能量从荧光体转移到猝灭剂上，荧光体的荧光寿命会下降，而对于IFE来说，荧光寿命是不变的。如图7B和表1所示，g-C3N4的荧光寿命在加入不同浓度的TC后保持相对稳定，表明g-C3N4的TC诱导的荧光猝灭主要由IFE而不是FRET引起。
表1不同条件下g-C3N4的荧光寿命(λem＝450nm)
| 样品 | τ(ns) |
| g-C3N4 | 6.25 |
| g-C3N4+Eu3+ | 6.21 |
| g-C3N4+Eu3++CitNa | 6.43 |
| g-C3N4+Eu3++CitNa+10μM TC | 6.01 |
| g-C3N4+Eu3++CitNa+50μM TC | 5.75 |
为了进一步评估IFE在荧光猝灭中的作用，使用公式进行了相关校正。图7C显示在IFE的作用下校正前后TC对g-C3N4的荧光猝灭效率为42.8％，这意味着存在其他猝灭机制。
图7D描绘了能量转移示意图，能量从价带激发到还原带，PET可以从g-C3N4到TC发生，这导致荧光猝灭。配体的三重态能级高于稀土离子的振动能级。这种能量差有利于能量从配体转移到Eu3+。因此，在620nm处的明亮红色发射可以解释为能量从TC转移到Eu3+中心，导致Eu3+-TC之间的D-F跃迁。紫外吸收峰的位移表明TC与探针分子之间存在配位关系。上述结果表明，Eu3+的荧光增强是由于TC和CitNa与Eu3+的络合作用和能量转移使其发光增敏所致。因此，在本发明中，PET是另一种猝灭机制。由此可见，在传感***中加入TC后，g-C3N4的荧光猝灭与IFE和PET均有关，Eu3+的荧光增强与AE有关。从图7E比率荧光法检测TC的原理图中可更直观地了解本实验所蕴含的机理。
4、TC检测试验条件优化
为了实现g-C3N4/CitNa/Eu对TC的最佳传感性能，对相关的变量进行了优化，包括Eu3+和CitNa的浓度、体系pH值、反应时间。
首先，由于Eu3+的浓度与方法的线性范围有关，因此对Eu3+的浓度进行了优化。如图6所示，Eu3+浓度对g-C3N4纳米片影响不大，当Eu3+浓度从0μM增加到500μM，g-C3N4的荧光变化可以忽略不计。考虑到线性范围和成本，在后续传感***中使用100μM Eu3+。
其次，如上所述，辅助配体CitNa在敏化Eu3+发光中起关键作用。为了实现有效的比率荧光传感，本发明优化了CitNa的量。如图8A所示，随着CitNa浓度的增加，传感***在620nm处的荧光逐渐增加。当CitNa浓度达到500μM时，荧光强度比(F620/F450)趋于恒定(图8B)。因此，500μM CitNa用于后续实验。随后，使用5.0至9.0的Tris-HCl缓冲液优化传感***的pH值。荧光强度比值(F620/F450)在pH＝8.0时有最强且稳定的荧光，因此选择pH 8.0作为后续实验的最佳pH值(图9)。
最后，研究了比率荧光探针的响应时间和稳定性。图10A显示了加入TC后传感***的荧光随时间的变化，揭示了10min后即可快速达到荧光响应并达到平衡，且达到平衡后传感***的荧光强度比(F620/F450)基本保持不变，稳定性较好(图10B)。这些结果表明，该荧光传感***能够快速、稳定地检测TC，其最佳试验条件为：Eu3+浓度为100μM；CitNa浓度为500μM；pH为8.0；孵育时间为10min。
实施例2
比率荧光传感器的制备：
将200μL 0.3mg/mL g-C3N4溶液、20μL 100μM Eu(NO3)3·6H2O溶液和20μL 500μM柠檬酸钠溶液依次加入到260μL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)中，混合均匀，孵育10min；待孵育结束后，将孵育溶液进行冻干，获得g-C3N4/CitNa/Eu纳米探针，即比率荧光传感器。
一、比率荧光法检测TC
将200μL g-C3N4溶液、20μL 100μM Eu(NO3)3·6H2O溶液和20μL 500μM柠檬酸钠溶液依次加入260μL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)中，混合均匀，孵育10min。然后，在上述孵育溶液中加入不同浓度的TC溶液(0μM、0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM)。将混合物用超纯水稀释至1.0mL。然后将混合物充分混合，室温孵育10min，加入黑色96孔微孔板中。得到激发波长为275nm的荧光光谱。
如图11A和图11B所示，随着TC浓度从0μM增加至100μM，传感***在450nm处的荧光逐渐减弱，而在620nm处的荧光逐渐增加。图11C显示了TC浓度与荧光强度比()的关系，在0～100μM范围内有良好的线性关系(R2＝0.9937)，线性方程可为：F620/F450＝0.08632x+0.01106。根据3σ/斜率(σ为空白样品的标准差(n＝9))的规则，计算出检测限(LOD)低至1.961nM，低于欧盟规定的TC在牛奶中的最大残留限量(225nM)。
此外，该方法的检测性能(如检测时间、线性范围和LOD)也与近年来报道的大多数方法相当。更重要的是，基于g-C3N4/CitNa/Eu的比率荧光方法随着TC浓度的增加呈现出从蓝色到红色的显著颜色变化，在365nm UV灯照射下肉眼可以清楚地识别和区分，如图11D所示。CIE色度坐标用于进一步验证相关的颜色变化，如图11E所示，TC浓度从0μM增加至100μM时，CIE坐标从蓝坐标(0.1553，0.1244)连续移动到红坐标(0.5262，0.2811)。TC传感***的显色性为研制便携式TC视觉传感器提供了前提条件。
作为比较，本发明还使用g-C3N4作为荧光探针用于TC的单信号测定。如图12A所示，g-C3N4在450nm处的荧光强度与TC浓度在0～100μM范围内存在良好的线性关系(R2＝0.9951)，检测限为24nM，其线性方程为：(F0-F)/F＝0.03925x+0.01631(图12B)。与单一荧光信号响应相比，基于g-C3N4/CitNa/Eu的比率荧光法具有更宽的线性范围和更高的灵敏度，这得益于比率荧光传感器的自校正和无背景的特性。更重要的是，基于g-C3N4/CitNa/Eu的比率荧光方法对不同浓度的TC表现出显著的颜色演变，而基于g-C3N4的单信号传感只能显示出向TC的亮度变化(图12C)。通过荧光颜色变化难以区分TC浓度(图11F)。上述结果表明，基于g-C3N4/CitNa/Eu的比率荧光法在TC的可视化检测中具有巨大的实际应用潜力。
二、TC特异性试验
为评价上述g-C3N4/CitNa/Eu传感器对TC的选择性，在相同的实验条件下，在传感体系中加入不同的潜在干扰物质，包括其他常见的抗生素(AmL、ROX、MNZ、LUT、THI、STR、KM、CTR、AMP、SM2、L-PA、CTE、DOX和OXY)，分子(Gl、Suc、Lac、Cys、Asp、Vc、Lys、Glu、Trp、D-Ta、GAE)和一些常见的阳离子和阴离子(K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cl-、SO4 2-、NO3 2-、PO4 3-)。
试验过程如下：
将200μL g-C3N4溶液、20μL 100μM Eu(NO3)3·6H2O溶液和20μL 500μM柠檬酸钠溶液依次加入260μL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)中，混合均匀，孵育10min。然后，在上述孵育溶液中加入150μM的各种干扰物质。将混合物用超纯水稀释至1.0mL。然后将混合物充分混合，室温孵育10min，加入黑色96孔微孔板中。得到激发波长为275nm的荧光光谱。
试验结果如图13所示：
如图13A和图13B所示，除CTE、DOX和OXY外，其它潜在干扰物质的的荧光响应(F620/F450)没有显著变化。这是因为TC、OXY、DOX和CTE都是四环素类抗生素。它们具有相似的吸收光谱和化学结构(图14和图15)。如图13C和图13D所示，与其他潜在干扰物质相比，只有TC可以触发传感***颜色从蓝色完全变为红色的显著荧光变化。这种明显的荧光颜色变化可以在便携式紫外灯(365nm)的帮助下通过肉眼观察到，这提供了一种有希望的现场定性鉴别TC的方法。这些结果表明，本发明所制备的传感器对四环素类抗生素检测具有良好的选择性。
此外，本发明使用其他干扰物与TC共存进行了抗干扰试验，观察到响应比F620/F450没有明显变化(图13E和图13F)，这证明传感性能不会受到其他物质的干扰。因此，本发明的传感器可用于超灵敏和高选择性检测TC，在各个领域都具有潜在的应用。
三、实用性试验
为验证该方法在实际样品中的的可行性和实用性，将g-C3N4/CitNa/Eu比率荧光传感器用于动物源性食品(牛奶)中TC的检测。牛奶是从当地超市买的。采用标准添加法对牛奶中的TC进行测定。在5mL纯牛奶中加入5mL 1％(v/v)三氯乙酸溶液，将样品超声30min后置于4℃冰箱中充分反应1h，以实现蛋白质和脂质等有机物的分离。然后，在12000rpm下离心10min以除去沉淀。收集上清液，通过0.22μm的滤膜进一步过滤。随后将所得溶液稀释5倍进行实际样品检测，可有效避免纯牛奶的内源荧光对探针的干扰。最后，对TC加标的牛奶样品进行检测，检测方法为：将240μL g-C3N4/CitNa/Eu比率荧光传感器加入到上述750μL牛奶样品中，充分混合，室温孵育10min，然后加入到黑色96孔微孔板中，每个孔中加200μL的待测液体，在275nm的激发下，用酶标仪测试荧光光谱。
试验结果如表2所示：
牛奶样品的回收率范围为95.75～102.95％，相对标准偏差(RSD)为0.33～3.67％，显示出良好的准确性和可靠性。结果表明，本发明的比率荧光传感器适用于动物源性食品样品中TC的实际检测。
表2牛奶样品中TC检测(n＝3)
四、g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜
近年来，柔性智能传感器因其制造工艺简单、可塑性突出、传感性能优异而引起了人们的广泛关注。电纺薄膜具有大的比表面积，良好的柔韧性，高孔隙率和优异的机械性能被认为是制备柔性智能传感器的最简单和优越的方法之一。
本发明使用静电纺丝设备(如图16A)通过原位生长将g-C3N4/CitNa/Eu纳米探针固定在聚丙烯腈表面来制备荧光电纺膜(图16C)，可看出电纺膜具有大的表面积和良好的柔韧性，能够根据需要来调节柔性传感器的形状。当使用聚丙烯腈(PAN)作为基质时，所获得的电纺膜在水中变得非常柔韧，且具有超强的亲水性，水滴在1.5s内即可穿过，有利于电纺膜与TC在水溶液中形成紧密接触，使TC在电纺膜表面均匀分布并向内部渗透，从而提高传感性能。图16B描绘了所制备的电纺膜的SEM图像，其由无序排列的纳米纤维组成，有无数不同大小的孔，它们提供了大的比表面积和丰富的传感位点，这表明PAN比10wt％(PAN比指的是PAN和DMF溶液的量的比值，PAN取1g，DMF取9mL，是最合适的比例)是合适的，并且具有良好的电可纺性。上述结果表明，可以将本发明所制备的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜作为固态柔性传感器，用以实现TC的高效检测。
上述g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的制备，步骤如下：
将聚丙烯腈(PAN)(Mw＝150000)溶解在DMF中，使其浓度为10wt％，并在90℃下剧烈搅拌2h，获得聚丙烯腈溶液。将10mg g-C3N4/CitNa/Eu粉末加入9mL聚丙烯腈溶液中，充分搅拌，得到均匀的呈淡黄色的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺溶液。采用YFSP-T静电纺丝设备，使用注射泵将电纺溶液以0.002mm/s的速率进针，进行静电纺丝，获得g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜。
为了评价电纺膜在检测中的效用，将电纺膜裁剪成直径为1cm的圆片，然后滴加15μL不同TC浓度的溶液(浓度分别为0μM、0.5μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM)。如图16D和图16E所示，g-C3N4/CitNa/Eu比率荧光探针成功固定在电纺膜上，电纺膜在365nm紫外灯照射下显示出明亮的蓝色荧光。随着TC浓度的增加，肉眼可以清楚的观察到荧光颜色的明显变化，从蓝色到***再到红色，如图16F所示。即使在50nM的TC浓度下，也可以清楚地观察到发射蓝紫色的荧光。然后，通过向电纺膜中加入15μL 200μM TC和其他抗生素来评估电纺膜的选择性。从图16G中可以看出，只有四环素类抗生素(如DOX、CTE、OXY和TC)会触发从蓝色到红色的显著颜色变化，而其他抗生素(AmL、ROX、MNZ、LUT、THI、STR、KM、CTR、AMP、SM2)的影响可以忽略不计。这些结果表明，本发明的g-C3N4/CitNa/Eu电纺膜可用于TC的视觉快速定量检测。TC检测用荧光电纺膜的实现，拓展了人体健康监测柔性智能穿戴设备等领域的应用。
五、智能手机定量检测TC
尽管基于g-C3N4/CitNa/Eu比率传感器可以实现TC的比率荧光传感和视觉分析，但比率荧光分析需要昂贵且笨重的仪器，不适合于现场分析。此外，用肉眼评估观察到的颜色变化难以量化TC浓度。为了解决这些问题，我们使用便携式智能手机作为信号读取器和分析仪，将颜色信息转换为RGB值进行半定量分析，从而提高了结果的准确性和可靠性，实现了平台的可移植性。
图16H展示了基于g-C3N4/CitNa/Eu比率传感器和智能手机检测TC的传感过程。首先，在裁剪好的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上滴加15μL不同浓度的TC，5min后，在365nm紫外线灯的照明下，使用智能手机拍摄电纺膜的照片。随着TC浓度的增加，电纺膜的颜色显示出由蓝色到浅紫色到浅玫红色到粉红色到红色的连续演变。其次，在捕获一系列荧光图像后，使用加载在智能手机中的颜色识别器应用程序(ColorDesk)分析发射颜色信息(RGB值)，并且可以通过计算红色通道(R)和蓝色通道(B)的比率来评估TC浓度。最后，如图16i所示，R/B值与TC浓度之间存在两阶段线性关系。在0～2.5μM范围内的线性方程为：R/B＝0.29003x+0.14365，R2＝0.973，LOD值计算为7.42nM(LOD＝3σ/S，σ是5个空白样本的标准偏差，S是校准曲线的斜率)。在2.5～200μM范围内的相关线性方程为：R/B＝0.01095x+0.879，R2＝0.983。上述结果表明，这种便携式智能手机辅助平台在视觉和现场定量检测TC中具有很大的应用潜力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将g-C3N4纳米片溶液、Eu(NO3)3·6H2O溶液和柠檬酸钠溶液依次加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，孵育；待孵育结束后，将孵育溶液进行冻干，所得粉末为g-C3N4/CitNa/Eu纳米探针，即比率荧光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，g-C3N4纳米片溶液、Eu(NO3)3·6H2O溶液和柠檬酸钠溶液的体积比选自10:1:1；g-C3N4纳米片溶液的浓度选自0.3mg/mL，Eu(NO3)3·6H2O溶液的浓度选自100μM；柠檬酸钠溶液的浓度选自500μM；Tris-HCl缓冲液的浓度选自50mM，pH为8.0；孵育时间选自10min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述g-C3N4纳米片由如下方法制备而成：
将三聚氰胺置于550～600℃中煅烧2～3h，待煅烧结束后，冷却至室温后，获得黄色固体产物，充分研磨；然后，将黄色固体产物分散于水中，超声粉碎，离心，除去未剥离的聚集体；收集上清液，干燥，获得g-C3N4纳米片。
4.权利要求1～3任一项所述方法制备的比率荧光传感器。
5.一种利用权利要求4所述比率荧光传感器检测食品中四环素类抗生素残留的方法，其特征在于，步骤如下：
向待测样品中加入三氯乙酸溶液，超声反应；待反应结束后，离心，收集上清液，将上清液过滤，然后加入比率荧光传感器，充分混合，置于室温下完全反应；待反应结束后，将反应液置于275nm激发波长下，观察荧光颜色变化；若存在四环素类抗生素，则620nm处的荧光峰会被激发出来，荧光颜色变为红色。
6.一种g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将聚丙烯腈溶解在DMF中，获得聚丙烯腈溶液；然后将权利要求4所述的比率荧光传感器加入到聚丙烯腈溶液中，充分搅拌，获得g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺溶液；然后进行静电纺丝，获得g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜。
7.权利要求6所述方法制备的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜。
8.权利要求4所述比率荧光传感器或权利要求7所述的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜在食品中四环素类抗生素残留检测中的应用；所述四环素类抗生素选自强力霉素、四环素、金四环素和土霉素。
9.一种利用权利要求7所述的g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜检测食品中四环素类抗生素残留的方法，步骤如下：
将待测样品溶液滴加到g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上，或者，将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜浸入到待测样品溶液中，反应5min，然后将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜用365nm的紫外灯照射，观察荧光颜色变化；若存在四环素类抗生素，则电纺膜在紫外灯的照射下会变为红色。
10.一种利用智能手机对食品中四环素类抗生素残留进行定量检测的方法，步骤如下：
将待测样品溶液滴加到g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜上，或者，将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜浸入到待测样品溶液中，反应5min，然后将g-C3N4/CitNa/Eu/PAN电纺膜用365nm的手持式紫外灯照射，利用智能手机对激发体系的荧光进行拍摄，然后使用加载在智能手机中的颜色识别器将照片颜色信号转换为颜色信息，计算绿色和蓝色通道的比率，即G/B值，然后将G/B值代入标准曲线，获得四环素类抗生素浓度。
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| CN202310550007.XA CN116574503A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 一种比率荧光传感器、其制备方法及应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117517299A (zh) * | 2023-10-24 | 2024-02-06 | 中国石油大学(华东) | H2s比色/电学传感器及深度学习比色/电学双传感*** |
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- 2023-05-16 CN CN202310550007.XA patent/CN116574503A/zh active Pending
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