CN111320688A

CN111320688A - 一种黄病毒中和抗体、其制备方法及应用

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Publication number: CN111320688A
Application number: CN201811542435.3A
Authority: CN
Inventors: 高福; 郭天玲; 校海霞; 黄超宾; 庞雪飞; 路希山; 孙中平; 廖国娟
Original assignee: Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN111320688B

Abstract

本发明涉及一种黄病毒中和抗体，所述抗体的轻链抗原互补决定区具有如SEQ ID NO.1‑3所示的氨基酸序列；所述抗体的重链抗原互补决定区具有如SEQ ID NO.4‑6所示的氨基酸序列。本发明所述抗体能够结合登革病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和黄热病毒颗粒表面的E蛋白；不仅如此，本发明所述抗体能够很好的中和黄病毒属的不同病毒，包括4个血清型的登革病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKV)和黄热病毒(YFV)，其是一种广谱中和抗体；所述抗体可作为诊断用抗体和治疗性抗体，具有重要的经济和社会意义。

Description

一种黄病毒中和抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黄病毒中和抗体、其制备方法和应用。

背景技术

黄病毒属(Flavivirus)是由多个黄病毒成员组成的，具有胞膜的单股正链RNA病毒。该病毒属的成员主要包括黄热病病毒(Yellow fever virus，YFV)、登革热(Denguevirus,DENV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、寨卡病毒(ZIKA virus,ZIKV)、蜱传脑炎(Tick-born encephalitis virus,TBEV)和日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)。

登革病毒(DENV)，由四个血清型组成，分别为登革1-4型(DENV1-DENV4)，主要是通过蚊虫传播。DENV引起的疾病范围从轻微的登革热到严重的登革出血热或者登革休克综合症。在登革病毒颗粒内部陈列着被衣壳蛋白包裹着11kb的单链正义RNA基因，这个RNA首先翻译成一条多聚蛋白，随后在病毒蛋白酶和宿主蛋白酶的作用下裂解为三个结构蛋白(C，prM/M，E)和7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。黄病毒颗粒内部核衣壳被脂质双分子膜包围着，在双层脂质膜外面是180个包膜蛋白(envelope，E)和膜蛋白(membrane，M)。E蛋白和M蛋白排列成二十面对称体单元。E蛋白胞外区由三个区域组成，分别为DI，DII，DIII。DI区是一个β桶状中心结构，是由八个β折叠形成，两个二硫键起维持结构域稳定的作用；DII区是一个延伸的指状结构，包含fusion loop区，可能与E蛋白二聚体的形成及膜融合过程有关；DIII区为免疫球蛋白样折叠，由羧基末端区形成且延伸至病毒表面，含有大量天冬氨酸及碱性氨基酸，此结构域可能为细胞受体的结合位点。

黄病毒的E蛋白胞外区的三个区域都可以作为中和抗体的靶标。根据已知的抗体与抗原E蛋白复合物结构以及抗体与病毒颗粒复合物结构，可以将黄病毒中和抗体分为4种主要的类型。第一种为DII区fusion loop表位(FLE)的抗体，一般FLE抗体识别的是保守的fusion loop区，所以该类型的抗体通常具有交叉保护作用，如鼠的单克隆抗体2A10G6能够广谱中和登革1-4型，WNVE，YFV，和ZIKA。另一个FLE抗体为E53，已解析的E53与WNVE E蛋白的复合物结构显示它是以一个倾斜的角度结合在fusion loop区。这两种FLE抗体都是特异性的结合在bc loop上。

第二种类型的抗体为DI区特异性的中和抗体，包括5H2及1F4。5H2与黄病毒E蛋白的晶体结构显示5H2的表位位于DI-DII的连接区上的DIβ折叠边缘的F0G0，包括F0G0H0链，他们之间连接的loop，以及I0链下游。它的中和机制被猜测因为结合在DI-DI的连接区从而阻断了E蛋白与受体表面的结合。而1F4结合的是DENV1病毒颗粒而不是E蛋白，电镜结构显示该抗体中和可能是由于结合引起的空间位阻阻断了N67位糖结合宿主受体DC-SICN，以及锁住DI-DI铰链区从而阻止了膜融合发生需要的E蛋白构象变化。

第三种类型的抗体是结合是E蛋白与细胞受体结合的区域DIII。如4E11，2H12，1A1D-2都是DENV交叉保护作用的抗体。其中4E11与1A1D-2共享重叠的抗原表位，但是1A1D-2不能中和DENV4是因为它与DENV4DIII之间展示了较低的电荷互补。另外两个抗体E111和E104登革特异型抗体，分别中和DENV1和DENV2。

第四种类型的抗体为结合在E蛋白二聚体(EDE)的抗体，众所周知，该类型的抗体通过结合在E蛋白二聚体上，从而锁住了融合前的结构，阻止了膜融合发生所必须的构象改变。四个晶体结构显示EDE抗体又可以分为EDE1(C8，C10)和EDE2(A11，B7)。EDE1抗体直结合N67糖基化位点，而EDE2抗体要求N67和N153糖基化位点都结合。值得注意的是，最近的研究中发现这四个抗登革的EDE抗体也能够中和ZIKA。

CN 106589116 A公开了一种黄病毒人源单克隆抗体及应用，其发现了三个新的抗体可以与ZIKV-E蛋白结合，并确定了其结合位点，且均有很强的寨卡病毒E蛋白结合能力。但继续寻找一种广谱性的、亲和力高的、特异性好的黄病毒中和抗体具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种黄病毒中和抗体、其制备方法及应用，所述黄病毒中和抗体为黄病毒的预防和治疗提供了新的治疗方法，为黄病毒感染诊断和黄病毒表面抗原E蛋白的检测提供新的选择，具有重要的经济和社会意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种黄病毒中和抗体，所述抗体的轻链抗原互补决定区具有如SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列；所述抗体的重链抗原互补决定区具有如SEQ IDNO.4-6所示的氨基酸序列。

所述轻链抗原互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1(SEQ ID NO.1)：SSNIGAGYD；

CDR2(SEQ ID NO.2)：GNN；

CDR3(SEQ ID NO.3)：QSYDSSLSGGV；

所述重链抗原互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1(SEQ ID NO.4)：GFTFSSQV；

CDR2(SEQ ID NO.5)：IHTGGSST；

CDR3(SEQ ID NO.6)：AKGSAYGDYVEY.

本发明中，发明人经过筛选，发现具有上述轻链和重链抗原决定区的抗体或抗原结合片段能够很好的中和黄病毒，能结合黄病毒的抗原E蛋白，从而抑制病毒的复制，对黄病毒具有治疗效果。

根据本发明，所述抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

所述抗体的轻链可变区(SEQ ID NO.7)的氨基酸序列如下：

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQPPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGGV；

所述抗体的重链可变区(SEQ ID NO.8)的氨基酸序列如下：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSQVMSWVRQAPGRGLEWVSVIHTGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVFLHMNSLRVEDTALYYCAKGSAYGDYVEY.

根据本发明，所述抗体为人源化的单克隆抗体。

根据本发明，所述黄病毒中和抗体的轻链的C端带有4-8个HIS标签，例如可以是4个、5个、6个、7个或8个，优选为6个HIS标签。

第二方面，本发明提供一种编码如第一方面所述黄病毒中和抗体的DNA片段。

根据本发明，所述抗体的轻链具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，所述抗体的重链具有SEQ ID NO.10的核苷酸序列。

所述抗体的轻链可变区(SEQ ID NO.9)的核苷酸序列如下：

Cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcaccgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtatcagcagcctccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacaacaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagcctgagtgggggggtgt；

所述抗体的重链可变区(SEQ ID NO.10)的核苷酸序列如下：

Gaggtgcagctgttggagtcggggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacgtttagcagccaagtcatgagctgggtccgccaggctccagggagggggctggagtgggtctcagttattcataccggtggaagtagtacatattatgctgactccgtgaagggccggttcaccatctccagagataattccaagaacacggtatttctgcatatgaacagcctgagagtcgaggacacggccctgtattactgtgcgaagggatcagcctacggtgactacgtggagtact.

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的黄病毒中和抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；

(2)扩增重链和轻链的高度可变区序列，根据CDR丰度进行挑选并合成；

(3)将合成的抗体片段构建到表达载体中。

根据本发明，步骤(3)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为pCAGGS哺乳动物表达载体。

第六方面，本发明提供如第一方面所述的黄病毒中和抗体，或如第二方面所述的黄病毒中和抗体的DNA片段，或如第三方面所述的表达载体，或如第四方面所述的宿主细胞在制备抑制流感病毒的药物和/或试剂中的应用。

根据本发明，所述黄病毒包括登革病毒(DENV)血清型、西尼罗河病毒(WNV)血清型、寨卡病毒(ZIKV)血清型或黄热病毒(YFV)血清型中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明提供如第一方面所述的黄病毒中和抗体在制备对黄病毒的E蛋白抗原具有亲和力和/或对黄病毒具有中和活性的药物和/或试剂中的应用。

本发明中，所述抗体结合在E蛋白融合环区或其周边区域，从而抑制病毒与细胞膜发生融合，从而抑制了病毒的复制。

优选地，所述黄病毒包括登革病毒(DENV)血清型、西尼罗河病毒(WNV)血清型、寨卡病毒(ZIKV)血清型或黄热病毒(YFV)血清型中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述抗体能够很好的中和黄病毒，且该抗体能结合黄病毒属中登革病毒，黄热病毒，寨卡病毒和西尼罗河病毒的抗原E蛋白，抑制了病毒与细胞膜发生融合，从而抑制了病毒在体内的复制；

(2)本发明所述抗体能够结合黄病毒，亲和力在0.13nM-0.85nM之间，中和黄病毒的中和能力在0.04-1.31μg/ml；

(3)本发明所述抗体的获得为黄病毒的预防和治疗提供了新的候选，具有重要的经济和社会意义。

附图说明

图1是本发明制备的抗体经HiloadTM 16/600 SuperdexTM 200pg分子筛层析纯化结果图；

图2为本发明的抗体能够中和黄病毒属中的登革病毒1-4型及西尼罗河病毒的结果图，其中，DENV1为登革病毒1，DENV2为登革病毒2，DENV3为登革病毒3，DENV4为登革病毒4，WNV为西尼罗河病毒；

图3为本发明中的抗体与已知抗原表位的抗体进行竞争性结合抗原表位的结果图，其中TIB12 TIB12+mab11表示TIB12为第一抗，TIB12+mab11为竞争抗体；buffer buffer+mab11表示buffer为第一抗，buffer+mab11为竞争抗体；mab11 mab11+TIB12表示mab11为第一抗体，mab11+TIB12为竞争抗体；buffer buffer+mab11表示buffer为第一抗，buffer+mab11为竞争抗体。

图4为本发明中的抗体对登革病毒1-4型的感染增强效应的结果图，其中，DENV1为登革病毒1，DENV2为登革病毒2，DENV3为登革病毒3，DENV4为登革病毒4。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

仪器：

Octet RED96仪器(ForteBio)

所述仪器主要是用光纤制成的生物芯片底面有生物分子相容层，用来于固定待分析的样品分子的固定相，形成生物膜层；当一定波长范围的可见光入射此生物膜层时，会发生光线的反射和折射现象，入射光线在生物膜层表面会分成两部分，其中一部分形成反射光，当入射光线在生物层的第二个界面同样地会发生发射，这样就又形成了一束反射光；光束是垂直入射时，两部分反射光叠加形成干涉波，可被光谱仪所检测；当分子间存在相互作用时，两部分的反射光形成的干涉曲线移向波长增加的方向，在分子结合或解离时干涉曲线就会发生变化。

实施例1抗体的制备和纯化

本实施例提供一种黄病毒中和抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；

(2)扩增出重链和轻链的高度可变区序列，将扩增的目的片段利用Miseq 2X300bp进行测序，并对测序结果进行分析；

(3)以CDR丰度为主要参数挑选感染患者的高频可变区序列，接着挑选出CDR1、CDR2和CDR3的高频出现的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列加上各自的恒定区及全抗所需的Fc进行全基因合成；

所述抗体的轻链可变区(SEQ ID NO.9)的核苷酸序列如下：

所述抗体的重链可变区(SEQ ID NO.10)的核苷酸序列如下：

Gaggtgcagctgttggagtcggggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacgtttagcagccaagtcatgagctgggtccgccaggctccagggagggggctggagtgggtctcagttattcataccggtggaagtagtacatattatgctgactccgtgaagggccggttcaccatctccagagataattccaagaacacggtatttctgcatatgaacagcctgagagtcgaggacacggccctgtattactgtgcgaagggatcagcctacggtgactacgtggagtact；

(4)以IgG的形式，在N端加入对应的重链和轻链的分泌信号肽后，将抗体片段构建到pCAGGS哺乳动物表达载体；

(5)将***重链和轻链序列的pCAGGS表达载体，通过PEI转染试剂共转染293T细胞进行大量表达，并进行纯化；

所述抗体的纯化方法，包括如下步骤：

(1’)在转染后96h后收获上清，6000rpm，离心30min，上清经过0.22μM的滤膜过滤，蠕动泵过夜将上清结合HisTrap^TMHP 5mL预装柱(Fab形式抗体纯化)或Protein A预装柱(IgG形式抗体纯化)；

(2’)AKTA机器上洗脱目的蛋白，具体条件为：缓冲液1(10mM Tris，40mM NaCl洗脱杂蛋白)，缓冲液2(10mM Tris，40mM NaCl，300mM咪唑)与缓冲液1使用AKTA机器上100％B泵30min的操作洗脱目的蛋白(若用Protein A预装柱则用20mM磷酸(pH 7.0)洗脱杂蛋白，0.1M的甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合在Protein A上面的IgG蛋白)；

(3’)洗脱出来的蛋白浓缩换缓冲液(PBS)后，经过Hiload^TM 16/600Superdex^TM200pg分子筛进一步纯化，纯化后的结果如图1所示，纯化后的抗体命名为TIB12。

从图1可以看出，通过纯化后可以得到单一的所要抗体的IgG形式。

实施例2抗原表达纯化

所述的黄病毒E蛋白抗原制备方法，包括如下步骤：

(1)包涵体的表达：将黄病毒科不同病毒，如登革热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和黄热病毒的表面抗原E蛋白的基因构建到PET21a载体上，而后转化BL21感受态细胞，挑LB固体培养基上长出来的单克隆至10ml液体LB(氨苄抗性)培养基中，200rpm，37℃过夜摇菌；第二天将10ml摇的菌转接到1L的LB(氨苄抗性)培养基中，200rpm，37℃摇4h，随后加入1M的IPTG1ml至终浓度为1mM，继续在200rpm，37℃摇4h，随后6000rpm，离心10min收菌；

(2)包涵体的提纯：将上述离心收集的菌体沉淀用20ml PBS重悬后使用高压破碎仪进行破碎，然后10000rpm，30min离心后弃上清，将底部包涵体沉淀上的细菌碎片剥掉，随后用20ml洗涤缓冲液(2％Triton X-100，50mM Tris pH 8.0，30mM NaCl，10mM EDTA，10mMDTT)将包涵体悬起，10000rpm，20min离心后继续用洗涤缓冲液洗一次，尽量剥去细菌碎片，随后用重悬缓冲液(50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)重悬，10000rpm，20min离心后弃上清，包涵体沉淀称重后，每30mg加入1ml溶解缓冲液(6M盐酸胍，10％甘油，100mM NaCl，50mM Tris pH 8.0，10mM EDTA，10mM DTT)4℃搅拌溶解，随后后10000rpm，30min离心去除杂质后，上清即为处理后的包涵体，置于-80℃备用；

(3)可溶性E蛋白的复性及纯化：将12ml的包涵体通过针头注射器滴加到2L的复性液(100mM Tris pH 8.0，400mM L-Arg HCl，2mM EDTA，5mM GSH，1mM GSSG)中，低速搅拌8h后再次滴加12ml的包涵体，过夜后通过浓缩杯浓缩至40ml左右，用20mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油进行20倍换液，浓缩至体积为2ml，Hiload^TM200分子筛纯化蛋白。

实施例3抗原抗体亲和力测试

本实施例提供一种抗原抗体亲和力的测试方法，具体使用Octet RED96仪器，整个实验操作使用PBST缓冲液，检测温度为30℃。

首先Protein A探针粘上25nM的实施例1制备的抗体中60s，随后PBST洗10s，接下来探针放置于梯度稀释的登革E蛋白抗原(200nM起始，稀释7个梯度)中300s结合后至于PBST缓冲液中500s解离，利用OCTET的分析软件计算出亲和力大小，结果如表1所示。

表1 TIB12抗体与不同E蛋白的亲和力测定

从表1可以看出，所述抗体TIB12与黄病毒属中的登革病毒、寨卡病毒、西尼罗河病毒和黄热病毒的结合解离模式几乎一致，都是慢结合慢解离的模式，亲和力大小在0.13nM-0.85nM之间。

实施例4抗体的中和实验

本实施例提供一种抗体中和实验的方法，具体如下：

(1)准备汇合度达到90％的24孔板Vero细胞后准备抗体和病毒混合液，将抗体从终浓度400μg/ml进行3倍倍比稀释(含1％FBS的DMEM作为稀释液)，而后加入等体积的定量(FACS检测阳性率在8％-20％)的登革病毒，将登革病毒与抗体混匀后置于37℃，作用1h；

(2)将抗体-病毒混合物按每孔300μl的量加入已经用PBS洗过两遍的24孔板Vero细胞中，每个抗体稀释度设置2个复孔，加入有抗体-病毒混合物的24孔板放入37℃，5％CO₂培养箱培养1h，期间每隔15min晃动一次，而后每孔直接加入700μl含10％FBS的DMEM培养基，48h后进行流式检测；

(3)流式检测：24孔板的细胞用PBS洗一遍后吸弃上清，加入胰酶(0.25％的终浓度)150μl，37℃，5％CO₂培养箱消化3min，随后加入100μl含10％FBS的PBS终止消化；接下来将24孔板中的细胞悬液转移到圆底96孔板中，4℃，500g水平离心10min；吸弃上清后用PBS(含1％FBS)清洗一遍，然后加入100μl固定液(BD Biosciences)，避光冰上放置20min，随后加入100μl洗涤缓冲液(BD Biosciences)，离心后加50μl一抗(能够结合登革E蛋白的抗体Z6，2μg/ml终浓度)冰上孵育30min，随后加入150μl洗涤缓冲液，离心后吸弃上清加入50μl山羊抗人的二抗(用洗涤缓冲液按1:200稀释)，随后加入150μl洗涤缓冲液，离心后用PBS洗一遍后加入180μl PBS吹打混匀后转移到Facs的流式管中，上机检测；

得到的结果先用flow.jo分析，然后利用Graphpad软件的Nonlinear regression方式算出IC50，结果如图2和表2所示。

表2 TIB12抗体与不同病毒的中和效果测定

从图2和表2可以看出，制备的TIB12能够中和黄病毒属中的登革病毒1-4型、西尼罗河病毒和黄热病毒，中和能力在0.04-1.31μg/ml之间。

实施例5抗体与已知抗原表位的抗体的竞争实验

本实施例提供一种抗体与已知抗原表位的抗体的竞争实验检测，使用的是OctetRED96仪器，具体包括如下步骤：

将Ni-NTA生物传感器置于200nM DV2E蛋白中持续300s从而将其固定在芯片表面，然后与第一抗体(200nM)接触约900s直至达到结合饱和，随后生物传感器直接接触第二个抗体300s，其中第二个抗体中存在第一个抗体(两个抗体的终浓度为200nM)，实时结合反应被Octet RED96仪器监测；

通过两次实验，第一次实验中第一抗体是本申请实施例1制备的TIB12抗体，第二抗体是mAb11抗体；第二次实验中第一抗体是mAb11抗体，第二抗体是本申请实施例1制备的TIB12抗体；比较结合曲线的变化判定两种抗体的抗原结合表位是否一致，结果如图3所示。

从图3可以看出本申请中的抗体TIB12抗体与mAb11抗体存在竞争结合关系，表明本申请抗体TIB12结合E蛋白的融合环(fusion loop)或者周边区域。

实施例6抗体针对登革病毒的感染增强效应(ADE)

本实施例提供一种抗体针对登革病毒的感染增强效应测试，具体如下：

(1)采用5倍倍比稀释所述抗体与不同表型的登革病毒(MOI 0.2-0.5)按每孔100μl的量加入96U型板，在37℃共孵育1h(稀释液为RPMI1640)，混合物中加入RPMI1640洗过一遍K562细胞(每孔5×104cells)，每个抗体稀释度设置2个复孔，加入有抗体-病毒-细胞混合物的96孔板放入37℃，5％CO₂培养箱培养2h；

(2)将RPMI1640清洗细胞一次，用100μl含2％FBS RPMI 1640重悬细胞，48h后进行流式检测，流式检测方法同实施例4，结果如图4所示；

从图4可以看出，本申请TIB12抗体对DENV1和DENV2有较弱的ADE效应，而对DENV3和DENV4的ADE作用较强一些。

综上所述，本发明所述抗体能够很好的中和黄病毒属中的登革病毒1-4型和西尼罗河病毒。能够抑制病毒发生膜融合，从而抑制病毒在体内的复制，所述抗体具有重要的经济和社会意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种黄病毒中和抗体、其制备方法及应用

<130> 2018

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Gly Asn Asn

1

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 3

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Gly Val

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Gln Val

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Ile His Thr Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Ala Lys Gly Ser Ala Tyr Gly Asp Tyr Val Glu Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 7

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Val

100

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Gln

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile His Thr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ser Ala Tyr Gly Asp Tyr Val Glu Tyr

100 105

<210> 9

<211> 304

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcaccg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcag 120

cctccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300

gtgt 304

<210> 10

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

gaggtgcagc tgttggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacgtttagc agccaagtca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaggg ggctggagtg ggtctcagtt attcataccg gtggaagtag tacatattat 180

gctgactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagata attccaagaa cacggtattt 240

ctgcatatga acagcctgag agtcgaggac acggccctgt attactgtgc gaagggatca 300

gcctacggtg actacgtgga gtact 325

Claims

1.一种黄病毒中和抗体，其特征在于，所述抗体的轻链抗原互补决定区具有如SEQ IDNO.1-3所示的氨基酸序列；所述抗体的重链抗原互补决定区具有如SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区具有如SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为人源化的单克隆抗体；

优选地，所述抗体的轻链的C端带有4-8个HIS标签，优选为6个HIS标签。

4.一种编码如权利要求1所述的黄病毒中和抗体的DNA片段。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种如权利要求1所述的黄病毒中和抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；

(3)将合成的抗体片段构建到表达载体中。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为pCAGGS哺乳动物表达载体。

9.如权利要求1-3中任一项所述的黄病毒中和抗体，如权利要求4所述的黄病毒中和抗体的DNA片段，如权利要求5所述的表达载体，或如权利要求6所述的宿主细胞在制备预防和治疗黄病毒的药物和/或试剂中的应用；

优选地，所述黄病毒包括登革病毒血清型、西尼罗河病毒血清型、寨卡病毒血清型或黄热病毒血清型中的任意一种或至少两种的组合。

10.如权利要求1-3中任一项所述的黄病毒中和抗体在制备对黄病毒的E蛋白抗原具有亲和力和/或对黄病毒具有中和活性的药物和/或试剂中的应用；