CN116514963A - 广谱识别黄病毒属病毒e蛋白的抗体fy2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及广谱识别黄病毒属病毒E蛋白的抗体FY2及其应用。所述抗体FY2包括具体如SEQ ID NO:1‑6所示的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。所述抗体FY2能特异性结合黄病毒属病毒E蛋白，起到诊断黄病毒属病毒E蛋白的作用。

Description

广谱识别黄病毒属病毒E蛋白的抗体FY2及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及广谱识别黄病毒属病毒E蛋白的抗体FY2及其应用。
背景技术
许多黄病毒是人类和动物的病原体，该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。黄热病、登革热及多种脑炎都是由黄病毒引起的人类传染病，它们曾多次发生大流行，现在仍严重地危害人类的健康
黄病毒属(Flavivirus)是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。黄病毒属病毒粒子为球形颗粒，直径40－50nm，有包膜和包膜突起。基因组编码3种结构蛋白：壳蛋白、前膜蛋白(precursor-membrane protein，prM)、包膜蛋白(envelope protein，E)；还编码7种非结构蛋白(non-structural protein，NS)：NS1、NS2A、NS2、NS3、NS4A、NS4B和NS5。病毒包膜内含有球形病毒核心，核心直径约30nm。病毒基因组为不分节段的正链单股RNA，分子大小为9.5－12.5kb，基因组RNA的5’端有1型帽子结构，即m7GpppAmp，3’末端没有poly(A)尾，但有一段十分保守的核苷酸序列，能够形成稳定的发夹结构，3’端的发夹结构可能与RNA复制时的核衣壳化有关。
黄病毒成熟后进入细胞质空泡，E蛋白通常被糖基化，分子量约50kDa，它含有12个保守的半胱氨酸残基，可形成6个二硫键。E蛋白是介导病毒感染和诱导中和抗体的关键蛋白。E蛋白在病毒附着至细胞、与内体区室融合以及调节宿主免疫应答中具有重要作用。
为此，本发明提供一种广谱识别黄病毒属病毒E蛋白的抗体，有助于诊断、防治由黄病毒感染所致的人类和动物疾患。
发明内容
本发明目的在于提供一种广谱识别黄病毒属病毒E蛋白的抗体FY2及其应用。具体地，本发明所提供的FY2抗体能广谱识别包括寨卡病毒、1型登革热病毒、2型登革热病毒和西尼罗河病毒在内的黄病毒属病毒。
第一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
所述重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
所述重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
优选地，所述抗体包括但不限于所述的抗体包括全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由所述的抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
优选地，所述抗体，其重链类型可以为IgG1、IgG2、IgG3或Ig4。
优选地，所述抗体，其轻链类型为κ或λ。
优选地，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
优选地，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
优选地，所述重链可变区和轻链可变区之间通过连接子连接。
优选的，所述抗体与黄病毒属病毒特异性结合。
具体地，本领域所熟知的连接子包括柔性连接肽(flexible linker)和刚性连接肽(rigid linker)。目前最主要的连接肽由Gly和Ser残基组成(“GS”linker)。其中使用最广泛的柔性连接肽的序列为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。通过调整n的数值，该GS连接肽的长度可以得到改变，从而可以最优地分离两个连接的蛋白，或使其可以相互作用。除了GS柔性连接肽以外，还有一些其它的柔性连接肽，如KESGSVSSEQLAQFRSLD，EGKSSGSGSESKST，(Gly)8，GSAGSAAGSGEF等。
本发明第二方面，提供了一种编码本发明第一方面的抗体的多核苷酸。
优选地，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体表达本发明第一方面的抗体或者含有本发明第二方面的多核苷酸。
具体地，本发明中“载体”、“表达载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面的抗体、含有本发明第二方面所述多核苷酸或含有本发明第三方面所述载体。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞。作为宿主细胞，可以例示出细菌细胞(例如埃希菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、枯草杆菌等)、真菌细胞(例如酵母、曲霉等)、昆虫细胞(例如S2细胞、Sf细胞等)、动物细胞(例如CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK293细胞等)、植物细胞等。大规模生产大多选择CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞等。
通过培养该宿主细胞，并从培养物中采集抗体，可以制造抗黄病毒属病毒E蛋白的抗体。由此，本发明还提供一种抗黄病毒属病毒E蛋白的抗体的生产方法，该生产方法包括培养前述宿主细胞、并从培养物中获得抗黄病毒属病毒E蛋白的抗体的操作；
或者，所述方法包括将载体导入宿主细胞、培养宿主细胞并从培养物中获得抗黄病毒属病毒E蛋白的抗体的操作。
优选地，所述将载体导入宿主细胞的操作可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
优选地，所述宿主细胞的培养基可以例示出OptiCHO培养基、Dynamis培养基、CDCHO培养基、ActiCHO培养基、FortiCHO培养基、Ex-Cell CD CHO培养基、BalanCD CHO培养基、ProCHO5培养基、Cellvento CHO-100培养基等。
优选地，所述从培养物中获得抗黄病毒属病毒E蛋白的抗体的操作可以通过本领域常用的方法实现，例如，常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明第六方面，本发明提供了一种缀合物和包含所述缀合物的试剂盒，所述缀合物是通过化学方法或者通过基因工程标记提供可检测的抗体。
在一种可行的实施例中，所述缀合物的剂型为液态或粉状(如水剂，针剂，冻干粉，片剂，含服剂，吸雾剂)。
在一种可行的实施例中，所述试剂盒中还含有检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
优选地，可检测的部分包括但不限于标签序列、酶、辅基、发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
本发明第七方面，提供了一种的检测黄病毒属病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
1)获取疑似含有黄病毒属病毒的样品；
2)将步骤(1)获取的样品与本发明的抗体接触；
3)检测样品与抗体的免疫反应。
在一种可选地实施例中，所述本发明的抗体是经过可检测标记物标记的。
优选地，所述方法是非诊断目的的。
在一种实施方式中，所述样品可以是环境样品，例如，空气、水体、土壤、养殖设备(培养环境)等。
在一种实施方式中，所述样品可以是来源于任何生物体的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，所述动物包括人或者非人的其他动物，具体可以例如传播黄病毒属的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等))。更具体地，所述动物样品包括可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液或皮肤或粘膜表面的拭子。
本发明第八方面，本发明提供了前述抗体、多核苷酸、多核苷酸、宿主细胞、缀合物和包含所述缀合物的试剂盒在制备检测产品中的应用，所述检测产品检测黄病毒属病毒。
具体地，如本领域所公知的，所述“黄病毒属”包括以下病毒：阿波依病毒Apoivirus、阿罗阿病毒Aroa virus(包括以下型：布苏夸拉病毒Bussuquara virus、伊瓜佩病毒Iguape virus、纳兰哈尔病毒Naranjal virus、巴加扎病毒Bagaza virus)班齐病毒Banzivirus、博博衣病毒Bouboui virus、布卡拉沙蝙蝠病毒Bukalasa bat virus、卡西帕科利病毒Cacipacore virus、凯里岛病毒Carey Island virus、细胞融合因子病毒Cell fusingagent virus、牛骨山脊病毒Cowbone Ridge virus、达卡尔蝙蝠病毒Dakar bat virus、登革热病毒Dengue virus(包括以下型：登革热病毒1型Dengue virus type 1、登革热病毒2型Dengue virus type 2、登革热病毒3型Dengue virus type 3、登革热病毒4型Denguevirus type 4)、边山病毒Edge Hill virus、恩德培蝙蝠病毒Entebbe bat virus(包括以下型：索科卢克病毒Sokoluk virus)、加德格兹谷病毒Gadgets Gully virus、伊列乌斯病毒Ilheus virus(包括以下型：罗西奥病毒Rocio virus)、以色列火鸡脑膜炎病毒Israelturkey meningoencephalomyelitis virus、日本脑炎病毒Japanese encephalitisvirus、朱格拉病毒Jugra virus、胡蒂亚帕病毒Jutiapa virus、卡达姆病毒Kadam virus、凯杜古病毒Kedougou virus、科科百拉病毒Kokobera virus(包括以下型：斯特拉特福病毒Stratford virus)、库坦戈病毒Koutango virus、科萨努森林病毒Kyasanur Forestdisease virus、兰加特病毒Langat virus、圣路易斯脑炎病毒Louis encephalitisvirus、绵羊跳跃病病毒Louping ill virus(包括以下型：绵羊跳跃病病毒Louping illvirus、绵羊跳跃病病毒英国亚型Louping ill virus British subtype、绵羊跳跃病病毒爱尔兰亚型Louping ill virus Irish subtype、绵羊跳跃病病毒西班牙亚型Louping illvirus Spanish subtype、绵羊跳跃病病毒土耳其亚型Louping ill virus Turkishsubtype)米班病毒Meaban virus、摩多克病毒Modoc virus、蒙大拿蝠白细胞脑炎病毒Montana myotis leukoencephalitis virus、墨雷谷脑炎病毒Murray Valleyencephalitis virus(包括以下型：阿尔弗病毒Alfuy virus)、恩塔亚病毒Ntaya virus、鄂木斯克出血热病毒Omsk hemorrhagic fever virus、金边蝙蝠病毒Phnom Penh bat virus(包括以下型：黑风洞病毒Batu Cave virus)、波瓦桑病毒Powassan virus、里约布拉沃病毒Rio Bravo virus、皇家农场病毒Royal Farm virus(包括以下型：喀什病毒Karshivirus)、萨沃亚病毒Saboya virus(包括以下型：波蒂斯库姆病毒Potiskum virus)、SaintLouis encephalitis virus、萨尔别霍病毒Sal Vieja virus、圣帕利塔病毒San Perlitavirus、索马里兹礁病毒Saumarez Reef virus、塞皮克病毒Sepik virus、塔马纳蝙蝠病毒Tamana bat virus、坦布苏病毒Tembusu virus、蜱传脑炎病毒Tick-borne encephalitisvirus(包括以下型：蜱传脑炎病毒欧洲型Tick-borne encephalitis virus Europeansubtype、蜱传脑炎病毒远东型Tick-borne encephalitis virus Far Eastern subtype、蜱传脑炎病毒西伯利亚型Tick-borne encephalitis virus Siberian subtype)、秋列尼病毒Tyuleniy virus、Uganda S virus、乌苏图病毒Usutu virus、韦塞尔斯布朗病毒Wesselsbron virus、西尼罗河病毒West Nile virus(包括以下型：库京病毒Kunjinvirus)、雅温德病毒Yaounde virus、黄热病毒Yellow fever virus、横须贺病毒Yokosevirus、寨卡病毒Zika virus(包括以下型：斯庞德温尼病毒Spondweni virus)。
具体地，本发明在具体实施例中示例性的证明了本发明抗体对寨卡病毒Zikavirus、登革热病毒1型Dengue virus type 1、登革热病毒2型Dengue virus type 2、西尼罗河病毒West Nile virus具有特异性结合活性，代表了本发明抗体对黄病毒属病毒的结合活性。更具体地，本发明所述黄病毒属病毒优选地是寨卡病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、西尼罗河病毒。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测本发明抗体的实验结果图。
图2是酶联免疫法检测本发明抗体与寨卡病毒E蛋白以及2型登革热病毒E蛋白特异性结合的实验结果图。
图3是流式细胞法检测本发明抗体与1型登革热病毒E蛋白特异性结合的实验结果图。
图4是流式细胞法检测本发明抗体与与西尼罗河病毒E蛋白特异性结合的实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、抗体的制备
1、实验步骤(1)本发明所提供抗体的重链可变区、轻链可变区序列的结构如表1、表2所示，利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列、轻链可变区序列，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入载体中。
表1、本发明所述抗体重链可变区的结构
表2、本发明所述抗体轻链可变区的结构
序列 位置 长度 SEQ ID NO
LFR1 QSVLTQPPSLSGTPGQRVTISC 1-22 22 -
CDR-L1 SGGSSNIGSNSVY 23-35 13 4
LFR2 WYQHPPGTAPKLLIF 36-50 15 -
CDR-L2 RNDQRPS 51-57 7 5
LFR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLRTEDEADYFC 58-89 32 -
CDR-L3 AVWDSTLNVWV 90-100 11 6
LFR4 FGGGTKLTVL 101-110 10 -
(2)将步骤1构建的抗体表达重组载体转染对数生长期的293T细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃8％ CO2培养箱中培养96小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE实验检验抗体的表达及纯化情况。
2、结果
结果见图1，证实得到较纯蛋白，并可清楚地观察到解链后的抗体轻、重链，说明抗体制备成功。
实施例2、ELISA检测抗体与寨卡病毒E蛋白以及2型登革热病毒E蛋白的结合活性
包被液稀释寨卡病毒E蛋白以及2型登革热病毒E蛋白至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体到不同浓度，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')2-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。
结果如图2所示，本发明制备的抗体够特异性识别固相载体上的寨卡病毒E蛋白以及2型登革热病毒E蛋白，且随着抗体浓度的增加抗原和抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。
实施例3、流式检测抗体FY2与西尼罗河病毒以及1型登革热病毒E蛋白的结合活性
按照Lipo3000转染试剂说明书，将西尼罗河病毒以及1型登革热病毒E蛋白表达质粒分别转染进BHK21细胞，48hr后收集细胞，室温20min固定后,利用细胞透化液清洗细胞3遍后，加入抗体FY2(5μg/mL)孵育，室温20min，细胞透化液清洗3遍后，加入二抗进行标记(anti-human IgG-FITC)，4℃避光孵育30min，细胞透化液清洗3遍后，重悬于1％的多聚甲醛，进行流式细胞检测。
检测结果如图3-4所示，图3是与1型登革热病毒E蛋白的结合结果，图4是与西尼罗河病毒E蛋白的结合结果。结果表明，本发明制备的抗体够特异性识别西尼罗河病毒以及1型登革热病毒E蛋白。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗体，所述抗体包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；
所述重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
所述重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
优选地，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
优选地，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包括但不限于所述的抗体包括全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由所述的抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间通过连接子连接；
优选地，所述连接子包括柔性连接肽和刚性连接肽。
4.一种编码权利要求1所述抗体的多核苷酸；
优选地，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
5.一种载体，所述载体表达权利要求1所述抗体或者含有权利要求2所述多核苷酸；
优选地，所述载体包括质粒、人工染色体、噬菌体及动物病毒；
优选地，所述含有以下任意一种或多种控制表达的元件：启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件、报告基因或复制起始位点。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达权利要求1所述抗体、含有权利要求4所述多核苷酸或含有权利要求5所述载体；
优选地，所述宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞；
优选地，所述动物细胞包括CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK293细胞。
7.一种缀合物或包含所述缀合物的试剂盒，所述缀合物是具有可检测部分标记的权利要求1所述的抗体；
优选地，所述可检测部分包括标签序列、酶、辅基、发光材料、放射性材料以及非放射性顺磁性金属离子。
8.一种抗体的生产方法，该生产方法包括培养权利要求6所述宿主细胞，并从培养物中获得抗体的操作；或者，
所述方法包括将权利要求4所述多核苷酸或含有权利要求5所述载体导入宿主细胞，培养宿主细胞并从培养物中获得抗体的操作；
优选地，所述导入的方法包括显微注射、电穿孔、脂质体包装、lipofectine转染、lipofectamin转染；
优选地，所述抗体与黄病毒属病毒特异性结合；
优选地，所述黄病毒属病毒是寨卡病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、西尼罗河病毒。
9.一种检测黄病毒属病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
1)获取疑似含有黄病毒属病毒的样品；
2)将步骤(1)获取的样品与本发明的抗体接触；
3)检测样品与权利要求1所述抗体的免疫反应；
优选地，所述抗体是具有可检测部分标记的权利要求1所述的抗体；
优选地，所述方法是非诊断目的的；
优选地，所述样品是环境样品；优选地，所述样品包括空气、水体、土壤、养殖设备；
优选地，所述样品包括固体或流体样品；
优选地，所述样品来源于动物；
优选地，所述来源于动物的样品包括血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液或皮肤或粘膜表面的拭子；
优选地，所述黄病毒属病毒是寨卡病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、西尼罗河病毒。
10.权利要求1所述抗体、权利要求4所述多核苷酸、含有权利要求5所述载体、权利要求6所述宿主细胞、权利要求7所述缀合物和包含权利要求7所述缀合物的试剂盒在制备检测黄病毒属病毒的产品中的应用；
优选地，所述黄病毒属病毒是寨卡病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、西尼罗河病毒。
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