CN116515788B - R型ω-转氨酶及其应用 - Google Patents
R型ω-转氨酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116515788B CN116515788B CN202310761031.8A CN202310761031A CN116515788B CN 116515788 B CN116515788 B CN 116515788B CN 202310761031 A CN202310761031 A CN 202310761031A CN 116515788 B CN116515788 B CN 116515788B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aminotransferase
- transaminase
- type
- seq
- omega
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101710164401 Omega-aminotransferase Proteins 0.000 title abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 37
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 17
- -1 amine compound Chemical class 0.000 abstract description 10
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 87
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 76
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 54
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 50
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 30
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 30
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 30
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 28
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 25
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 21
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- IOXOZOPLBFXYLM-UHFFFAOYSA-N 2-(4-nitrophenyl)ethanamine Chemical compound NCCC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IOXOZOPLBFXYLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 16
- QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 2-Oxohexane Chemical compound CCCCC(C)=O QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JARKCYVAAOWBJS-UHFFFAOYSA-N hexanal Chemical compound CCCCCC=O JARKCYVAAOWBJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- TWXWPPKDQOWNSX-UHFFFAOYSA-N dicyclohexylmethanone Chemical compound C1CCCCC1C(=O)C1CCCCC1 TWXWPPKDQOWNSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N sitagliptin Chemical compound C([C@H](CC(=O)N1CC=2N(C(=NN=2)C(F)(F)F)CC1)N)C1=CC(F)=C(F)C=C1F MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N 0.000 description 3
- 229960004034 sitagliptin Drugs 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N moxifloxacin Chemical compound COC1=C(N2C[C@H]3NCCC[C@H]3C2)C(F)=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C1N2C1CC1 FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N 0.000 description 1
- 229960003702 moxifloxacin Drugs 0.000 description 1
- RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylmethanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1 RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了R型ω‑转氨酶，包括ω‑转氨酶TA‑R1、ω‑转氨酶TA‑R2或ω‑转氨酶TA‑R3的至少一种，所述ω‑转氨酶TA‑R1的氨基酸序列如Seq ID NO：1所示，ω‑转氨酶TA‑R2的氨基酸序列如Seq ID NO：2所示，ω‑转氨酶TA‑R3的氨基酸序列如Seq ID NO：3所示。本发明提供的R型的ω‑转氨酶TA‑R1、TA‑R2、TA‑R3及其基因，解决了现有手性胺不对称生物合成技术中R型的ω‑转氨酶资源相对不足的问题，并基于新酶资源开发了新的R型手性胺化合物不对称生物合成方法。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及R型ω-转氨酶及其基因和应用。
背景技术
手性胺类药物是手性药物中的一个重要类别，很多药物分子在合成过程中都有手性胺结构模块的参与。例如，降糖药物西他列汀、抗菌药物莫西沙星等，都含有手性胺结构单元。开发经济、绿色、特异、高效的手性胺合成技术，是手性药物合成开发领域的一个重要方面。目前，手性胺类化合物可通过三种方式合成，即化学合成、动力学拆分、不对称生物催化合成。传统的化学合成法一般具有反应体系明确、通用性好的优点，但同时也经常存在反应步骤多、立体选择性有限、重金属污染、催化剂成本高等问题。动力学拆分法具有反应简单的优点，利用合适的催化剂对外消旋胺进行手性拆分即可，但该方法的最高理论转化率为50%，大大限制了这种方法的工业应用潜力。相比之下，利用ω-转氨酶不对称催化合成手性胺，则具有反应简单、过程温和、立体特异性高等特点，已在手性胺合成生产中展现了巨大应用潜力。2010年，美国默克公司和Codexis公司研究人员运用蛋白质工程技术，改造获得了一个溶剂耐受能力强、催化活力高的ω-转氨酶突变体ATA117，并成功用于降糖药物西他列汀的催化合成过程，实现了西他列汀生产工艺的大幅简化以及生产效率的显著提升（2010 Science 329: 305-309）。
获得具有立体催化特异性的ω-转氨酶，是进行手性胺不对称生物合成的前提。由于自然界中R型ω-转氨酶的丰度远低于S型，当前可用的R型ω-转氨酶催化剂资源十分有限，这一情况限制了R型手性胺化合物的合成。为了弥补R型ω-转氨酶资源相对不足的现状以及开发新的R型手性胺化合物合成方法，本发明利用基于机器学习算法驱动的酶元件挖掘研究技术，从海洋宏基组数据库中挖掘获得一种R型ω-转氨酶，用于R型手性胺化合物的生物合成。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明提供了R型的ω-转氨酶及其基因，解决了现有手性胺不对称生物合成技术中R型的ω-转氨酶资源相对不足的问题，并基于新酶资源开发新的R型手性胺化合物不对称生物合成方法。
本发明提供了R型ω-转氨酶，包括ω-转氨酶TA-R1、ω-转氨酶TA-R2或ω-转氨酶TA-R3的至少一种，所述ω-转氨酶TA-R1的氨基酸序列如Seq ID NO：1所示，ω-转氨酶TA-R2的氨基酸序列如Seq ID NO：2所示，ω-转氨酶TA-R3的氨基酸序列如Seq ID NO：3所示。
本发明还提供了所述的R型ω-转氨酶的基因，所述基因序列包括下述①、②、③至少一种基因序列，
①所述R型ω-转氨酶为ω-转氨酶TA-R1，ω-转氨酶TA-R1基因序列为如下a）或b）所示的核苷酸序列：a）如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列；b）如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使获得如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
②所述R型ω-转氨酶为ω-转氨酶TA-R2，基因序列为如下c）或d）所示的核苷酸序列：c）如Seq ID NO：5所示的核苷酸序列；d）如Seq ID NO：5所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使获得如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
③所述R型ω-转氨酶为ω-转氨酶TA-R3，ω-转氨酶TA-R3基因序列为如下e）或f）所示的核苷酸序列：e）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列；f）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使获得如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，本发明提供的R型ω-转氨酶TA-R1，包括如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明利用已公开的海洋微生物宏基因组数据资源OM-RGC（2015 Science 348:1261359）作为数据源，进行R型ω-转氨酶资源的挖掘。首先，根据功能已知的R型ω-转氨酶蛋白序列构建BLOSUM矩阵，根据对矩阵的分析建立相应隐马尔科夫模型，进行利用该模型在OM-RGC数据库中进行搜索，获得本发明所述R型ω-转氨酶TA-R1，其氨基酸序列如Seq IDNO：1所示，蛋白大小为309个氨基酸残基。与节杆菌（Arthrobacter sp.）来源的典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号BAK39753.1）相比，TA-R1与其序列一致性为33%；与土曲霉（Aspergillus terreus）来源的另一典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号XP_001209325.1）相比，TA-R1与其序列一致性也仅为37%。
优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1，对苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠中至少一种氨基受体具有转氨酶活性。上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化温度为25-45℃。进一步优选的催化温度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃。上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1，催化体系pH为6.5-9.0。进一步优选的催化体系pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化体系中氨基供体/受体摩尔比：1:1～20:1。进一步优选为，1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化体系中包含0.1-2.0mM的磷酸吡哆醛（PLP）。进一步优选为，0.1、0.3、0.7、1.0、1.4、1.8、2.0mM。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化体系中包含5%～20% DMSO（体积百分数）。进一步优选为，5%、8%、10%、12%、15%、17%、20%，10%-20%。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化体系中包含浓度范围为0.02-0.15M的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲溶液。进一步优选为，0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15M。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R1催化体系包括：0.1M磷酸钾缓冲液、10 mM氨基受体、5%～20% DMSO、0.5 mM磷酸吡哆醛、25 mM 氨基供体、0.4～2.0 mg/mlR型ω-转氨酶TA-R1。
上述任一项优选的是，所述氨基供体包括4-硝基苯乙胺、R型甲基苄胺。
在本发明一项优选的实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM氨基受体、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4～2.0 mg/ml转氨酶TA-R1催化剂，在30℃条件下500rpm振荡反应18小时，TA-R1对苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠中至少一种氨基受体具有转氨酶活性。
在本发明一项优选实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30°C条件下400 rpm振荡反应18小时，TA-R1对R-MBA为氨基供体具有催化活性，对S-MBA没有明显催化活性。
本发明还提供了一种R型ω-转氨酶TA-R1基因，其基因序列为如下a）或b）所示的核苷酸序列：a）如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列；b）如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，b）所示的核苷酸序列为Seq ID NO：4所示的核苷酸序列经过大肠杆菌表达的密码子优化获得。密码子优化的方法为现有技术中已知的软件或方法。
优选的，Seq ID NO：4所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选为Seq ID NO：7所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒由上述的基因序列与表达载体质粒连接构建而成。
优选的，所述表达载体包括pET系列、pET-GST、pGEX系列(含GST标签)、 pMAL系列等，进一步优选为pET-28b(+)载体、pET15b,pET28a、pGEX4T1,pGEX-6p-1等。优选的，将SeqID NO：4编码的TA-R1序列构建于pET-28b(+)载体，获得pET-28b(+)-TA-R1质粒。
上述任一项优选的是，所述重组质粒转化宿主菌获得TA-R1重组基因工程菌株。优选的，所述基因工程菌为转染有pET-28b(+)-TA-R1质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了上述任一项所述的R型ω-转氨酶TA-R1及所述的重组质粒在R型手性胺化合物不对称生物合成中的应用。
本发明还提供了含有上述任一项所述的R型ω-转氨酶或所述重组质粒的重组工程菌及其破碎液在R型手性胺化合物不对称生物合成中的应用。
优选的，本发明提供的一种R型ω-转氨酶TA-R2，包括如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明利用已公开的海洋微生物宏基因组数据资源OM-RGC（2015 Science 348:1261359）作为数据源，进行R型ω-转氨酶资源的挖掘。首先，根据功能已知的R型ω-转氨酶蛋白序列构建BLOSUM矩阵，根据对矩阵的分析建立相应隐马尔科夫模型，进行利用该模型在OM-RGC数据库中进行搜索，获得本发明所述R型ω-转氨酶TA-R2，其氨基酸序列如Seq IDNO：2所示，蛋白大小为300个氨基酸残基。与节杆菌（Arthrobacter sp.）来源的典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号BAK39753.1）相比，TA-R2与其序列一致性为37%；与土曲霉（Aspergillus terreus）来源的另一典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号XP_001209325.1）相比，TA-R2与其序列一致性也仅为40%。
优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2，对氨基受体丙酮酸钠具有转氨酶活性。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化温度为25-45℃。进一步优选的催化温度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2，催化体系pH为6.5-9.0。进一步优选的催化体系pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中氨基供体/受体摩尔比：1:1～20:1。进一步优选为，1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含0.1-2.0mM的磷酸吡哆醛（PLP）。进一步优选为，0.1、0.3、0.7、1.0、1.4、1.8、2.0mM。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含5%～20% DMSO（体积百分数）。进一步优选为，5%、8%、10%、12%、15%、17%、20%，10%-20%。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含浓度范围为0.02-0.15M的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲溶液。进一步优选为，0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15M。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2，催化体系包括：0.1M磷酸钾缓冲液、10 mM氨基受体丙酮酸钠、5%～20% DMSO、0.5 mM磷酸吡哆醛、25 mM 氨基供体、0.4～2.0 mg/ml R型ω-转氨酶TA-R2。
上述任一项优选的是，所述氨基供体包括4-硝基苯乙胺、R型甲基苄胺。
在本发明一项 优选的实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM氨基受体丙酮酸钠、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4～2.0 mg/ml转氨酶TA-R2催化剂，在30℃条件下500rpm振荡反应18小时， TA-R2对丙酮酸钠具有转氨酶活性。
在本发明一项优选实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30°C条件下400 rpm振荡反应18小时，TA-R2对R-MBA为氨基供体具有催化活性，对S-MBA没有明显催化活性。
本发明还提供了一种R型ω-转氨酶TA-R2基因，其基因序列为如下c）或d）所示的核苷酸序列：c）如Seq ID NO：5所示的核苷酸序列；b）如Seq ID NO：5所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
d）所示的核苷酸序列为c）所示的核苷酸序列经过大肠杆菌表达密码子优化所得。密码子优化的方法为现有技术中已知的方法。
优选的，Seq ID NO：5所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选为Seq ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒由上述的基因序列与表达载体质粒连接构建而成。
优选的，所述表达载体包括pET系列、pET-GST、pGEX系列(含GST标签)、 pMAL系列等，进一步优选为pET-28b(+)载体、pET15b,pET28a、pGEX4T1,pGEX-6p-1等。优选的，将SeqID NO：5编码的TA-R2序列构建于pET-28b(+)载体，获得pET-28b(+)-TA-R2质粒。
上述任一项优选的是，所述重组质粒转化宿主菌获得TA-R2重组基因工程菌株。优选的，所述基因工程菌为转染有pET-28b(+)-TA-R2质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了上述任一项所述的R型ω-转氨酶TA-R2及所述的重组质粒以及含有所述R型ω-转氨酶TA-R2及所述的重组质粒的工程菌及其破碎液在R型手性胺化合物不对称生物合成中的应用。
优选的是，所述R型ω-转氨酶TA-R2对氨基受体丙酮酸钠具有转氨酶活性。
优选的是，所述R型ω-转氨酶TA-R2催化温度为25-45℃。进一步优选的催化温度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃。
优选的是，所述R型ω-转氨酶TA-R2催化体系pH为6.5-9.0。进一步优选的催化体系pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中氨基供体/受体摩尔比：1:1～20:1。进一步优选为，1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含0.1-2.0mM的磷酸吡哆醛（PLP）。进一步优选为，0.1、0.3、0.7、1.0、1.4、1.8、2.0mM。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含5%～20% DMSO（体积百分数）。进一步优选为，5%、8%、10%、12%、15%、17%、20%，10%-20%。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R2催化体系中包含浓度范围为0.02-0.15M的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲溶液。进一步优选为，0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15M。
优选的是，所述R型ω-转氨酶TA-R2催化体系包括：0.1M磷酸钾缓冲液、10 mM氨基受体、5%～20% DMSO、0.5 mM磷酸吡哆醛、25 mM 氨基供体、0.4～2.0 mg/ml R型ω-转氨酶TA-R2。
优选的是，所述R型ω-转氨酶TA-R2的氨基供体包括4-硝基苯乙胺、R型甲基苄胺。
优选的，本发明提供的R型ω-转氨酶TA-R3，包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
本发明利用已公开的海洋微生物宏基因组数据资源OM-RGC（2015 Science 348:1261359）作为数据源，进行R型ω-转氨酶资源的挖掘。首先，根据功能已知的R型ω-转氨酶蛋白序列构建BLOSUM矩阵，根据对矩阵的分析建立相应隐马尔科夫模型，进行利用该模型在OM-RGC数据库中进行搜索，获得本发明所述R型ω-转氨酶TA-R3，其氨基酸序列如Seq IDNO：3所示，蛋白大小为334个氨基酸残基。与节杆菌（Arthrobacter sp.）来源的典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号BAK39753.1）相比，TA-R3与其序列一致性为35%；与土曲霉（Aspergillus terreus）来源的另一典型R型ω-转氨酶（Genebank登录号XP_001209325.1）相比，TA-R3与其序列一致性也仅为34%。
优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3，对氨基受体丙酮酸钠具有转氨酶活性。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3催化温度为25-45℃。进一步优选的催化温度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3，催化体系pH为6.5-9.0。进一步优选的催化体系pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3催化体系中氨基供体/受体摩尔比：1:1～20:1。进一步优选为，1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3催化体系中包含0.1-2.0mM的磷酸吡哆醛（PLP）。进一步优选为，0.1、0.3、0.7、1.0、1.4、1.8、2.0mM。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3催化体系中包含5%～20% DMSO（体积百分数）。进一步优选为，5%、8%、10%、12%、15%、17%、20%，10%-20%。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3催化体系中包含浓度范围为0.02-0.15M的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲溶液。进一步优选为，0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15M。
上述任一项优选的是，所述的R型ω-转氨酶TA-R3，催化体系包括：0.1M磷酸钾缓冲液、10 mM氨基受体、5%～20% DMSO、0.5 mM磷酸吡哆醛、25 mM 氨基供体、0.4～2.0 mg/ml R型ω-转氨酶TA-R3。
优选的，所述氨基受体为丙酮酸钠。
上述任一项优选的是，所述氨基供体包括4-硝基苯乙胺、R型甲基苄胺。
在本发明一项优选的实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM氨基受体、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4～2.0 mg/ml转氨酶TA-R3催化剂，在30℃条件下500rpm振荡反应18小时，TA-R3对氨基受体丙酮酸钠具有转氨酶活性。
在本发明一项优选实施方式中，催化体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30℃条件下400 rpm振荡反应18小时，TA-R3对R-MBA为氨基供体具有催化活性，对S-MBA没有明显催化活性。
本发明还提供了一种R型ω-转氨酶TA-R3基因，其基因序列为如下e）或f）所示的核苷酸序列：e）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列；f）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，Seq ID NO：6所示的核苷酸序列经过大肠杆菌密码子优化，获得f）所示的核苷酸序列。密码子优化方法为现有技术中记载的方法。
优选的，Seq ID NO：6所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使其获得如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选为Seq ID NO：9所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒由上述的基因序列与表达载体质粒连接构建而成。
优选的，所述表达载体包括pET系列、pET-GST、pGEX系列(含GST标签)、 pMAL系列等，进一步优选为pET-28b(+)载体、pET15b,pET28a、pGEX4T1,pGEX-6p-1等。优选的，将SeqID NO：6编码的TA-R3序列构建于pET-28b(+)载体，获得pET-28b(+)-TA-R3质粒。
上述任一项优选的是，所述重组质粒转化宿主菌获得TA-R3重组基因工程菌株。优选的，所述基因工程菌为转染有pET-28b(+)-TA-R3质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了上述任一项所述的R型ω-转氨酶TA-R3及所述的重组质粒、或含有所述的R型ω-转氨酶TA-R3或所述的重组质粒的基因工程菌及其破碎液在R型手性胺化合物不对称生物合成中的应用。
附图说明
图1为本发明优选实施例3中TA-R1蛋白表达SDS-PAGE图。
图2为本发明优选实施例9中TA-R2蛋白表达SDS-PAGE图。
图3为本发明优选实施例15中TA-R3蛋白表达SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
（一）实施例1至实施例6为R型ω-转氨酶TA-R1制备、筛选的优选实施方式，并对转氨酶TA-R1活性的和催化立体特性的进行了确认及分析。
实施例1
含有TA-R1转氨酶基因的重组质粒的构建
以Seq ID NO：1所示的转氨酶TA-R1蛋白序列为模板，针对大肠杆菌进行DNA序列的密码子优化，合成用于异源表达的转氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。利用NdeI和XhoI酶切位点，通过分子克隆技术将目标基因克隆至pET-28b(+)载体上，获得用于表达TA-R1转氨酶的重组质粒，并通过化学转化法将其转化入大肠杆菌DH5α菌株。在含有卡那霉素的LB平板上获得阳性克隆，挑取单菌落后继续经LB培养基培养后提取质粒，测序结果确认了目标转氨酶基因DNA序列的正确性。
实施例2
含有TA-R1转氨酶的重组基因工程菌株的构建
取1 μl实施例1获得的重组表达质粒，将其在42℃条件下热激90秒，转化至100 μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经过37℃复苏1小时，取出100 μl细胞悬液涂布于含有50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。在37℃下，经过静置过夜培养。挑取单菌落验证为阳性克隆后，即获得重组基因工程菌。
实施例3
目标转氨酶TA-R1的诱导表达及转氨酶TA-R1催化剂的制备
挑取重组基因工程菌的单克隆菌落，接种于10ml 含有50 μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下摇床过夜培养。取过夜培养物按1%接种量接种至500 ml含有50 μg/ml 卡那霉素抗的 LB液体培养基中，在37℃下摇床培养至对数生长期，加入0.3 mM IPTG，于20℃下诱导目标转氨酶表达。诱导20小时后，取1ml培养物离心收集菌体，以SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）检查转氨酶是否在基因工程菌中成功表达，如图1所示，其中1为诱导前表达情况，2为诱导后表达情况，三角形指示了目标转氨酶在SDS-PAGE中的位置，其在胶图中的表观分子量在旁边标出。对成功表达转氨酶的菌体，将诱导培养物离心，收集细胞并重悬于20 mM的Tris-HCl缓冲液（pH8.0），利用超声法破碎细胞，离心后的上清液用作所述反应的催化剂。
实施例4
转氨酶TA-R1活性的初步筛选
对转氨酶活性的初筛在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.5），含有10 mM氨基受体（苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠）、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4~2.0 mg/ml转氨酶催化剂，在30°C条件下500rpm振荡反应18小时，观察反应物颜色变化情况，有红色沉淀生成代表具有转氨酶活性。结果表明，TA-R1对苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠中至少一种氨基受体具有转氨酶活性。
实施例5
转氨酶TA-R1活性的确认及催化立体特性的分析
对转氨酶活性的确认及催化立体特性分析在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30℃条件下400 rpm振荡反应18小时，加入等体积甲醇终止反应后，利用HPLC检测苯乙酮产物，根据底物丙酮酸钠转化率来评价目标转氨酶催化活性。结果如下表所示， TA-R1具有转氨酶活性，底物转化率分别为51.3%；此外，TA-R1特异性利用R-MBA为氨基供体，对S-MBA没有明显催化活性，如下表所示。上述结果确认，TA-R1为R型ω-转氨酶。
实施例6
将SEQ ID No.7所示的核苷酸序列用于构建TA-R1转氨酶基因的重组质粒及TA-R1重组基因工程菌株。所获得的TA-R1转氨酶为R型ω-转氨酶，对苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠中至少一种氨基受体具有转氨酶活性。
（二）实施例7至实施例12为R型ω-转氨酶TA-R2制备、筛选的优选实施方式，并对转氨酶TA-R2活性的和催化立体特性的进行了确认及分析。
实施例7
重组质粒pET-28b(+)-TA-R2的构建
优化Seq ID NO：2所示的转氨酶TA-R2氨基酸序列在大肠杆菌中表达的密码子，获得SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。通过合成获得SEQ ID No.5所示的用于异源表达的转氨酶基因，即目标基因。利用NdeI和XhoI酶切位点，通过分子克隆技术将所述目标基因克隆至pET-28b(+)载体上，获得用于表达TA-R2转氨酶的重组质粒pET-28b(+)-TA-R2，转化入大肠杆菌DH5α菌株。在含有卡那霉素的LB平板上获得阳性克隆菌株，挑取单菌落后继续经LB培养基培养后提取质粒，测序结果确认了pET-28b(+)-TA-R2的正确性。
实施例8
含有TA-R2转氨酶的重组基因工程菌株的构建
取1 μl实施例7获得的重组表达质粒pET-28b(+)-TA-R2，将其在42℃条件下热激90秒，转化至100 μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经过37℃复苏1小时，取出100 μl细胞悬液涂布于含有50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。在37℃下，经过静置过夜培养。挑取单菌落验证为阳性克隆后，即获得重组基因工程菌。
实施例9
目标转氨酶TA-R2的诱导表达及TA-R2转氨酶催化剂的制备
挑取重组基因工程菌的单克隆菌落，接种于10ml 含有50 μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下摇床过夜培养。取过夜培养物按1%接种量接种至500 ml含有50 μg/ml 卡那霉素抗的 LB液体培养基中，在37℃下摇床培养至对数生长期，加入0.3 mM IPTG，于20℃下诱导目标转氨酶表达。诱导20小时后，取1ml培养物离心收集菌体，以SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）检查转氨酶是否在基因工程菌中成功表达，如图2所示，其中1为诱导前表达情况，2为诱导后表达情况，三角形指示了目标转氨酶在SDS-PAGE中的位置，其在胶图中的表观分子量在旁边标出。对成功表达转氨酶的菌体，将诱导培养物离心，收集细胞并重悬于20 mM的Tris-HCl缓冲液（pH8.0），利用超声法破碎细胞，离心后的上清液用作所述反应的催化剂。
实施例10
转氨酶TA-R2活性的初步筛选
对转氨酶活性的初筛在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.5），含有10 mM氨基受体（苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠）、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4~2.0 mg/ml转氨酶催化剂，在30°C条件下500rpm振荡反应18小时，观察反应物颜色变化情况，有红色沉淀生成代表具有转氨酶活性。结果表明，TA-R2对丙酮酸钠具有转氨酶活性。
实施例11
转氨酶TA-R2活性的确认及催化立体特性的分析
对转氨酶活性的确认及催化立体特性分析在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30℃条件下400 rpm振荡反应18小时，加入等体积甲醇终止反应后，利用HPLC检测苯乙酮产物，根据底物丙酮酸钠转化率来评价目标转氨酶催化活性。TA-R2具有转氨酶活性，底物转化率为46.6%；此外，TA-R2特异性利用R-MBA为氨基供体，对S-MBA没有明显催化活性。上述结果确认，TA-R2为R型ω-转氨酶。
实施例12
将SEQ ID No.8所示的核苷酸序列用于构建TA-R2转氨酶基因的重组质粒及TA-R2重组基因工程菌株。所获得的TA-R2转氨酶为R型ω-转氨酶，对丙酮酸钠具有转氨酶活性。
（三）实施例13至实施例18为R型ω-转氨酶TA-R3制备、筛选的优选实施方式，并对转氨酶TA-R3活性的和催化立体特性的进行了确认及分析。
实施例13
含有TA-R3转氨酶基因的重组质粒的构建
以Seq ID NO：3所示的转氨酶TA-R3蛋白序列为模板，针对大肠杆菌进行DNA序列的密码子优化，合成用于异源表达的转氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。利用NdeI和XhoI酶切位点，通过分子克隆技术将目标基因克隆至pET-28b(+)载体上，获得用于表达TA-R3转氨酶的重组质粒，并通过化学转化法将其转化入大肠杆菌DH5α菌株。在含有卡那霉素的LB平板上获得阳性克隆，挑取单菌落后继续经LB培养基培养后提取质粒，测序结果确认了目标转氨酶基因DNA序列的正确性。
实施例14
含有TA-R3转氨酶的重组基因工程菌株的构建
取1 μl实施例13获得的重组表达质粒，将其在42℃条件下热激90秒，转化至100 μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经过37℃复苏1小时，取出100 μl细胞悬液涂布于含有50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。在37℃下，经过静置过夜培养。挑取单菌落验证为阳性克隆后，即获得重组基因工程菌。
实施例15
目标转氨酶TA-R3的诱导表达及TA-R3转氨酶催化剂的制备
挑取重组基因工程菌的单克隆菌落，接种于10ml 含有50 μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下摇床过夜培养。取过夜培养物按1%接种量接种至500 ml含有50 μg/ml 卡那霉素抗的 LB液体培养基中，在37℃下摇床培养至对数生长期，加入0.3 mM IPTG，于20℃下诱导目标转氨酶表达。诱导20小时后，取1ml培养物离心收集菌体，以SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）检查转氨酶是否在基因工程菌中成功表达，如图3所示，其中1为诱导前表达情况，2为诱导后表达情况，三角形指示了目标转氨酶在SDS-PAGE中的位置，其在胶图中的表观分子量在旁边标出。对成功表达转氨酶的菌体，将诱导培养物离心，收集细胞并重悬于20 mM的Tris-HCl缓冲液（pH8.0），利用超声法破碎细胞，离心后的上清液用作所述反应的催化剂。
实施例16
转氨酶TA-R3活性的初步筛选
对转氨酶活性的初筛在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.5），含有10 mM氨基受体（苯甲醛、苯乙酮、呋喃-2-甲醛、环己烷酮、己醛、2-己酮、丙酮酸钠）、20%二甲亚砜（DMSO）、0.5 mM 磷酸吡哆醛（PLP）、25 mM 氨基供体4-硝基苯乙胺（NEA）、0.4~2.0 mg/ml转氨酶催化剂，在30°C条件下500rpm振荡反应18小时，观察反应物颜色变化情况，有红色沉淀生成代表具有转氨酶活性。结果表明，TA-R3对丙酮酸钠具有转氨酶活性。
实施例17
转氨酶TA-R3活性的确认及催化立体特性的分析
对转氨酶活性的确认及催化立体特性分析在0.2 ml反应体系中进行，该体系为0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.5），含有10 mM丙酮酸钠、10% DMSO、0.5 mM PLP、25 mM R型或S型甲基苄胺（R-MBA或S-MBA）、0.4 mg/ml转氨酶催化剂，在30℃条件下400 rpm振荡反应18小时，加入等体积甲醇终止反应后，利用HPLC检测苯乙酮产物，根据底物丙酮酸钠转化率来评价目标转氨酶催化活性。TA-R3具有转氨酶活性，底物转化率为79.6%；此外，TA-R3特异性利用R-MBA为氨基供体，对S-MBA没有明显催化活性。上述结果确认，TA-R3为R型ω-转氨酶。
实施例18
将SEQ ID No.9所示的核苷酸序列用于构建TA-R3转氨酶基因的重组质粒及TA-R3重组基因工程菌株。所获得的TA-R3转氨酶为R型ω-转氨酶，对丙酮酸钠具有转氨酶活性。
实验表明，按照本发明记载的技术方案，由Seq ID NO：7所示的核苷酸序列获得的R型ω-转氨酶TA-R1，由Seq ID NO：8所示的核苷酸序列获得的R型ω-转氨酶TA-R2，或SeqID NO：9所示的核苷酸序列获得的R型ω-转氨酶TA-R3，与实施例1-实施例18获得的 R型ω-转氨酶TA-R1、R型ω-转氨酶TA-R2、R型ω-转氨酶TA-R3具有相同的技术效果，在此不进行赘述。
Claims (3)
1.一种R型ω-转氨酶，名称为ω-转氨酶TA-R3，所述ω-转氨酶TA-R3的氨基酸序列如Seq ID NO：3所示。
2. 权利要求1所述的R型ω-转氨酶的基因，其特征在于，所述R型ω-转氨酶为ω-转氨酶TA-R3，ω-转氨酶TA-R3基因序列为如下e）或f）所示的核苷酸序列：e）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列；f）如Seq ID NO：6所示的核苷酸序列经过一个或多个碱基的变化，使获得如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由权利要求2所述的基因序列与表达载体质粒连接构建而成。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310190336.8A CN116200361A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
| CN2023101903368 | 2023-03-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116515788A CN116515788A (zh) | 2023-08-01 |
| CN116515788B true CN116515788B (zh) | 2023-09-12 |
Family
ID=86518922
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310190336.8A Withdrawn CN116200361A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
| CN202310761031.8A Active CN116515788B (zh) | 2023-03-02 | 2023-06-27 | R型ω-转氨酶及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310190336.8A Withdrawn CN116200361A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN116200361A (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116200361A (zh) * | 2023-03-02 | 2023-06-02 | 斯芬克司药物研发（天津）股份有限公司 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104328093A (zh) * | 2013-11-26 | 2015-02-04 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | R型ω-转氨酶及其应用 |
| CN106754806A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-05-31 | 尚科生物医药（上海）有限公司 | 一种改进的转氨酶及其在(r)‑3‑氨基丁醇制备上的应用 |
| CN109609478A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 浙江工业大学 | α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用 |
| CN109609476A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 浙江工业大学 | α-转氨酶和突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用 |
| CN110982801A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 转氨酶突变体及其构建方法和应用 |
| CN112522228A (zh) * | 2020-09-21 | 2021-03-19 | 江苏海洋大学 | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 |
| CN114277008A (zh) * | 2020-09-28 | 2022-04-05 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种(r)-选择性转氨酶及其应用 |
| CN116200361A (zh) * | 2023-03-02 | 2023-06-02 | 斯芬克司药物研发（天津）股份有限公司 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
-
2023
- 2023-03-02 CN CN202310190336.8A patent/CN116200361A/zh not_active Withdrawn
- 2023-06-27 CN CN202310761031.8A patent/CN116515788B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104328093A (zh) * | 2013-11-26 | 2015-02-04 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | R型ω-转氨酶及其应用 |
| JP2016537991A (ja) * | 2013-11-26 | 2016-12-08 | ▲凱▼菜英医▲薬▼集▲団▼（天津）股▲フン▼有限公司 | Ｒ型ω−トランスアミナーゼ及びその応用 |
| CN106754806A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-05-31 | 尚科生物医药（上海）有限公司 | 一种改进的转氨酶及其在(r)‑3‑氨基丁醇制备上的应用 |
| CN109609478A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 浙江工业大学 | α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用 |
| CN109609476A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 浙江工业大学 | α-转氨酶和突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用 |
| CN110982801A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 转氨酶突变体及其构建方法和应用 |
| CN112522228A (zh) * | 2020-09-21 | 2021-03-19 | 江苏海洋大学 | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 |
| CN114277008A (zh) * | 2020-09-28 | 2022-04-05 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种(r)-选择性转氨酶及其应用 |
| CN116200361A (zh) * | 2023-03-02 | 2023-06-02 | 斯芬克司药物研发（天津）股份有限公司 | 一种新型R型ω-转氨酶TA-R1 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116200361A (zh) | 2023-06-02 |
| CN116515788A (zh) | 2023-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116515788B (zh) | R型ω-转氨酶及其应用 | |
| US11220701B2 (en) | Method for enzymatic preparation of R-3 aminobutyric acid | |
| CN110577948B (zh) | 一种l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用 | |
| US10837036B2 (en) | Method for preparing L-aspartic acid with maleic acid by whole-cell biocatalysis | |
| CN102994470A (zh) | 一种环氧化物水解酶基因(eh-b)原核表达及手性环氧氯丙烷的制备 | |
| CN108410831B (zh) | 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用 | |
| KR100244066B1 (ko) | D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조법 | |
| CN112522228A (zh) | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 | |
| CN114958934B (zh) | 一种制备l-草铵膦的方法 | |
| CN114350631B (zh) | 草铵膦脱氢酶突变体、工程菌、固定化细胞及应用 | |
| CN113322248B (zh) | 一种耐高温的l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用 | |
| CN112481320B (zh) | 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法 | |
| CN116064447A (zh) | 转氨酶及其突变体在手性胺合成中的应用 | |
| CN113930376A (zh) | 一种用于催化生产d-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法 | |
| Gao et al. | Whole-cell catalyze L-dopa to dopamine via co-expression of transport protein AroP in Escherichia coli | |
| CN113846084B (zh) | 卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用 | |
| WO2023092632A1 (zh) | 高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN116606824B (zh) | 一种异丁香酚单加氧酶突变体iem-f305w-l470e、工程菌及应用 | |
| CN116121310A (zh) | 一种利用酰胺酶合成右旋酮洛芬的方法 | |
| CN117431228A (zh) | 一种高立体选择性转氨酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN117402849A (zh) | 一种新型转氨酶突变体及其制备方法与应用 | |
| CN114317475A (zh) | 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用 | |
| CN114836457A (zh) | 一种生产手性苯甘氨酸的基因工程菌的制备及应用 | |
| CN117867045A (zh) | 一种生物酶法催化合成(s)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢化萘-2-胺的方法 | |
| CN116855468A (zh) | 一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |