CN116515844B - 一种迁移体适配体及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种迁移体适配体及其筛选方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明设计并构建了适用于迁移体适配体筛选的方法，通过使用特定的随机寡核苷酸文库、引物组和磁性捕获探针，能够克服现有技术中缺少迁移体适配体筛选方法的问题。本发明提供的方法能够极大地提高筛选效率，降低适配体获得的时间成本，将磁性捕获探针用于正反靶标（迁移体和外泌体）的捕获和固定，能够在筛选过程中实现对囊泡成分的高效回收，避免了离心回收过程中的损失，防止低中拷贝序列的丢失，增加了筛选成果率，通过正负交替筛选能够提高所筛选的适配体的特异性和亲和力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种迁移体适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
迁移体（Migrasome）是细胞定向移动过程中，细胞尾部收缩丝交汇处和尖端部位产生的单层膜囊泡结构。顾名思义，迁移体的形成依赖于细胞的迁移，由于形成机制的差异，迁移体在大小、分子组成和生物学功能等方面也有别于外泌体、微泡等细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。迁移体涉及多种生理和病理过程，能够在肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与肿瘤微环境之间进行功能性转运，从而影响癌症的发生、发展和转移。早期研究结果显示，肿瘤来源的迁移体可以释放进入循环***，其携带内容物能够反映肿瘤细胞特征，具有代替肿瘤细胞本身作为液体活检的生物标志物的潜力。因此，富集和检测迁移体及其内容物对肿瘤的精准诊断、早期治疗和改善预后具有重要意义。
迁移体的富集主要依靠物理特性（尺寸、大小和密度），利用逐渐增大的离心力和梯度蔗糖溶液的密度差异，依次经超速离心法和密度梯度离心法将迁移体与其他EVs成分进行分离。然而，这些方法对样本量需求较大，且存在操作繁琐、耗时长、成本高昂、回收率低且没有标准化等问题。此外，血液中迁移体含量相对较少，且存在大量细胞、蛋白质、无机离子等物质，这些物质在传统离心富集的过程中会与迁移体共同沉淀，影响富集迁移体的纯度和后续检测结果的准确性。因此，迁移体的高效富集仍是目前限制其相关研究和应用的一大问题。
高效富集的前提则是对靶标进行高特异识别，目前用于靶标识别的分子主要有抗体和核酸适配体。其中，核酸适配体（Aptamer）又称为化学抗体，是一种短的寡核苷酸分子，他能形成独特的二级结构，特异性地与细胞、病原体等多种靶标进行结合。近年来，适配体因特异性和亲和力与抗体相当，但其成本更加低廉、稳定性高、免疫原性低、易于化学修饰等诸多优势，被广泛应用于各种生物医学领域中。
目前尚未见到能够适用于迁移体的适配体筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种迁移体适配体及其筛选方法和应用，以解决现有技术中缺少迁移体适配体筛选方法的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种迁移体适配体筛选方法，包括以下步骤：
S1.构建随机寡核苷酸文库、上游引物和下游引物；
所述随机寡核苷酸文库的序列如Seq ID No.1所示；
所述上游引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；
S2.采用磁性捕获探针分别固定迁移体和外泌体，得到磁性捕获探针-迁移体和磁性捕获探针-外泌体，
所述磁性捕获探针以Fe3O4纳米粒子为骨架，表面修饰有标记探针DSPE-PEG-Biotin；
S3.将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-外泌体共同孵育，磁分离后得到上清液1，所述上清液1中含有未与外泌体结合的核酸序列，将未与外泌体结合的核酸序列和磁性捕获探针-迁移体共同孵育，磁分离后得到磁性捕获探针-迁移体-单链核酸；
或，将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-迁移体共同孵育，获得磁性捕获探针-迁移体-单链核酸；
S4.将磁性捕获探针-迁移体-单链核酸进行热处理，磁分离后得到单链核酸；
S5.以S4得到的单链核酸为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S6.将扩增产物和磁性纳米粒子共同孵育，磁分离后得到双链DNA，所述磁性纳米粒子以Fe3O4纳米粒子为骨架，表面修饰有中性亲和素蛋白；
S7.在S6得到的双链DNA中加入NaOH水溶液，磁分离后得到上清液2，所述上清液2中含有未标记生物素的核酸链，在上清液2中加入HCl水溶液，得到次级文库；
S8.将得到的次级文库代替S3中所述的随机寡核苷酸文库，重复S3至S7的操作，将最终得到的次级文库作为候选文库；
S9.将候选文库扩增后进行高通量测序，并按照丰度从大到小的顺序将序列依次排序，得到丰度排序处于前30的序列；
S10.测定丰度排序处于前30的序列与迁移体的结合能力，选择结合能力最佳的序列，即为迁移体适配体。
优选的，所述上游引物的5’端修饰有FAM基团；
所述下游引物的5’端修饰有生物素。
优选的，所述热处理包括以下步骤：将磁性捕获探针-迁移体-单链核酸和PBS缓冲液混合，在90~100℃条件下处理3~8min。
优选的，S8中所述重复的次数为8次。
优选的，所述8次重复的过程中，每次S3中随机寡核苷酸文库的用量依次为：10nmol、327pmol、348pmol、314pmol、303pmol、265pmol、149pmol和151pmol。
优选的，S5中所述PCR扩增的反应条件为：退火温度为62℃，循环次数20轮，模板量为1.5μL。
优选的，S5中所述PCR扩增的反应体系包括：PCR Premix Taq 50μL、10μM FAM-P110μL、10μM Biotin-P2 10μL、模板 15μL、RNase-free Water 15μL；所述模板为步骤S4得到的单链核酸。
优选的，S3中所述将未与外泌体结合的核酸序列和磁性捕获探针-迁移体共同孵育的时间为30~90min；
所述将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-迁移体共同孵育的时间为30~90min；
所述将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-外泌体共同孵育的时间为30~60min。
本发明还提供了一种迁移体适配体，所述迁移体适配体的核苷酸序列如Seq IDNo.4所示。
本发明还提供了上述迁移体适配体在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明设计并构建了适用于迁移体适配体筛选的方法，此方法能够极大地提高筛选效率，降低适配体获得的时间成本。本发明将磁性捕获探针用于正反靶标（迁移体和外泌体）的捕获和固定，能够在筛选过程中实现对囊泡成分的高效回收，避免了离心回收过程中的损失，防止低中拷贝序列的丢失，增加了筛选成果率，通过正负交替筛选能够提高所筛选的适配体的特异性和亲和力。
本发明提供的迁移体适配体具有较高的特异性和亲和力，且在多种温度下都能与迁移体进行紧密结合，说明该适配体不仅可以作为迁移体的高特异、高亲和识别探针，用于体外诊断策略的构建中，在活体呈像乃至靶向治疗领域都具有应用潜能，具有一定的临床转化价值。
附图说明
图1为MCP的工作原理图；
图2为Mag-SELEX用于迁移体适配体的筛选流程图；
图3为激光共聚焦显微镜观察L929细胞收缩丝上的迁移体示意图；
图4为迁移体的扫描电镜图；
图5为迁移体的透射电镜图，其中A为2μm标尺下的投射电镜图，B为0.5μm标尺下的投射电镜图；
图6为蛋白免疫印迹法分析密度梯度离心后各组分Integrin α5、NDST1、PIGK、Tsg101和Alix的表达情况示意图；
图7为L929细胞外泌体的透射电镜图；
图8为外泌体的粒径分布图；
图9为激光共聚焦显微镜检测磁性捕获探针对迁移体的捕获性能结果图，其中A组图为磁性捕获探针检测结果，B组图为纳米粒子Fe3O4@SiO2-NA检测结果；
图10为记录MCP磁分离过程的示意图；
图11为磁回收效率曲线图；
图12为功能性标记探针的使用量筛选结果图；
图13为Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子与标记探针的孵育时间示意图；
图14为MCP的使用量示意图；
图15为MCP与迁移体的反应时间示意图；
图16为扫描电镜表征100μgMCP捕获迁移体后的形貌特征示意图；
图17为扫描电镜表征600μgMCP捕获迁移体后的形貌特征示意图；
图18为PCR扩增反应条件示意图；
图19为不同退火温度的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图；
图20为不同扩增循环数的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图；
图21为不同模板量的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图；
图22为流式细胞术检测迁移体与第6轮、第8轮筛选后的次级文库的结合情况示意图；
图23为迁移体核酸适配体的核算序列二级结构模拟图；
图24为流式细胞术检测Apt_B3与迁移体和外泌体的结合情况示意图；
图25为激光共聚焦显微镜检测Apt_B3与迁移体和外泌体的结合情况示意图；
图26为迁移体核酸适配体亲和力常数的测定示意图；
图27为不同反应温度下Apt_B3与迁移体的结合情况示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种迁移体适配体筛选方法，包括以下步骤：
S1.构建随机寡核苷酸文库、上游引物和下游引物：所述随机寡核苷酸文库的序列为：５’-TCAAGTCACAGGTTCCAGGT-N40-ATAGGCACTGACACGACACT-3’，其中：两端分别为Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示的20bp的固定序列，中间40个碱基为随机序列；所述上游引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；在本发明中，所述上游引物的5’端优选修饰有FAM基团，所述下游引物的5’端优选修饰有生物素；在筛选过程中，可以通过PCR扩增得到生物素和FAM修饰的dsDNA，有助于DNA文库富集程度的监测和及下一轮的筛选；还能够便于扩增后与亲和素磁性纳米粒子结合，从而在DNA双链解链后快速获得次级文库。
S2.采用磁性捕获探针分别固定迁移体和外泌体，得到磁性捕获探针-迁移体和磁性捕获探针-外泌体，所述磁性捕获探针以Fe3O4纳米粒子为骨架，表面修饰有标记探针DSPE-PEG-Biotin，还优选在表面逐步功能化修饰SiO2层、氨基层，所述磁性捕获探针的制备方法优选为：（1）超顺磁性 Fe3O4纳米粒子的制备：采用经典的高温水热法制备 Fe3O4纳米粒子。量取 60 mL乙二醇，加入到100 mL 聚四氟乙烯反应釜中，加入 2.43 g FeCl3·6H2O、0.45 g Na3CT 和 3.6 g NaOAc，将反应釜置于磁力搅拌器上剧烈搅拌1h。搅拌完毕后移除磁子， 将反应釜置于不锈钢套中加热至 200°C反应12h。冷却后采用磁分离的方式收集沉黑褐色积物，并依次用无水乙醇、去离子水清洗产物3~5次。最后，将清洗好的 Fe3O4纳米粒子真空干燥，以备后续使用。（2）Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子的制备：首先，称量100 mg上述 Fe3O4纳米粒子，加入到 20 mL HCl（0.1 M）中， 将容器置于超声波清洗器中超声处理30 min，再用去离子水清洗3遍。接着，向Fe3O4纳米粒子中加入8mL去离子水和32mL无水乙醇，再依次加入0.5mL 氨水（28%）和 0.5 mL TEOS，将得到的混合物继续超声10min，并在室温下剧烈搅拌反应4h。反应结束后将获得的 Fe3O4@SiO2纳米粒子分别用无水乙醇和去离子水清洗数次。然后将Fe3O4@SiO2纳米粒子加入至含36 mL无水乙醇和4 mL去离子水的混合溶剂中。将0.4 mL APTES溶解至上述混合溶液中，并持续搅拌反应6h。紧接着加入0.4 mLTEA，继续搅拌18h。最后，磁分离Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水将其清洗数次以备后续使用。（3）MCP 的制备：取上述 Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子5mg分散于1mL DMF中，超声处理3min，加入1 mL 吡啶和5 mL DMF。另称取1mg PDITC，溶解于3mL DMF中，再缓慢滴加至上述混合溶液中，室温条件下磁力搅拌1h。依次用DMF、无水乙醇、去离子水彻底清洗反应所得磁性纳米粒子。然后称取大约625μg中性亲和素蛋白，溶解在去离子水中，并与上一步所得磁性纳米粒子在 37°C条件下振荡反应1h，接着加入1% BSA 继续反应 30 min以封闭剩余位点。随后用PBS清洗 Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子2次，并取1 mg产物分散在PBS中，加入DSPE-PEG-Biotin，使其终浓度为1μM，室温条件下振荡孵育30min。最后用PBS清洗3次以去除磁珠表面的非特异性吸附分子。收集磁分离产物，并分散在PBS中，记作MCP，立即用于迁移体的捕获和固定；所述磁性捕获探针中，由于标记探针（DSPE-PEG-Biotin）可以通过脂质基团DSPE***细胞外囊泡膜中磷脂双分子层，因此可以利用MCP对迁移体模型进行捕获和固定，在与随机文库混合孵育后，可以高效的将迁移体进行分离回收。捕获原理如图1所示。
所述采用磁性捕获探针分别固定迁移体和外泌体的步骤优选为：取600μg MCP分散于PBS缓冲液中，加入囊泡模型（迁移体或外泌体），补充体系至2 mL，4℃摇床上1,000rpm反应30min后磁分离，用PBS清洗2遍，然后用1 mLPBS缓冲液重新分散MCP-囊泡复合物；所述迁移体和外泌体优选通过富集和鉴定得到，所述迁移体的富集与鉴定优选包括以下步骤：将稳定表达TSPAN4-GFP的L929细胞置于预处理了Fn的细胞培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养15h至细胞密度到达50%左右。将细胞用胰蛋白酶进行消化后，收集细胞悬液至50 mL无菌离心管中。首先4℃下1,000 g离心10min，排除多数细胞胞体成分，转移上清液至新的50 mL离心管。然后4℃，4,000 g离心20min，去除残留的细胞碎片，将上清转移到新的50 mL离心管。继续4℃，18,000 g离心30min，此时所得沉淀即为粗提迁移体。然后将粗提迁移体制备成蔗糖密度梯度为19%的样品梯度液，继续4℃，15,000 g离心4h。离心好的样本，用移液枪取出第六层密度梯度液成分0.5 mL至1.5 mL离心管中，补充PBS 1 mL，4℃条件下，18,000g离心30min，所得沉淀即精提迁移体，作为迁移体模型用于正向筛选。
所述外泌体的富集与鉴定优选包括以下步骤：
将L929细胞培养至生长密度约80%时，更换为无血清DEME培养基“饥饿”处理48h，然后收集培养基并通过0.22 μm的滤膜过滤。将滤液首先4℃，2,000 g离心20min，弃沉淀。上清液继续4℃，10,000 g离心30min，弃沉淀。然后将上清液4℃，100,000 g离心70min，弃上清，加入适量PBS清洗沉淀。最后将上述溶液再次4℃下100,000 g离心70min，加入100 μLPBS重悬沉淀。所得沉淀即为外泌体作为反向筛选靶标。
S3.将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-外泌体共同孵育，进行反筛，磁分离后得到上清液1，所述上清液1中含有未与外泌体结合的核酸序列，将未与外泌体结合的核酸序列和磁性捕获探针-迁移体共同孵育，进行正筛，磁分离后得到磁性捕获探针-迁移体-单链核酸。
或，将随机寡核苷酸文库和磁性捕获探针-迁移体共同孵育，进行正筛，磁分离后得到磁性捕获探针-迁移体-单链核酸。
所述正筛的时间优选为30~90min；S3中所述反筛的时间优选为30~60min。
S4.将磁性捕获探针-迁移体-单链核酸进行热处理，磁分离后得到单链核酸；所述热处理优选包括以下步骤：将磁性捕获探针-迁移体-单链核酸和PBS缓冲液混合，在90~100℃条件下处理3~8min。
S5.以S4得到的单链核酸为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物；所述PCR扩增的反应条件为：退火温度为62℃，循环次数20轮，模板量为1.5μL；所述PCR扩增的反应体系优选包括：PCR Premix Taq 50μL、10μM FAM-P1 10μL、10μM Biotin-P210μL、模板 15μL、RNase-free Water 15μL。
S6.将扩增产物和磁性纳米粒子共同孵育，磁分离后得到双链DNA，所述磁性纳米粒子以Fe3O4纳米粒子为骨架，表面修饰有中性亲和素蛋白，还优选在表面逐步功能化修饰SiO2层、氨基层，所述磁性纳米粒子的制备方法优选和上文中Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的制备方法相同。
S7.在S6得到的双链DNA中加入NaOH水溶液，磁分离后得到上清液2，所述上清液2中含有未标记生物素的核酸链，在上清液2中加入HCl水溶液，得到次级文库；所述NaOH水溶液的浓度优选为0.08~0.12M，所述HCl水溶液的浓度优选为0.08~0.12M。
S8.将得到的次级文库代替S3中所述的随机寡核苷酸文库，重复S3至S7的操作，将最终得到的次级文库作为候选文库；所述重复的次数优选为8次，所述8次重复的过程中，每次S3中随机寡核苷酸文库的用量优选依次为：10nmol、327pmol、348pmol、314pmol、303pmol、265pmol、149pmol和151pmol，所述8次重复的过程中，每次重复中正筛的时间优选依次为90min、90min、90min、60min、60min、45min、45min、30min，所述反筛的时间优选依次为0min、0min、0min、30min、45min、60min、0min、0min。
在本发明提供的筛选过程中，除了以迁移体作为正向靶标，还通过引入外泌体作为反向筛选靶标以提高候选适配体的特异性。经过数轮正反筛选后，获得的产物进行测序、二级结构预测，得到迁移体的特异性识别分子，筛选原理如图2所示。
S9.将候选文库扩增后进行高通量测序，并按照丰度从大到小的顺序将序列依次排序，得到丰度排序处于前30的序列；
S10.测定丰度排序处于前30的序列与迁移体的结合能力，选择结合能力最佳的序列，即为迁移体适配体。
本发明还提供了一种迁移体适配体，所述迁移体适配体的核苷酸序列如Seq IDNo.4所示。
本发明还提供了上述迁移体适配体在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用，所述迁移体适配体在应用时的环境温度优选为4~37℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1. 合成随机ssDNA初级文库（PrimaryLibrary）及上下游引物：初级文库：
５’-TCAAGTCACAGGTTCCAGGTnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnATAGGCACTGACACGACACT-3’
该文库共有10 nmol ssDNA。文库由中间40个碱基的随机序列（nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn，其中每一个n均代表随机碱基）和两端各20个碱基的固定序列组成，如Seq ID No.1所示。随机序列保证文库最初的随机性和容量，固定序列在PCR扩增时发挥引物结合的作用。
正向引物（P1）：5’-FAM-TCAAGTCACAGGTTCCAGGT-3’，如Seq ID No.2所示；
反向引物（P2）：5’-Biotin-AGTGTCGTGTCAGTGCCTAT-3’，如Seq ID No.3所示。
2. 从细胞中获取迁移体和外泌体分别作为正、反筛选靶标，并对靶标进行表征鉴定：
（1）正向筛选靶标（迁移体）的富集与鉴定
将稳定表达TSPAN4-GFP的L929细胞置于预处理了Fn的细胞培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养15h至细胞密度到达50%左右。将细胞用胰蛋白酶进行消化后，收集细胞悬液至50 mL无菌离心管中。首先4℃下1,000 g离心10min，排除多数细胞胞体成分，转移上清液至新的50 mL离心管。然后4℃，4,000 g离心20min，去除残留的细胞碎片，将上清转移到新的50 mL离心管。继续4℃，18,000 g离心30min，此时所得沉淀即为粗提迁移体。然后将粗提迁移体制备成蔗糖密度梯度为19%的样品梯度液，然后继续4℃，15,000g离心4h进行密度梯度离心。获取第六层密度梯度液成分作为迁移体模型用于正向筛选。迁移体的鉴定结果如图3~6所示，呈0.5-3μm典型“石榴样”形貌特征，且仅表达迁移体特异性蛋白而几乎不表达外泌体特异性蛋白。
（2）反筛靶标（外泌体）的富集与鉴定
将L929细胞培养至生长密度约80%时，更换为无血清DEME培养基“饥饿”处理48h，然后收集培养基并通过0.22 μm的滤膜过滤。将滤液首先4℃，2,000 g离心20min，弃沉淀。上清液继续4℃，10,000 g离心30min，弃沉淀。然后将上清液4℃，100,000 g离心70min，弃上清，加入适量PBS清洗沉淀。最后将上述溶液再次4℃下100,000 g离心70min，加入100 μLPBS重悬沉淀。所得沉淀即为外泌体作为反向筛选靶标。外泌体的鉴定结果如图7~8所示，呈典型“杯口状”形貌特征，粒径在30-150nm之间。
3. 合成磁性捕获探针（MCP）和磁性纳米粒子（Fe3O4@SiO2-NA）：
（1）超顺磁性 Fe3O4纳米粒子的制备
采用经典的高温水热法制备 Fe3O4纳米粒子。量取 60 mL乙二醇，加入到100 mL聚四氟乙烯反应釜中，加入 2.43 g FeCl3·6H2O、0.45 g Na3CT 和 3.6 g NaOAc，将反应釜置于磁力搅拌器上剧烈搅拌1h。搅拌完毕后移除磁子，将反应釜置于不锈钢套中加热至200°C反应12h。冷却后采用磁分离的方式收集沉黑褐色积物，并依次用无水乙醇、去离子水清洗产物3~5次。最后，将清洗好的 Fe3O4纳米粒子真空干燥，以备后续使用。
（2）Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子的制备
首先，称量100 mg上述 Fe3O4纳米粒子，加入到 20 mL HCl（0.1 M）中， 将容器置于超声波清洗器中超声处理 30 min，再用去离子水清洗3遍。接着，向Fe3O4纳米粒子中加入8mL去离子水和32mL无水乙醇，再依次加入0.5mL 氨水（28%）和 0.5 mL TEOS，将得到的混合物继续超声10min，并在室温下剧烈搅拌反应4h。反应结束后将获得的 Fe3O4@SiO2纳米粒子分别用无水乙醇和去离子水清洗数次。然后将Fe3O4@SiO2纳米粒子加入至含36 mL无水乙醇和4 mL去离子水的混合溶剂中。将0.4 mL APTES溶解至上述混合溶液中，并持续搅拌反应6h。紧接着加入0.4 mL TEA，继续搅拌18h。最后，磁分离Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水将其清洗数次以备后续使用。
（3）MCP 的制备
取上述 Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子5mg分散于1mL DMF中，超声处理3min，加入1 mL吡啶和5 mL DMF。另称取1mg PDITC，溶解于3mL DMF中，再缓慢滴加至上述混合溶液中，室温条件下磁力搅拌1h。依次用DMF、无水乙醇、去离子水彻底清洗反应所得磁性纳米粒子。然后称取大约625μg中性亲和素蛋白，溶解在去离子水中，并与上一步所得磁性纳米粒子在37°C条件下振荡反应1h，接着加入1% BSA 继续反应 30min以封闭剩余位点。随后用PBS清洗 Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子2次，并取1 mg产物分散在PBS中，加入DSPE-PEG-Biotin，使其终浓度为1μM, 室温条件下振荡孵育30min。最后用PBS清洗3次以去除磁珠表面的非特异性吸附分子。收集磁分离产物，并分散在PBS中，记作MCP，立即用于迁移体的捕获和固定。
4. 适配体筛选：
（1）文库与靶标孵育：以第一轮筛选为例，从26皿150mm大小培养皿的细胞中提取迁移体，将其作为正筛靶标加至600μg MCP中，用PBS缓冲液补充体系至2 mL，4℃摇床上1000rpm反应30min。磁分离，用PBS缓冲液清洗磁性捕获探针-迁移体1遍。将10 nmol 随机ssDNA初级文库加至磁性捕获探针-迁移体中，4℃摇床1000rpm共同孵育90min；磁分离，用0.5 mL PBS缓冲液清洗磁性捕获探针-迁移体-ssDNA复合物1次，约1min；磁分离，弃上清液，加入1mL PBS缓冲液重悬磁性捕获探针-迁移体-ssDNA，通过95℃加热变性5min释放结合于迁移体表面的核酸链；磁分离，回收上清液。在后续几轮的筛选中，通过逐渐减少迁移体的用量、减少迁移体与文库的孵育时间、增加洗涤次数、增加洗涤时间、增加洗涤液体积以及在第4-6轮筛选中引入外泌体作为反筛靶标来增大筛选压力，以提高所得适配体的特异性。
（2）PCR扩增：以步骤（1）中回收的核酸链作为模板，利用引物进行PCR扩增，得到FAM、Biotin修饰的dsDNA；
PCR扩增的反应条件为：退火温度为62℃，循环次数20轮，模板量为1.5μL
PCR扩增的反应体系为：PCR Premix Taq 50μL、10μM FAM-P1 10μL、10μM Biotin-P2 10μL、模板 15μL、RNase-free Water 15μL，总反应体系100μL。
（3）制备次级文库：将PCR扩增产物加入到500 μg Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子中，通过生物素亲和素作用将扩增的dsDNA进行捕获，并通过磁分离方式进行回收。然后加入400 μL0.1M NaOH破坏DNA双链结构。未标记生物素的核酸链此刻脱离磁珠的捕获而漂浮于上清液中，通过磁分离收集上清液，加入400 μL 0.1 M HCl中和，即可得到用于下一轮筛选的次级文库，代替随机ssDNA初级文库重新进行步骤（1）~（3），共进行8次筛选，所用的筛选条件如下表1所示（其中迁移体和外泌体的用量以获得迁移体/外泌体所需要的150mm规格的细胞皿数量为定量依据）：
表1 迁移体核酸适配体的Mag-SELEX筛选条件
（4）流式细胞术监测文库富集程度：测量每一轮筛选所获得FAM-ssDNA文库的浓度，根据浓度取出等量的DNA溶液，将其加入至磁性捕获探针-迁移体中，通过流式细胞仪检测磁性捕获探针-迁移体-DNA表面的荧光信号强度，迁移体与第6轮、第8轮筛选后的次级文库的结合情况如图22所示，阴性对照为初始随机ssDNA文库，随着筛选轮数的增加，迁移体表面的荧光信号也在逐渐增强。当完成第六轮筛选后，所得次级文库与迁移体结合能力较初级随机ssDNA文库明显增加，说明特异性适配体正在富集。而第八轮筛选后，迁移体与次级文库的结合与第六轮相比，变化不明显，说明富集已达到平台期，该文库中已富集到一定比例的迁移体核酸适配体。可以终止筛选，并将ssDNA文库扩增后进行高通量测序分析。
5. 高通量测序及二级结构分析：
通过高通量测序分析，共检测到42371条序列数据，通过对丰度在前30的序列进行迁移体结合能力进行逐一检测，我们挑选出结合能力最好的序列，即迁移体核酸适配体（Apt_B3），其一级序列为：
5’-TCAAGTCACAGGTTCCAGGTGGCGGCACGGTTTCCCGGATTTCCGCGTTCGAGCTCCGGCATAGGCACTGACACGACACT-3’，如Seq ID No.4所示。
适配体自身形成的二级结构和高级结构对其与靶标的特异性结合有一定的影响。通过M-fold软件对Apt-B3的二级结构进行预测，结构显示Apt-B3能够通过碱基互补配对，形成明显的茎环结构，二级结构的自由能：-5.18kcal/mol，如图23所示。这为其形成复杂的三级结构提供了结构基础，也在与迁移体的特异性结合中发挥重要作用。
实验例1 MCP的捕获性能分析
为排除MCP表面中性亲和素蛋白对迁移体的非特异性吸附，我们将MCP对模型迁移体的捕获性能进行了验证。取1 mg Fe3O4@SiO2-NA，与标记探针-迁移体在4℃条件下振荡反应30min，磁分离后用PBS清洗和分散。另取等量Fe3O4@SiO2-NA直接与迁移体在相同条件下进行反应，作为实验对照组。由于产生迁移体的L929细胞系稳定表达TSPAN4-mCherry，因此所使用的迁移体也能够稳定显示红色荧光信号。用CLSM观察两组的捕获性能情况，结果如图9所示，图9中A组图为磁性捕获探针检测结果，B组图为纳米粒子Fe3O4@SiO2-NA检测结果。
CLSM结果显示，MCP上有红色荧光信号出现，而Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子表面无荧光信号，这一结果有效说明MCP对迁移体的捕获是通过MCP表面的标记探针中的脂质基团DSPE对细胞外囊泡的膜结构进行锚定而实现的，而不是非特异性吸附导致。
实验例2 MCP的磁回收效率
MCP的高效回收可以有效避免迁移体的损失，因此探针的的磁分离效率相当重要。
取100μg MCP分散在PBS中，在外加磁场作用下，在不同时间点取样本的上清液，紫外分光光度计测试各样本的紫外吸收强度。通过Fe3O4-NPs浓度-紫外吸收强度标准曲线测定各样本中MCP的含量，进而计算得到各时间点的磁回收效率。另外，在初试分离时刻（0 s）和达到最大磁回收效率时间点拍照记录。如图10~11所示。
结果显示，MCP的磁响应性能良好，磁回收率在20秒内达到81.75%，在1min内几乎达到100%的纳米粒子被外磁场有效收集。这一结果展示了MCP快速的磁响应能力，保证了对富集到的迁移体的快速回收。
实验例3 选择MCP反应条件和捕获条件
高的捕获效率是分离方法的一项重要指标，也是确保迁移体能最大程度被富集的关键。
为了提高磁性纳米复合材料的捕获效率，我们对MCP的最佳反应条件和捕获条件进行了实验：
（1）LP最佳用量的优化
取DSPE-PEG-Biotin 0.001 μmol、0.01 μmol、0.1 μmol、1 μmol、10 μmol和100 μmol，分别与过量Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子在室温下振荡反应30min，磁分离，用PBS清洗2次。向各组加入等量的迁移体模型，在4℃摇床上孵育30min，磁分离，用PBS清洗1次。用2.5%SDS溶液裂解磁珠上捕获到的迁移体，收集迁移体蛋白溶液，微量BCA法检测蛋白浓度。根据公式1计算捕获效率。
捕获效率（%）=C1/C0×100% （公式1）
其中，C1代表捕获到的迁移体蛋白浓度，C0代表投放的迁移体原蛋白浓度。
（2）标记探针与Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的最佳反应时间筛选
用PBS将DSPE-PEG-Biotin稀释至终浓度为1μM，加入Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子600 μg，室温条件下分别振荡反应5min、15min、30min、45min、60min后磁分离，用PBS清洗1次。向各组加入等量的迁移体模型，在4℃条件下振荡反应30min后磁分离，用PBS清洗1次。用2.5%SDS溶液裂解磁珠上捕获到的迁移体，收集迁移体蛋白溶液，微量BCA法检测蛋白浓度。
（3）MCP最佳投入量的优化
用PBS将DSPE-PEG-Biotin稀释至终浓度为1 μM，分别加入100 μg、150 μg、300 μg、450 μg、600 μg、750 μg和900 μg 的Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子，室温条件下振荡反应30min后磁分离，用PBS清洗1次。向各组加入等量迁移体模型，4℃条件下振荡反应30min后磁分离，用PBS清洗1次。取少量产物用PBS稀释到合适浓度后，滴加10 μL 于洁净的硅片表面，待其自然干燥后，通过SEM观察磁性捕获探针-迁移体复合物的形貌特点。再用2.5% SDS溶液裂解磁珠上捕获到的迁移体，收集迁移体蛋白溶液，微量BCA法检测蛋白浓度。
（4）MCP与模型迁移体的最佳孵育时间筛选
用PBS将DSPE-PEG-Biotin稀释至终浓度为1 μM，加入Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子600μg，室温下振荡反应30min后磁分离，PBS清洗2次。加入迁移体模型，4℃振荡反应5min、15min、30min、45min、60min后磁分离，用PBS清洗1次。用2.5%SDS溶液裂解磁珠上捕获到的迁移体，收集迁移体蛋白溶液，微量BCA法检测蛋白浓度。
结果如图12~17所示，通过结果可知，本发明得到了MCP反应条件中的最佳LP用量为1 μmol、最佳MCP用量为600 μg、LP与Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的最佳反应时间为30min以及捕获条件中MCP对迁移体的最佳捕获时间为30min，证明本发明实施例1中的参数为最优参数。
实验例4 选择PCR扩增条件
PCR扩增结果直接影响后续筛选步骤的质量，是适配体筛选环节至关重要的一步。
通过对退火温度、模板量以及循环次数这三个PCR关键条件进行实验，来获得最大扩增效率，从而保证后续步骤的顺利进行。
PCR反应体系为：PCR Premix Taq 50μL、10μM FAM-P1 10μL、10μM Biotin-P2 10μL、模板 15μL、RNase-free Water 15μL，总反应体系100μL；反应条件如图18所示。
通过3%琼脂糖凝胶电泳验证扩增情况，不同退火温度的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图19所示，其中泳道1-11依次为：Marker、阴性对照、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃和72℃；不同扩增循环数的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图20所示，其中泳道1-7依次为：Marker、阴性对照、20个循环、22个循环、24个循环、26个循环和28个循环；不同模板量的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图21所示，其中泳道1-7依次为：Marker、阴性对照、0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL和3 μL。
结果显示，得到的最佳PCR扩增条件为：62℃作为后续PCR实验的退火温度，20个轮为最佳循环次数，以及1.5μL作为最佳模板量，证明本发明实施例1中的参数为最优参数。
实验例5 迁移体适配体Apt-B3特异性检测
通过流式细胞术检测了Apt_B3分别与迁移体和外泌体结合的情况，阴性对照为初级随机ssDNA文库，结果如图24所示。
结果显示：相比于阴性对照，Apt_B3与迁移体结合后荧光峰有显著位移，而与外泌体结合后，其荧光峰的位置没有明显的变化。
进一步先用WGA染料将囊泡进行标记，然后与带有FAM标记的适配体共同孵育，通过CLSM表征其与迁移体和外泌体的结合情况，结果如图25所示。
结果显示：囊泡（红色）在于Apt_B3孵育完成后，能够观察到迁移体表面有更为明显的绿色荧光信号，而外泌体表面几乎没有荧光信号。说明Apt_B3与迁移体的结合能力最强，且几乎不与外泌体结合，也证明了Apt_B3与迁移体的结合具有高度特异性，有望作为迁移体的特异性识别探针，在疾病的诊断和治疗领域具有一定潜力。
实验例6 迁移体适配体Apt-B3亲和力测定
通过流式细胞术评估了Apt_B3与迁移体结合的亲和常数。将FAM基团修饰的Apt_B3稀释成10 nmol/L、50 nmol/L、150 nmol/L、300 nmol/L、450 nmol/L、600 nmol/L和750nmol/L，分别与等量迁移体在4℃避光孵育30min。然后用PBS洗涤2次，利用流式细胞术检测不同浓度适配体与迁移体结合后的荧光信号强度，每组计数10000个颗粒，根据公式2计算出Apt_B3与迁移体结合的Kd值，如图26所示：
式中：Y为平均荧光强度；X为核酸适配体的不同浓度；Bmax为所测得的最大荧光强度；Kd为平衡解离常数。
结果显示，Apt_B3与迁移体结合的Kd值为251.9 nM，说明Apt_B3与迁移体结合的亲和力是非常高的。
实验例7 温度对核酸适配体结合能力的影响
为了验证温度是否影响Apt_B3与迁移体的结合，将FAM修饰的Apt_B3与固定在MCP上的迁移体分别在4℃、25℃和37℃条件下避光孵育30min，然后用PBS洗涤2次，通过流式细胞术检测不同反应温度下迁移体表面的荧光信号强度，每组计数10000个颗粒，随机ssDNA作为阴性对照，结果如图27所示。
由结果可以看出，在三种环境下，Apt_B3均能与适配体良好结合，其在4℃和25℃条件下结合能力最强，相较随机ssDNA文库增加了约两个数量级的荧光信号。随着温度的增加，适配体的结合能力少有减弱，37℃条件下荧光信号仅比随机ssDNA文库增加一个数量级，说明温度能一定程度影响适配体的结合能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种迁移体适配体，其特征在于，所述迁移体适配体的核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
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