CN117431228A - 一种高立体选择性转氨酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高立体选择性转氨酶突变体、编码基因及其应用，属于生物工程技术领域。所述转氨酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。本发明提供的转氨酶突变体相对野生型转氨酶具有更高的酶活力和立体选择性，可以以4‑羟基‑2‑丁酮为底物制备(R)‑3‑氨基丁醇，产物的收率高，光学纯度高，无副产物产生。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种针对紫色色杆菌来源转氨酶改造的转氨酶突变体、编码基因及其在制备(R)-3-氨基丁醇中的应用。
背景技术
度鲁特韦(dolutegravir，DTG)，化学名：(4R,12aS)-N-[(2,4-二氟苯基)甲基]-3,4,6,8,12,12Chemicalbooka-六氢-7-羟基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-b][1,3]噁嗪-9-甲酰胺，CAS登录号:1051375-16-6。度鲁特韦是一种针对人类免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)整合酶的抑制剂，主要用于治疗艾滋病病毒感染，对于遏制艾滋病传播具有至关重要的作用。
(R)-3-氨基丁醇是合成度鲁特韦的重要手性六元环构建块，在度鲁特韦的合成过程中，(R)-3-氨基丁醇的手性纯度决定了后续中间体的纯度，对合成高质量的度鲁特韦起到重要作用。光学纯度对于药物及其中间体的应用具有显著的影响。不同立体异构体在生物学上可能表现出各不相同的活性、代谢动力学和毒性。高光学纯度是确保药物能够以最佳方式与靶标分子相互作用，提高药物效力的关键因素。
因此，开发一种高效合成(R)-3-氨基丁醇的方法尤其是高光学纯度的合成方法有助于提升药物制备的效率、降低生产成本。
目前高光学纯度的(R)-3-氨基丁醇的合成方法主要包括化学法和生物法。化学法中常见的方法是使用四氢铝锂等作为还原剂的动力学拆分法，以及以手性化合物作为起始原料的直接合成方法。然而，这些方法存在着原材料原子利用率低、手性纯原料价格较为昂贵等问题，且反应步骤较长，从而导致生产成本较高。
相较于化学合成法，生物合成法具有反应条件温和、转化率高以及立体选择性强等优点。例如专利文献CN104131048A公开通过基因工程技术将来源于Arthrobacter.sp的D-转氨酶基因克隆到大肠杆菌宿主细胞中，表达获得重组D-转氨酶，最后以3-羰基丁醇为底物，催化反应获得(R)-3-氨基丁醇。转氨酶能够不对称催化潜在手性酮类化合物直接合成手性胺类化合物，在应用方面具有较好的前景。
然而，在实际应用中，野生型转氨酶在催化非天然底物的立体选择性往往不能满足实际应用的需求，需要借助蛋白质工程技术进行改造。例如专利文献CN108823179A公开对源自放线菌的转氨酶进行改造，将第80位缬氨酸突变为甘氨酸，第203位色氨酸突变为丝氨酸，第294位苏氨酸突变为丝氨酸，获得突变体蛋白，其对底物转化率提高了12％-25％。
目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限，因此深入挖掘不同来源的转氨酶，借助蛋白质工程技术进行分子改造，以期拓宽转氨酶在手性药物制造行业中的应用空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化活力高、立体选择性强的转氨酶用于制备高光学纯度(R)-3-氨基丁醇，满足工业化生产的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过蛋白质工程技术对紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)来源的转氨酶CvATA进行氨基酸突变获得转氨酶突变体，即所述转氨酶突变体是氨基酸序列如SEQID NO.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，具体的，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。
具体的，突变体N118G为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
突变体G225A为第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
突变体C418T为第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
突变体N118G/G225A为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
突变体N118G/C418T为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
突变体N118G/G225A/C418T为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第225位的甘氨酸突变为丙氨酸且第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
研究表明，相较于野生型转氨酶，上述转氨酶突变体的催化活力和立体选择性显著提升。
对所述转氨酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
本发明通过对紫色色杆菌来源的转氨酶编码基因进行定点突变，再克隆到宿主细胞中构建基因工程菌，通过诱导表达获得所述转氨酶突变体。
本发明还提供了用于编码所述转氨酶突变体的编码基因。本发明可以根据基因工程菌宿主细胞密码子偏好性对编码基因进行优化。进一步的，所述突变体编码基因在SEQID NO.2所示核苷酸序列的基础上对编码相应氨基酸的密码子进行突变获得。具体的，N118G为编码第118位天冬酰胺的密码子AAT突变为编码甘氨酸的密码子GGC，G225A为编码第225位甘氨酸的密码子GGC突变为编码丙氨酸的密码子GCG，C418T为编码第418位半胱氨酸的密码子TGT突变为编码苏氨酸的密码子ACC。
本发明还提供了包含编码所述的转氨酶突变体氨基酸序列的编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体以pET30a为载体质粒。
本发明还提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌，所述基因工程菌用于生产所述的转氨酶突变体。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，基因工程菌的宿主菌采用大肠杆菌E.coli，具体的，可采用E.coli BL21。
本发明还提供了一种构建所述转氨酶突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计定点突变引物，以携带有紫色色杆菌来源转氨酶编码基因的质粒为模板，进行反向PCR，获得转氨酶中第118位N突变为G或第225位G突变为A或第418位C突变为T的单位点突变产物；
(2)以单位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向PCR获得双位点突变产物；以双位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向PCR获得三位点突变产物；
(3)将所述单位点突变产物、双位点突变产物或三位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得转氨酶突变体表达菌株，诱导表达，获得所述的转氨酶突变体。
其中第118位N突变为G所需的引物：
N118G-F:5’-CGCGTGTTTTATACCGGCAGCGGCTCAGAATCAGTG-3’；
N118G-R:5’-CACTGATTCTGAGCCGCTGCCGGTATAAAACACGCG-3’；
第225位G突变为A所需的引物：
G225A-F:5’-GTTGCCGCCTTTGTGGCGGAACCGATTCAG-3’；
G225A-R:5’-CTGAATCGGTTCCGCCACAAAGGCGGCAAC-3’；
第418位C突变为T所需的引物：
C418T-F:5’-GATTATGCGCGCCACCGGCGATCATATTGTGAGC-3’；
C418T-R:5’-GCTCACAATATGATCGCCGGTGGCGCGCATAATC-3’；
优选的，重组质粒的原始载体为pET30a；宿主菌采用大肠杆菌E.coli BL21。
本发明的另一个目的是提供所述的转氨酶突变体在制备(R)-3-氨基丁醇中的应用，所述应用包括在添加胺供体条件下不对称催化4-羟基-2-丁酮胺化生成(R)-3-氨基丁醇。
本发明提供的转氨酶突变体在添加胺供体的形况下不对称催化4-羟基-2-丁酮胺化，生成高光学纯度的(R)-3-氨基丁醇，光学纯度>99％，具有良好的工业化应用前景。
所述应用包括：以含有转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，在外加丙氨酸和磷酸吡哆醛条件下以4-羟基-2-丁酮为底物，以含有机溶剂的pH值≤8的缓冲液为反应介质，在25-37℃、150-300rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-3-氨基丁醇。
本发明所述的转氨酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的转氨酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。
优选的，反应体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为20-100g/L，其中湿菌体含水质量为70-90％。更优选为50g/L。
优选的，反应体系中，底物的浓度为0.5-2g/L，更优选为1.8g/L。
优选的，反应体系中，丙氨酸的浓度为2-10g/L，更优选为9g/L。
优选的，反应体系中，磷酸吡哆醛的浓度为0.2-0.4g/L，更优选为0.25g/L。
优选的，pH缓冲溶液为磷酸缓冲液，即NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，其缓冲pH值7.0-8.0，进一步优选为7.4-7.6，更优选为7.5。
优选的，所述有机溶剂为异丙醇或二甲基亚砜，有机溶剂在pH缓冲溶液中的体积分数为8-12％，更优选为10％。
上述各原料的添加浓度，如湿菌体、底物、丙氨酸、磷酸吡哆醛均以1L pH缓冲液计算。
优选的，反应温度为37℃。
反应时间为3-6h，优选为4h。
优选的，振荡速率为220rpm。
优选的，所述的湿菌体为E.coli BL21/pET30a-CvATA-N118G/G225A/C418T。该突变体对(R)-3-氨基丁醇的产率可以达到45％，光学纯度>99％。
发酵培养方法为：重组工程菌接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养18h；种子液以1％体积比接种至新鲜的含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下振荡培养至菌体OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，25℃、220rpm诱导培养16h，于4℃、3500rpm离心10min收集菌体细胞。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的转氨酶突变体相对野生型转氨酶具有更高的酶活力，可以以4-羟基-2-丁酮为底物制备(R)-3-氨基丁醇，产物的收率高，无副产物产生。
(2)本发明利用转氨酶突变体作为度鲁特韦手性中间体生物催化剂，使得高光学纯度手性产物的获得更加经济简便，生产方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有很好的工业化应用前景。
附图说明
图1为第118位、第225位、第418位氨基酸残基的相对空间位置。
图2为重组质粒图谱。
图3为(S/R)-3-氨基丁醇标准品、E.coli BL21空白对照、转氨酶CvATA与底物4-羟基-2-丁酮反应所得产物的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的。如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
实施例1：构建可表达各突变体的工程菌
1、根据PDB蛋白质库中6s4g(紫色色杆菌来源转氨酶，www.rcsb.org/structure/6S4G)蛋白氨基酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成相应编码基因。即紫色色杆菌来源转氨酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
然后以质粒pET30a为载体，通过常规制备操作获得包含该编码基因的重组质粒pET30a，将该重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21中获得野生型转氨酶的工程重组菌株，将该重组菌株在含1‰卡那霉素抗性的LB平板上活化，37℃培养18h，挑取单菌落于同样含1‰卡那霉素抗性的50mL LB锥形瓶中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6左右，按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
2、转氨酶单位点118、225、418突变体的构建
以步骤1提取的质粒作为模板，使用QuikChange Lightning Site-DirectedMutagenesis Kit点突变试剂盒(Agilent,United States)完成突变质粒的构建。
具体的，将野生型氨基酸序列中的第118位的天冬酰胺(N)、第225位的甘氨酸(G)和第418位的半胱氨酸(C)进行单位点突变，设计相应的引物，如表1所示。
表1.突变引物
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| N118G-F： | CGCGTGTTTTATACCGGCAGCGGCTCAGAATCAGTG |
| N118G-R： | CACTGATTCTGAGCCGCTGCCGGTATAAAACACGCG |
| G225A-F： | GTTGCCGCCTTTGTGGCGGAACCGATTCAG |
| G225A-R： | CTGAATCGGTTCCGCCACAAAGGCGGCAAC |
| C418T-F： | GATTATGCGCGCCACCGGCGATCATATTGTGAGC |
| C418T-R： | GCTCACAATATGATCGCCGGTGGCGCGCATAATC |
将上述构建好的突变质粒转入大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，混匀后置于冰上25min，结束后将大肠杆菌E.coli BL21感受态放入温度42℃下热激90s后置于冰上缓和5min，再加入1mL LB培养基，于37℃下培养50min，结束后于12000rpm离心1min，取100μL上清重悬菌体，涂布于含1‰卡那霉素的LB平板上，于37℃恒温培养箱培养18h。
挑取平板上的单菌落于含有5mL LB培养基的试管中，培养8h后取其中1mL用于测序，测序结果正确的将剩余菌液添加等体积的40％甘油溶液，置于-80℃冰箱中保存备用。
分别获得转氨酶突变体工程菌E.coli BL21/pET30a-CvATA-N118G、E.coliBL21/pET30a-CvATA-G225A、E.coli BL21/pET30a-CvATA-C418T。测序结果显示编码第118位天冬酰胺(N)的密码子AAT突变为编码甘氨酸(G)的密码子GGC；编码第225位甘氨酸(G)的密码子GGC突变为编码丙氨酸(A)的密码子GCG；编码第418位半胱氨酸(C)的密码子TGT突变为编码苏氨酸(T)的密码子ACC。突变体N118G、G225A、C418T的氨基酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5。
3、转氨酶组合突变体的构建
以步骤2构建的pET30a-CvATA-N118G作为模板，使用点突变试剂盒完成突变质粒的构建，方法同上。
测序结果正确获得转氨酶突变体工程菌E.coli BL21/pET30a-CvATA-N118G/G225A、E.coli BL21/pET30a-CvATA-N118G/C418T。测序结果显示，编码第225位甘氨酸(G)的密码子GGC突变为编码丙氨酸(A)的密码子GCG；编码第418位半胱氨酸(C)的密码子TGT突变为编码苏氨酸(T)的密码子ACC。突变体N118G/G225A、N118G/C418T的氨基酸序列为SEQID NO.6、SEQ ID NO.7。
进一步以pET30a-CvATA-N118G/G225A质粒为模板，获得转氨酶突变体工程菌E.coli BL21/pET30a-CvATA-N118G/G225A/C418T，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
实施例2：各突变体的诱导表达
将实施例1构建的表达野生酶的工程菌和表达各突变体的工程菌分别接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基试管中，37℃培养18h。再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃、220rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于25℃、220rpm诱导培养16h。4℃、3500rpm离心10min收集湿菌体，分别得到表达野生酶的工程菌、表达各突变体的工程菌的湿菌体。
实施例3：各突变体制备(R)-3-氨基丁醇于底物浓度1.8g/L
配置含有9g/L丙氨酸、0.25g/L磷酸吡哆醛、1.8g/L 4-羟基-2-丁酮、10％异丙醇的pH为7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液作为反应溶液。
将实施例2获得的各突变体湿菌体利用反应溶液进行重悬，使其中的湿菌体含量为50g/L，配置成为反应体系溶液。取1mL该反应体系溶液，置于37℃，220rpm恒温摇床条件下反应4h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取并离心，37℃真空旋蒸1.5h，随后用液相流动相(pH为1.0的高氯酸水溶液)复溶。
利用高效液相色谱(HPLC)分析确定其产率和ee值，(S/R)-3-氨基丁醇标准品的液相色谱图如图3所示。最终测得产物ee值和产率如表2所示。
表2.各突变体制备(R)-3-氨基丁醇的ee值和产率
| 突变体描述 | 产率(％) | ee(％) |
| 野生型CvATA | 29.6 | 28.3(R) |
| N118G | 22.1 | >99(R) |
| G225A | 44.0 | 33.8(R) |
| C418T | 32.7 | 30.0(R) |
| N118G/G225A | 41.1 | >99(R) |
| N118G/C418T | 24.8 | >99(R) |
| N118G/G225A/C418T | 45 | >99(R) |
实验结果分析：与紫色色杆菌来源的野生型转氨酶CvATA相比，本发明所提供的转氨酶突变体具有更优良的催化活性和高立体选择性，CvATA突变体催化合成手性胺的最高时空产率可达到4.8g/L/天，ee值大于99％，光学纯度高。且催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，能高效催化潜手性酮的不对称胺化反应，具有很好的工业化应用开发前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。
2.如权利要求1所述的高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8所示。
3.一种转氨酶突变体基因，其特征在于，所述基因用于编码如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码如权利要求1或2所述高立体选择性转氨酶突变体氨基酸序列的编码基因。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET30a为载体质粒。
6.一种用于生产如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求4或5所述的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌。
8.如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体在制备(R)-3-氨基丁醇中的应用，其特征在于，所述应用包括在添加胺供体条件下不对称催化4-羟基-2-丁酮胺化生成(R)-3-氨基丁醇。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以含有转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，在外加丙氨酸和磷酸吡哆醛条件下，以4-羟基-2-丁酮为底物，以含有机溶剂的pH值≤8的缓冲液为反应介质，在25-37℃、150-300rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-3-氨基丁醇。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，反应体系中，底物的浓度为0.5-2g/L，丙氨酸的浓度为2-10g/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.2-0.4g/L，有机溶剂为异丙醇或二甲基亚砜，体积分数为8-12％，催化剂的用量以湿菌体重量计为20-100g/L，其中湿菌体含水质量为70-90％。
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