CN116515612A - 一种一体化集成的crispr核酸检测方法和芯片 - Google Patents

一种一体化集成的crispr核酸检测方法和芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片。包括用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应的一个核酸扩增腔，预先置有核酸扩增试剂；包括开设在核酸扩增腔上方的芯片上表面的加样口，与外界相通；包括用于核酸扩增产物检测的一个或两个CRISPR检测腔，内置有CRISPR检测试剂；加样口、核酸扩增腔、CRISPR检测腔、加样口依次之间通过芯片内流道连通构成一个环形循环通道。本发明可快速有效地实现核酸扩增及其产物中目的基因和内参基因的高特异性一体化集成检测，避免了气溶胶释放到周围环境中，同时提高了CRISPR检测试剂的利用率，降低了检测成本，简化了核酸检测操作和流程，提升了检测结果准确度。

Description

一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片
技术领域
本发明公开了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片，尤其是涉及到一种利用双重CRISPR对核酸扩增产物进行目的基因和内参基因一体化集成检测的方法和芯片，属于微生物学和生化分析领域。
背景技术
核酸扩增技术已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。常用的核酸扩增技术有聚合酶链式扩增(PCR)以及各种等温扩增方法，如环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。然而，目前许多核酸扩增还在使用实时光学检测，所用设备较为复杂，不适用于现场筛查。除了实时荧光检测之外，终点荧光检测也是核酸扩增产物检测的一种方法。但是，嵌入式核酸荧光染料在检测过程中缺乏特异性，容易造成假阳性，因此需要特异性更高的检测技术。
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成CRISPR/Cas***。某些Cas蛋白，如Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas13a蛋白、Cas14蛋白等，在crRNA链的引导下能特异性地结合目标链。同时，这些Cas蛋白结合目标链后会触发一种新的酶活性，无差别地切割任意单链DNA(ssDNA)。这一活性被称为旁路切割活性。在ssDNA两端修饰荧光基团和猝灭基团，当ssDNA探针被切割后，荧光基团和淬灭基团分离从而产生荧光。这种对单链DNA的反式切割是高效的，并且由于Cas蛋白的旁路切割是一个酶促反应，具有信号放大作用，因此具有很高的检测灵敏度。同时，Cas蛋白是在crRNA的引导下对目标链进行识别，具有很好的特异性。因此CRISPR/Cas***可作为核酸检测的工具，最终利用可视化荧光检测仪器可观察检测结果。
但是，目前核酸扩增技术和CRISPR核酸检测技术还存在着一些不足，有待改进。第一个主要问题是在核酸扩增结束后，需要将核酸扩增产物转移到CRISPR体系中，并进行混合，增加了操作复杂性。此外，如果扩增是在一个单独的反应管中进行，就需要在核酸扩增结束后将扩增管打开，加入检测液。开盖过程中，扩增产物的气溶胶容易扩散到引起环境中，有可能会导致后续检测的假阳性结果。第二个主要问题是，目前已有研究还无法在同一个体系中进行双重CRISPR检测。这是由于CRISPR体系中的具有旁路切割活性的Cas蛋白无差别地切割任意单链DNA，无法区分两个或多个检测靶标。如果除了目的基因，还需要检测内参基因，则需要使用两个含Cas蛋白的体系分别独立地检测目的基因和内参基因，检测过程较为繁琐；并且Cas蛋白容易失活，失去旁路切割活性，即使存在目的基因，也无法产生荧光。所以当目的基因检测无荧光时，无法根据内参基因检测的结果来确定是因为不存在目的基因还是Cas蛋白失活导致。
针对上述问题，本发明提出了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和相应的芯片，能够很好的实现核酸扩增和一体化集成CRISPR检测。该芯片是密闭的，可以避免气溶胶释放到周围环境中。其次，该方法和芯片集核酸扩增、目的基因的检测和内参基因的检测过程于一体，简化了目的基因和内参基因的检测流程。此外，目的基因检测结束后，其体系中的Cas蛋白又转移到了内参基因检测体系中，即目的基因检测和内参基因检测所使用的Cas蛋白是一样的。当目的基因检测无荧光、内参基因检测有荧光时，即可确定是因为不存在目的基因导致的目的基因检测无荧光，避免了上述无法判断的情况，提升了检测结果准确度。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片，可快速有效地实现核酸扩增及其产物中目的基因和内参基因的高特异性一体化集成检测。该方法和芯片避免了气溶胶释放到周围环境中，同时提高了CRISPR检测试剂的利用率，降低了检测成本。此外，还简化了核酸检测操作和流程并提升了检测结果准确度。
本发明的技术方案如下：
一、一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片：
所述芯片内部包含一个核酸扩增腔、一或两个CRISPR检测腔，以及将这些腔相连的通道，具体介绍如下：
包括一个核酸扩增腔，用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应，核酸扩增腔内预先置有预先包埋或冻干的核酸扩增试剂；
包括一个加样口，开设在核酸扩增腔上方的芯片上表面且与外界相通，待测样本溶液从加样口加入，核酸扩增腔和加样口通过芯片内部的流道连通；
包括一个或两个CRISPR检测腔，用于核酸扩增产物检测，CRISPR检测腔预先内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂；
核酸扩增腔和加样口之间、核酸扩增腔和其相邻的一个CRISPR检测腔之间、两个CRISPR检测腔之间、靠近加样口的CRISPR检测腔和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，所有芯片内部的流道构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环通道，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个CRISPR检测腔，完成目的基因和内参基因一体快捷迅速的CRISPR核酸检测。
芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔和CRISPR检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔和CRISPR检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
所述的核酸扩增腔位于芯片内的左侧、右侧或者底侧，CRISPR检测腔位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧。核酸扩增腔和CRISPR检测腔位于芯片内的不同侧边。
以核酸扩增腔和加样口之间所连通的芯片内部的流道作为入口流道，所述的靠近加样口的CRISPR检测腔经一芯片内部的流道连通到入口流道中，不是直接连通到加样口，也即靠近加样口的CRISPR检测腔和加样口之间的芯片内部的流道为在入口流道到CRISPR检测腔之间的芯片内部的流道。CRISPR检测腔经一芯片内部的流道连通到入口流道的连通点高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点。
所述的核酸扩增腔为竖直的空腔，位于加样口正下方的芯片左侧或者右侧且直接和加样口连通，核酸扩增腔的口径大于其他芯片内部的流道，使得方便加入待测样本溶液。这种情况下，核酸扩增腔自身相当于承担了入口流道的功能，CRISPR检测腔经芯片内部的流道直接连通到核酸扩增腔，相当于连通到入口流道。
邻近加样口的CRISPR检测腔和入口流道之间通过气体连通通道连通，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力实现，无需任何外界的泵、阀。
位于顶侧的CRISPR检测腔和入口流道之间连通的芯片内部的流道以斜向下、斜向上或者水平布置，这样使得后续操作CRISPR核酸检测时候能够不让CRISPR检测腔内的溶液流出。
位于芯片内的左侧或者右侧的CRISPR检测腔和入口流道位于芯片内的不同侧。
所述的CRISPR检测腔数量为一个，这种情况下只检测目的基因，不检测内参基因，所述的CRISPR检测腔位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧，所述的CRISPR检测腔内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂，用于检测目的基因，具体包括了目的基因特异性的crRNA和CRISPR检测相关试剂等，核酸扩增腔和加样口之间、核酸扩增腔和CRISPR检测腔之间、CRISPR检测腔和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，三个芯片内部的流道经核酸扩增腔和CRISPR检测腔依次连通一起构成一个近似环形循环通道。
具体实施中，所述的核酸扩增腔为竖直的、连接到加样口正下端、位于芯片左侧或者右侧的空腔：
若只需检测目的基因，则去掉内参基因CRISPR检测腔，只设置一个目的基因CRISPR检测腔。此CRISPR检测腔位于核酸扩增腔右侧，通过液体通道与核酸扩增腔下端连通，且CRISPR检测腔通过气体连通通道和核酸扩增腔上端口连通，腔内有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂。
当没有内参基因CRISPR检测腔时，目的基因CRISPR检测腔通过气体连通通道和核酸扩增腔的右上端连通，且连通点高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点，避免了液体流动惯性或加热体积膨胀导致溶液进入到核酸扩增腔。
所述的CRISPR检测腔(4、5)数量为两个：
一个CRISPR检测腔位于芯片内的左侧或者右侧且内置有预先包埋或冻干的CRISPR检测试剂，作为目的基因CRISPR检测腔用于检测目的基因，具体包括了目的基因特异性的crRNA和CRISPR检测相关试剂等；
另一个CRISPR检测腔位于芯片内的顶侧且内置有预先包埋或冻干的内参基因特异性的crRNA溶液或冻干试剂，作为内参基因CRISPR检测腔用于检测内参基因，具体仅包括了内参基因扩增片段所对应的crRNA溶液或冻干试剂；
核酸扩增腔和加样口之间、核酸扩增腔和左侧或者右侧的CRISPR检测腔之间、左侧或者右侧的CRISPR检测腔和顶侧的CRISPR检测腔之间、顶侧的CRISPR检测腔和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，四个芯片内部的流道经核酸扩增腔和CRISPR检测腔(4、5)依次连通一起构成一个近似环形循环通道。
具体实施中，所述的核酸扩增腔为竖直的、连接到加样口正下端、位于芯片左侧或者右侧的空腔：
如果需要检测目的基因和内参基因，则设置两个CRISPR检测腔(目的基因CRISPR检测腔和内参基因CRISPR检测腔)。目的基因CRISPR检测腔4位于核酸扩增腔3的右侧，通过液体通道7与核酸扩增腔3的下端连通，腔内有预先包埋或冻干的CRISPR检测试剂(包括buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针、目的基因特异性的crRNA1等)。
内参基因CRISPR检测腔5位于目的基因CRISPR检测腔的左上方，内参基因CRISPR检测腔5右端和目的基因CRISPR检测腔4的上端通过液体通道8连通，且内参基因CRISPR检测腔5通过斜向下的气体连通通道6与核酸扩增腔3中部的右端连通。腔内有预先包埋或冻干的内参基因特异性的crRNA2。
当设有内参基因CRISPR检测腔5时，内参基因CRISPR检测腔5通过斜向下的气体连通通道6和核酸扩增腔腔3的右侧连通，且连通点高于核酸扩增腔3中所盛样品液面的最高点。并且当目的基因检测结束后，将芯片的基准面垂直于地面顺时针旋转90°，连通点也高于内参基因CRISPR检测腔中所盛样品液面的最高点。当添加样本、旋转或加热等操作时，这样的设计避免了液体流动惯性或加热体积膨胀导致溶液进入到其他腔室的情况。
所述的核酸扩增腔、CRISPR检测腔外侧的芯片内部或者外部设有用于加热的温控装置。
所述核酸扩增腔、CRISPR检测腔的体积及腔内的试剂，可根据加样量进行调整。
二、CRISPR核酸检测芯片的第一种CRISPR核酸检测方法：
第一种检测方法是基于单重CRISPR的目的基因检测方法。
S1、原始状态下核酸扩增腔位于芯片的底部，在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，且仅在作为目的基因CRISPR检测腔的一个CRISPR检测腔中预先添加包埋或冻干的CRISPR检测试剂；
所述的CRISPR检测试剂包括buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针、目的基因特异性的crRNA1等。
S2、将待测样本溶液从核酸扩增腔上端的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔内和核酸扩增腔内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；
S3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得反应扩增液，以芯片的底面为基准面，将芯片的基准面垂直于地面翻转旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90°，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔右侧时顺时针旋转，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔左侧时逆时针旋转，使得作为目的基因CRISPR检测腔的CRISPR检测腔被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔内的反应扩增液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到CRISPR检测腔中和CRISPR检测腔内的CRISPR检测试剂混合进行特异性结合反应；
具体是在重力的作用下，核酸扩增腔中的溶液通过液体通道进入到目的基因CRISPR检测腔的底部，与用于目的基因检测的CRISPR/Cas反应试剂发生混合。
S4、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有目的基因。
若待测样本中含有目的基因，Cas蛋白在crRNA 1的引导下特异性地结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针被切割后产生荧光，检测结果为阳性；
反之，若待测样本中不含目的基因，Cas蛋白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针无法被切割，即无法产生荧光，检测结果为阴性。
因此，可根据此检测阶段CRISPR/Cas反应结束后的荧光信号情况判断待测样本中是否含有目的基因。
三、CRISPR核酸检测芯片的第二种CRISPR核酸检测方法：
第二种检测方法是基于双重CRISPR的目的基因和内参基因一体化集成检测方法。
S1、原始状态下核酸扩增腔位于芯片的底部，在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，在作为目的基因CRISPR检测腔的一个CRISPR检测腔中预先添加包埋或冻干的用于目的基因检测的CRISPR检测试剂，在作为内参基因CRISPR检测腔的另一个CRISPR检测腔中预先添加包埋或冻干的用于内参基因特异性检测的crRNA溶液；
所述的用于目的基因检测的CRISPR检测试剂包括buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针、目的基因特异性的crRNA1等。用于内参基因特异性检测的crRNA溶液具体为crRNA2。
经探究，目的基因CRISPR检测腔中目的基因特异性的crRNA1与内参基因CRISPR检测腔中内参基因特异性的crRNA2的比例对检测效果有一定的影响。当crRNA1的量一定时，crRNA1:crRNA2处于0.5:1-5:1之间，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度易于观察。其中，当crRNA1:crRNA2为1.5:1时，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度与目的基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度相当，最便于荧光的观察。
S2、将待测样本溶液从核酸扩增腔上端的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔内和核酸扩增腔内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；
S3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得反应扩增液，以芯片的底面为基准面，将芯片的基准面垂直于地面翻转旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90°，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔右侧时顺时针旋转，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔左侧时逆时针旋转，使得目的基因CRISPR检测腔被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔内的反应扩增液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到目的基因CRISPR检测腔中和目的基因CRISPR检测腔内的CRISPR检测试剂混合进行目的基因的CRISPR反应，且根据CRISPR反应的结果判断待测样本溶液中是否含有目的基因；
具体是在重力的作用下，核酸扩增腔中的溶液通过液体通道进入到目的基因CRISPR检测腔的底部，与用于目的基因检测的CRISPR/Cas反应试剂发生混合。
若待测样本中含有目的基因，Cas蛋白在crRNA 1的引导下特异性地结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针被切割后产生荧光；
反之，若待测样本中不含目的基因，Cas蛋白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针无法被切割，即无法产生荧光。
因此，然后可根据此检测阶段CRISPR反应结束后的荧光信号情况判断待测样本中是否含有目的基因，具体为：
若CRISPR反应结束后有荧光信号，则无需进入下一检测阶段(S4)就可证明待测样本中存在目的基因，检测结果为“阳性”；
若CRISPR反应结束后无荧光信号，则需要进入下一检测阶段(S4)，检测内参基因，从而进一步判断是Cas蛋白等试剂失效还是不存在目的基因导致的无荧光信号。
S4、在目的基因的CRISPR反应结束后，
若无产生荧光信号，将芯片的基准面垂直于地面翻转地继续旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90°，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔右侧时顺时针旋转，当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔左侧时逆时针旋转，使得内参基因CRISPR检测腔被旋转到芯片的底部，目的基因CRISPR检测腔内的剩余反应液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到内参基因CRISPR检测腔中和内参基因CRISPR检测腔内的crRNA溶液混合进行特异性结合反应；
S5、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否核酸扩增检测成功。
具体是在重力的作用下，目的基因CRISPR检测腔中的溶液通过液体通道进入到内参基因CRISPR检测腔的底部，与用于内参基因检测的crRNA 2发生混合。Cas蛋白在crRNA 2的引导下特异性地结合内源基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针被切割后产生荧光，则可证明待测样本中不存在目的基因，检测结果为“阴性”。
若此阶段的CRISPR反应也未产生荧光，则可证明此检测芯片中的核酸扩增试剂或Cas蛋白等试剂失效，检测失败。
本发明的有益效果是：
本发明的芯片及方法能够实现核酸扩增及其产物中目的基因和内参基因的一体化集成检测。为完成检测，使用者只需要进行三步简单的操作。第一是向核酸扩增腔的加样口中滴加一定量的待测样本；第二是待核酸扩增结束后，旋转芯片；第三是等目的基因的CRISPR反应结束后，再次旋转芯片即可。若不需要检测内参基因，则只需要进行前两步操作。
同时，在本发明的芯片中，加入样本后，只要利用盖子或胶带等将加样口密封，整个过程无需开盖、移液、手动混合；芯片内部和外界完全隔绝，扩增产物气溶胶不会污染周围环境。其次，整个芯片通过内部通道的设计，实现各个腔室气压的自动平衡，这样液体运动均可利用重力实现，无需任何外界的泵、阀。另外，由于CRISPR/Cas的旁路切割是一个酶促反应，具有信号放大作用，因此具有很高的检测灵敏度。同时，Cas蛋白是在crRNA的引导下对目标链进行识别，具有很好的特异性。本发明的芯片在这些方面具有明显的优势。
由于目的基因CRISPR检测腔中的反应液通过旋转流到内参基因CRISPR检测腔，目的基因CRISPR检测腔中的buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针等试剂在内参基因CRISPR检测腔中再次被利用，提高了试剂的利用率，减少了试剂的消耗，降低了检测成本。
此外，目的基因检测结束后，其体系中的Cas蛋白又转移到了内参基因检测体系中，即目的基因检测和内参基因检测所使用的Cas蛋白是一样的。当目的基因检测无荧光、内参基因检测有荧光时，即可确定是因为不存在目的基因而导致的目的基因检测无荧光，避免了两个含Cas蛋白的CRISPR检测体系阴性结果不确定的情况，提升了检测结果准确度。
和已有的方法相比，本发明的芯片和方法具有结构简单、操作方便、结果稳定、成本低、准确度高、灵敏度高和特异性高等优势。
附图说明
图1是本发明芯片的结构示意图。1、基准面，2、加样口，3、核酸扩增腔，4、目的基因CRISPR检测腔，5、内参基因CRISPR检测腔，6、气体连通通道，7、8、液体通道。
图2是本发明芯片的结构示意图，去除了内参基因CRISPR检测腔5和液体通道8，其余标记可参见图1。
图3是图1所示芯片中待测样本溶液受重力作用流动到核酸扩增腔后的状态示意图，深灰色部分是流到核酸扩增腔中的待测样本溶液。
图4是图3所示芯片顺时针旋转90°后，核酸扩增液受重力作用沿通道7中流动到目的基因CRISPR检测腔后的状态示意图，深灰色部分是流到目的基因CRISPR检测腔中的核酸扩增液。
图5是图4所示芯片顺时针旋转90°后，目的基因CRISPR反应液受重力作用沿通道8中流动到内参基因CRISPR检测腔后的状态示意图，深灰色部分是流到内参基因CRISPR检测腔中的目的基因CRISPR反应液。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
如图1所示，芯片内部包含三个相互独立的腔室，分别为核酸扩增腔3、目的基因CRISPR检测腔4和内参基因CRISPR检测腔5，以及将这些腔相连的通道6、7、8。核酸扩增腔3的上端有一个与外界连通的开口(加样口2)。目的基因CRISPR检测腔位于核酸扩增腔右侧，且其和核酸扩增腔的下端通过液体通道7连通。并且目的基因CRISPR检测腔高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点，这一设计可以避免检测步骤前的加样或加热等操作导致溶液进入后面所用的目的基因CRISPR检测腔。
为描述方便，可设想将芯片的基准面1垂直于地面顺时针旋转如90°，则内参基因CRISPR检测腔位于目的基因CRISPR检测腔右上方，且高于目的基因CRISPR检测腔中所盛样品液面的最高点。内参基因CRISPR检测腔和目的基因CRISPR检测腔上端通过液体通道8连通。再次将芯片的基准面1垂直于地面顺时针旋转如90°，内参基因CRISPR检测腔通过气体连通通道6和核酸扩增腔连通，且此时连通点高于内参基因CRISPR检测腔中所盛反应液面的最高点。
图1所示芯片中腔室位置的设计，避免了添加样本、旋转或加热等操作时，溶液进入到其余腔室中。具体而言，目的基因CRISPR检测腔的位置高于核酸扩增腔中所盛液体液面最高点，并有一定的距离；顺时针旋转90°后，内参基因CRISPR检测腔的位置高于目的基因CRISPR检测腔中所盛液体液面最高点，并有一定的距离；再次顺时针旋转90°后，气体连通通道与核酸扩增腔的连接点高于内参基因CRISPR检测腔中所盛液体液面最高点，并有一定的距离。当添加样本、旋转或加热等操作时，这样的设计避免了液体流动惯性或加热体积膨胀导致溶液进入到其他腔室的情况。图1所示芯片中，液体通道的拐角设计为圆润的弧形是便于液体在通道内流动；气体通道的拐角设计为折角是为了增加液体流动的阻碍，避免内参基因检测腔中的液体进入核酸扩增腔。
样本和试剂添加完之后，可以利用盖子或胶带等将加样口密封，从而使芯片成为一个密闭的***。同时，通道6、7和8将核酸扩增腔、目的基因CRISPR检测腔和内参基因CRISPR检测腔连接成一个连通的***，从而确保各个腔室的气压不会干扰芯片内液体的流动。
图3、图4和图5分别显示了液体受重力作用沿核酸扩增腔、通道7和通道8中流动后的状态。向核酸扩增腔上端的加样口加入待测样本溶液后，溶液受到重力的作用，顺着核酸扩增腔流动，直至通道7中水平通道两侧的液面持平，停止流动(如图3所示)。当核酸扩增反应结束后，将芯片的基准面1垂直于地面顺时针旋转90°，此时核酸扩增腔中的液面高于目的基因CRISPR检测腔。核酸扩增液受到重力的作用，顺着通道7向目的基因CRISPR检测腔中流动，直至目的基因CRISPR检测腔两侧通道内的液面持平，停止流动(如图4所示)。当目的基因检测结束后，将芯片的基准面1垂直于地面顺时针旋转90°，此时目的基因CRISPR检测腔的位置高于内参基因CRISPR检测腔。这时目的基因CRISPR检测腔中的液体受到重力的作用，顺着通道8向内参基因CRISPR检测腔中流动，直至内参基因CRISPR检测腔两侧通道内的液面持平，停止流动(如图5所示)。
如图2所示，该芯片在图1的基础上，去除了内参基因CRISPR检测腔，简化了芯片结构，适用于只需检测目的基因，无需检测内参基因的情况。芯片内部包含两个相互独立的腔室，分别为核酸扩增腔3和目的基因CRISPR检测腔4，以及将这些腔相连的通道6和7。核酸扩增腔的上端有一个与外界相通的开口(加样口2)。目的基因CRISPR检测腔位于核酸扩增腔右侧，且其与核酸扩增腔的下端通过液体通道7连通。并且目的基因CRISPR检测腔高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点，这一设计可以避免检测步骤前的加样或加热等操作导致的溶液进入后面所用的目的基因CRISPR检测腔。目的基因CRISPR检测腔通过气体连通通道和核酸扩增腔腔的右上端连通，且顺时针旋转90°后，连通点高于核酸扩增腔中中所盛样品液面的最高点。
图2所示芯片中腔室位置的设计避免了添加样本、旋转或加热等操作时，溶液进入到其余腔室中。具体而言，目的基因CRISPR检测腔的位置高于核酸扩增腔中所盛液体液面最高点一定的距离；顺时针旋转90°后，气体连通通道与核酸扩增腔的连接点高于目的基因CRISPR检测腔一定的距离。当添加样本、旋转或加热等操作时，这样的设计避免了液体流动惯性或加热体积膨胀导致溶液进入到其他腔室的情况。另外，待测样本添加完之后，可以利用盖子或胶带等将加样口密封，从而使芯片成为一个密闭的***。同时，通道6和7将核酸扩增腔和目的基因CRISPR检测腔连成一个连通的***，从而确保各个腔室的气压不会干扰芯片内液体的流动。
下面介绍本发明的具体检测实施过程：
1、扩增试剂、检测试剂及样本的设置与添加
在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂。在目的基因CRISPR检测腔中预先添加包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂(包括buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针、目的基因特异性的crRNA1等)。在内参基因CRISPR检测腔中预先添加包埋或冻干的内参基因特异性的crRNA 2。经探究，目的基因CRISPR检测腔中目的基因特异性的crRNA1与内参基因CRISPR检测腔中内参基因特异性的crRNA2的使用量比例对检测效果有一定的影响。当crRNA1的量一定时，crRNA1:crRNA2处于0.5:1-5:1之间，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度易于观察。其中，当crRNA1:crRNA2为1.5:1时，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度与目的基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度相当，最便于荧光的观察。若无需检测内参基因，可将内参基因CRISPR检测腔去除。
2、核酸扩增反应
待测样本溶液在重力的作用下流到核酸扩增腔。可利用外置的温控装置实现核酸扩增的温度控制。在核酸扩增腔内进行核酸扩增反应，获得核酸扩增液。
3、扩增产物中目的基因的CRISPR检测
扩增反应结束后，将芯片的基准面垂直于地面旋转一定角度，如90°，具体是当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔右侧时顺时针旋转；而当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔左侧时逆时针旋转。这时，在重力的作用下，核酸扩增腔中的溶液通过液体通道进入到目的基因CRISPR检测腔的底部，与用于目的基因检测的CRISPR反应试剂发生混合。若待测样本中含有目的基因，Cas蛋白在crRNA 1的引导下特异性地结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针被切割后产生荧光；反之，若待测样本中不含目的基因，Cas蛋白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针无法被切割，即无法产生荧光。如果要检测目的基因和内参基因，CRISPR反应结束后有荧光信号，即可证明待测样本中存在目的基因，检测结果为“阳性”；当CRISPR反应结束后无荧光信号，则需进入下一的内参基因检测阶段来确定是先前的扩增失败，或者Cas蛋白等试剂失效等原因，还是不存在目的基因导致的无荧光信号。
在有些检测中，对检测结果没有特别高的要求，不需要进行内参样本的检测。这样的情况下，如果只需检测目的基因，则可根据此检测阶段CRISPR反应结束后的荧光信号情况判断待测样本中是否含有目的基因。CRISPR反应结束后有荧光信号，即可证明待测样本中存在目的基因，检测结果为“阳性”；CRISPR反应结束后无荧光信号，即可证明待测样本中不存在目的基因，检测结果为“阴性”。
4、扩增产物中内参基因的CRISPR检测
在目的基因的CRISPR/Cas反应结束后，若是没有荧光，则需要进一步检测内参基因以避免由于检测试剂失效而造成的假阴性结果，则可以进一步将芯片的基准面1垂直于地面再旋转一定角度，如90°，具体是当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔右侧时顺时针旋转；而当目的基因CRISPR检测腔在核酸扩增腔左侧时逆时针旋转。这时，在重力的作用下，目的基因CRISPR检测腔中的溶液通过液体通道8进入到内参基因CRISPR检测腔的底部，与用于内参基因检测的crRNA 2发生混合。Cas蛋白在crRNA 2的引导下特异性地结合内参基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssDNA探针被切割后产生荧光，则可证明检测芯片有效，且在上一阶段的目的基因检测中是由于不存在目的基因导致的无荧光信号，检测结果为“阳性”。若此阶段的CRISPR反应也未产生荧光，说明此检测芯片中的核酸扩增试剂、Cas蛋白或其他试剂等失效，检测失败，将输出无效结果。
本发明的实施实例：
1、非洲猪瘟病毒的PCR扩增及双重CRISPR/Cas13a检测
该实施例所用芯片的结构如图1所示。芯片所使用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板材，板材的厚度为5毫米，利用机械加工的方式在板材的一面加工成图1所示的结构(尺寸以下面的文字说明为准)。
芯片内部包含一个核酸扩增腔3(上端有一个加样口2)、一个目的基因CRISPR检测腔4和一个内参基因CRISPR检测腔5以及将这些腔相连的通道6、7和8。目的基因CRISPR检测腔位于核酸扩增腔右侧，通过液体通道7与核酸扩增腔下端连通。内参基因CRISPR检测腔位于目的基因CRISPR检测腔的左上方，通过液体通道8与目的基因CRISPR检测腔连通，且通过气体连通通道6与核酸扩增腔右侧连通。
核酸扩增腔和目的基因CRISPR检测腔的深度均为2毫米。核酸扩增腔是宽度为4毫米，高度为40毫米的矩形。目的基因CRISPR检测腔是半径为5毫米的半圆。内参基因CRISPR检测腔是半径为5毫米的半圆。
液体通道7、8的截面尺寸为0.2x0.2毫米，长度及形状根据实际需要设置。液体通道的拐角设计为圆润的弧形是便于液体在通道内流动。
气体连通通道6的截面尺寸为0.2x0.2毫米，长度和形状根据实际需要确定，以确保连接内参基因CRISPR检测腔和核酸扩增腔。气体通道的拐角设计为折角是为了增加液体流动的阻碍，避免内参基因检测腔中的液体进入核酸扩增腔。
此芯片所设定的通道较窄，这样可以减小管道中液体的死体积，让尽可能多的液体留在腔室中进行反应。较窄的通道可能会影响液体在通道内的流动，这时，可以在待测样本溶液中添加表面活性剂，使液体在通道中的流动更为顺畅。
上述结构加工完毕后，可利用键合、粘结等技术和另一块PMMA板材粘结以构建完整腔室。
本实施例以非洲猪瘟病毒的检测为例，以非洲猪瘟病毒中的P72基因为靶标，进行PCR扩增及目的基因P72和内参基因β-actin的双重CRISPR/Cas13a检测。
将猪血经过核酸提取试剂盒提取得到的核酸溶液稀释至10拷贝/ul。此实施例的检测样本为上述稀释后的核酸溶液。在加样口中添加50微升待测样本。添加样本后，可用胶带封闭加样口，也可以用管帽等盖住，从而隔绝芯片内外的气、液交换，防止可能发生的气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，所配置的温控装置需要能够在50度到95度间进行温度循环。
PCR扩增反应的体系如下表：
反应组分 浓度
10x Taq buffer 1x
TaKaRa TaqTM HS DNA聚合酶 0.5U/μL
dNTP 1mM each
甜菜碱 0.8M
P72primer F/P72 primer R 1μM/1μM
扩增反应结束之后，将芯片的基准面1垂直于地面顺时针旋转一定角度，如90°，以通过重力，实现核酸扩增腔中核酸扩增液的流动，最终进入到目的基因CRISPR检测腔。由于Cas13a检测的是RNA，而非洲猪瘟病毒是DNA。因此，需要将DNA转录为RNA。此实施例将转录和CRISPR/Cas13a检测设置在同一个腔室中，具体体系见下。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
目的基因CRISPR/Cas13a检测体系如下：
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利用可视化荧光检测仪器观察荧光。若在目的基因CRISPR检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有P72基因，检测结果为阳性，即此猪血样本中含有非洲猪瘟病毒。若在目的基因CRISPR检测腔中未观察到荧光，则需要进入内参基因CRISPR检测腔继续进行检测。将芯片的基准面垂直于地面顺时针旋转一定角度，如90°，以通过重力，实现目的基因CRISPR检测腔中液体的流动。目的基因CRISPR检测腔中的reaction buffer、RNA酶抑制剂、Cas13a蛋白和DNA探针等试剂进入内参基因CRISPR检测腔，与腔内β-actin内参基因特异性的crRNA2混合，被再次利用。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
利用可视化荧光检测仪器观察荧光。若在内参基因CRISPR检测腔中观察到荧光，则证明了上阶段的目的基因检测是由于样本中不含P72基因导致的无荧光，检测结果为阴性，即此样本中不含非洲猪瘟病毒。若在内参基因CRISPR检测腔中也未观察到荧光，则表示此检测芯片中的核酸扩增试剂、Cas蛋白或其他试剂等失效，检测失败，输出无效结果。
上述PCR扩增反应试剂和CRISPR/Cas13a检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。
经探究，目的基因CRISPR检测腔中P72基因特异性的crRNA1与内参基因CRISPR检测腔中β-actin内参基因特异性的crRNA2的比例对检测效果有一定的影响。当crRNA1的量一定时，crRNA1:crRNA2处于0.5:1-5:1之间，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度易于观察。其中，当crRNA1:crRNA2为1.5:1时，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度与目的基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度相当，便于荧光的观察。
2、新型冠状病毒的RPA扩增及双重CRISPR/Cas12b检测
该实施例的结构如图1所示，芯片结构及加工方式同实施例1。
本实施例以新型冠状病毒的检测为例，以新型冠状病毒中的开放阅读框(ORF)基因为靶标，进行RPA扩增及目的基因ORF和内参基因人源核糖核酸酶(PNase P)的双重CRISPR/Cas12b检测。
由于新冠假病毒是RNA，而Cas12b所检测的是双链DNA，所以在检测之前需要进行逆转录(RT)。此实施例中使用一步法RT-RPA进行逆转录和RPA扩增，RT-RPA反应体系如下：
反应组分 浓度
含酶的buffer 1x
Super ScriptⅣ 20U
RT-RPA primer F/R 0.42μM/0.42μM
RNase H 1U
10拷贝/ul新冠假病毒 2ul
MgOAc 14mM
芯片中所添加的检测样本为ddH20和新冠假病毒RT-RPA后得到的扩增反应液，在加样口中添加50微升样本。添加样本后，可用胶带封闭加样口，也可以用管帽等盖住，从而隔绝芯片内外的气、液交换，防止可能发生的气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在42度左右，反应20分钟。
之后，将芯片的基准面垂直于地面顺时针旋转一定角度，如90°，以通过重力，实现核酸扩增腔中核酸扩增液的流动，最终进入到目的基因CRISPR检测腔。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
目的基因CRISPR/Cas12b检测体系如下：
反应组分 浓度
10x NEB buffer 1x
RNA酶抑制剂 4U/μL
Cas12b蛋白 1μM
DNA probe 10μM
ORF基因特异性的crRNA1 1μM
利用可视化荧光检测仪器观察荧光。若在目的基因CRISPR检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有ORF基因，检测结果为阳性，即检测样本为新冠假病毒。若在目的基因CRISPR检测腔中未观察到荧光，则需要进入内参基因CRISPR检测腔继续进行检测。将芯片的基准面垂直于地面顺时针旋转一定角度，如90°，以通过重力，实现目的基因CRISPR检测腔中液体的流动。目的基因CRISPR检测腔中的NEB buffer、RNA酶抑制剂、Cas12b蛋白和DNA探针等试剂进入内参基因CRISPR检测腔，与腔内PNase P内参基因特异性的crRNA2混合，被再次利用。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
利用可视化荧光检测仪器观察荧光。若在内参基因CRISPR检测腔中观察到荧光，则证明了上阶段的目的基因检测是由于样本中不含ORF基因导致的无荧光，检测结果为阴性，即此样本中不含有新冠病毒。若在内参基因CRISPR检测腔中也未观察到荧光，则表示此检测芯片中的核酸扩增试剂、Cas蛋白或其他试剂等，检测失败。
上述RT-RPA反应试剂和CRISPR/Cas12b检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。
经探究，目的基因CRISPR检测腔中ORF基因特异性的crRNA1与内参基因CRISPR检测腔中PNase P内参基因特异性的crRNA2的比例对检测效果有一定的影响。当crRNA1的量一定时，crRNA1:crRNA2处于0.5:1-5:1之间，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度易于观察。其中，当crRNA1:crRNA2为1.5:1时，内参基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度与目的基因CRISPR检测腔中的荧光信号强度相当，便于荧光的观察。
3、大肠杆菌的LAMP扩增及单重CRISPR/Cas12a检测
该实施例的结构如图2所示，是在实施例1所用芯片的基础上去掉了内参基因CRISPR检测腔和液体通道8。芯片内部包含一个核酸扩增腔3(上端含一个加样口2)和一个目的基因CRISPR检测腔4以及连通这些腔室的通道6和7。目的基因CRISPR检测腔位于核酸扩增腔右侧，通过液体通道7与核酸扩增腔下端连通，且通过气体连通通道6与核酸扩增腔右侧连通。各腔室尺寸及芯片加工方式同实施例1。
液体通道7的截面尺寸为0.2x0.2毫米，各通道长度及形状根据实际需要设置。
气体连通通道6的截面尺寸为0.2x0.2毫米，长度和形状根据实际需要确定。
本实施例以大肠杆菌的检测为例，以大肠杆菌中的毒力基因(escV)为靶标，进行LAMP扩增反应及单重CRISPR/Cas12a检测。
浓度为1000cfu/毫升的大肠杆菌用核酸提取试剂盒提取得到核酸溶液。此实施例所检测的样本为上述核酸溶液和ddH20。加样口中添加50微升待测样本。
添加样本后，可用胶带封闭加样口，也可以用管帽等盖住，从而隔绝芯片内外的气、液交换，防止可能发生的气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在65度左右，反应30分钟。
LAMP扩增反应的体系如下：
之后，将芯片的基准面垂直于地面顺时针旋转一定角度，如90°，以通过重力，实现核酸扩增腔中核酸扩增液的流动，最终进入到目的基因CRISPR检测腔。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
单重CRISPR/Cas12a检测体系如下：
反应组分 浓度
10x NEB buffer 1x
RNA酶抑制剂 4U/μL
Cas12a蛋白 1μM
DNA probe 10μM
escV基因特异性的crRNA 1μM
利用可视化荧光检测仪器观察检测荧光。若在目的基因CRISPR检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有escV基因，检测结果为阳性，即所测样本是大肠杆菌的核酸溶液；若在目的基因CRISPR检测腔中未观察到荧光，则检测结果为阴性，即所测样本不是大肠杆菌的核酸溶液。
上述LAMP扩增反应试剂和单重CRISPR/Cas12a检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。

Claims (10)

1.一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：
包括一个核酸扩增腔(3)，用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应，核酸扩增腔(3)内预先置有核酸扩增试剂；
包括一个加样口(2)，开设在核酸扩增腔(3)上方的芯片上表面且与外界相通；
包括一个或两个CRISPR检测腔(4/5)，用于核酸扩增产物检测，CRISPR检测腔(4)预先内置有目的基因CRISPR检测试剂；
核酸扩增腔(3)和加样口(2)之间、核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，所有芯片内部的流道构成一个环形循环通道。
2.根据权利要求1所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)位于芯片内的左侧、右侧或者底侧，CRISPR检测腔(4/5)位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧。
3.根据权利要求2所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：以核酸扩增腔(3)和加样口(2)之间所连通的芯片内部的流道作为入口流道，所述的CRISPR检测腔(4/5)经芯片内部的流道连通到入口流道中，不是直接连通到加样口，CRISPR检测腔(4/5)经芯片内部的流道连通到入口流道的连通点高于核酸扩增腔(3)中所盛样品液面的最高点。
4.根据权利要求2所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)为竖直的空腔，位于加样口(2)正下方的芯片左侧或者右侧且直接和加样口(2)连通。
5.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：位于顶侧的CRISPR检测腔(5)和入口流道之间连通的芯片内部的流道以斜向下、斜向上或者水平布置。
6.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的CRISPR检测腔(4)数量为一个，所述的CRISPR检测腔(4)位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧，所述的CRISPR检测腔(4)内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂，核酸扩增腔(3)和加样口之间、核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，三个芯片内部的流道连通一起构成一个环形循环通道。
7.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的CRISPR检测腔(4、5)数量为两个：
一个CRISPR检测腔(4)位于芯片内的左侧或者右侧且内置有CRISPR检测试剂，；
另一个CRISPR检测腔(5)位于芯片内的顶侧且内置有内参基因特异性的crRNA溶液或冻干试剂；
核酸扩增腔(3)和加样口之间、核酸扩增腔(3)和左侧或者右侧的CRISPR检测腔(4)之间、左侧或者右侧的CRISPR检测腔(4)和顶侧的CRISPR检测腔(5)之间、顶侧的CRISPR检测腔(5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，四个芯片内部的流道连通一起构成一个环形循环通道。
8.根据权利要求1所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)、CRISPR检测腔(4/5)外侧设有用于加热的温控装置。
9.应用于权利要求1-8任一所述CRISPR核酸检测芯片的CRISPR核酸检测方法，其特征在于：方法包括：
S1、在核酸扩增腔(3)中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，且仅在作为目的基因CRISPR检测腔的一个CRISPR检测腔(4)中预先添加包埋或冻干的CRISPR检测试剂；
S2、将待测样本溶液从核酸扩增腔(3)上端的加样口(2)加入，进而进入到核酸扩增腔(3)内和核酸扩增腔(3)内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应，加样后封闭加样口；
S3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔(3)内获得反应扩增液，将芯片的基准面(1)旋转固定角度，使得CRISPR检测腔(4)被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔(3)内的反应扩增液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到CRISPR检测腔(4)中和CRISPR检测腔(4)内的CRISPR检测试剂混合进行特异性结合反应；
S4、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有目的基因。
10.应用于权利要求1-8任一所述CRISPR核酸检测芯片的CRISPR核酸检测方法，其特征在于：方法包括：
S1、在核酸扩增腔(3)中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，在作为目的基因CRISPR检测腔的一个CRISPR检测腔(4)中预先添加包埋或冻干的用于目的基因检测的CRISPR检测试剂，在作为内参基因CRISPR检测腔的另一个CRISPR检测腔(5)中预先添加包埋或冻干的用于内参基因特异性检测的crRNA溶液；
S2、将待测样本溶液从核酸扩增腔(3)上端的加样口(2)加入，进而进入到核酸扩增腔(3)内和核酸扩增腔(3)内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应，加样后封闭加样口；
S3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔(3)内获得反应扩增液，将芯片旋转固定角度，使得目的基因CRISPR检测腔被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔(3)内的反应扩增液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到目的基因CRISPR检测腔中和目的基因CRISPR检测腔内的CRISPR检测试剂混合进行目的基因的CRISPR反应，且根据CRISPR反应的结果判断待测样本溶液中是否含有目的基因；
S4、在目的基因的CRISPR反应结束后，
若产生荧光信号，则可判断样本中含有目的基因。若未产生荧光信号，将芯片继续旋转固定角度，使得内参基因CRISPR检测腔被旋转到芯片的底部，目的基因CRISPR检测腔内的剩余反应液在重力的作用下经芯片内部的流道(8)流入到内参基因CRISPR检测腔中和内参基因CRISPR检测腔内的crRNA溶液混合进行特异性结合反应；
S5、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中不含目的基因或检测无效。
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