CN116510696A - 一种吸附血红蛋白的水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吸附血红蛋白的水凝胶及其制备方法，属于医药技术领域，本发明将氮化碳粉末、壳聚糖与卡拉胶复配，交联后形成能够高效吸附游离血红蛋白的水凝胶，从而有效避免了氮化碳粉末单独用于体外循环过滤装置时易泄漏于血液，易聚集和难回收的问题，大大提高了血液中游离血红蛋白的吸附效果。本发明吸附血红蛋白水凝胶能够实现对游离血红蛋白的高效吸附，同时具有良好的血液相容性与生物安全性，具有临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种吸附血红蛋白的水凝胶及其制备方法。
背景技术
血管搭桥手术是临床上心血管疾病较理想的治疗方法之一。但心脏手术血液体外循环过程中不可避免地导致红细胞机械性的破裂产生游离血红蛋白(Hb)，血液中游离血红蛋白含量的异常增高是蚕豆黄、血红蛋白尿症的重要指标，在正常情况下，血红蛋白绝大多数是通过肾排出体外，当超过阈值时，可引起急性肾功能损伤，会对肾脏造成一定的毒性。术中患者临床上有几种干预措施可用于治疗Hb含量升高，包括药物治疗和辅助治疗，其目的是降低患者的Hb水平并防止疾病的形成。但是许多此类治疗不令人满意，尤其是对于老弱患者来讲，由于机体代谢功能下降或不全，药物的副作用在体内蓄积，造成患者不良反应，增加患者痛苦。此外，辅助治疗存在着明显的不足，例如，长期吸氧也受其它因素的干扰，同样也给患者带来经济上的负担。因此，在血液循环过程中采用吸附剂吸附血红蛋白这一治疗手段具有巨大前景。
石墨型氮化碳(g-C3N4)具有电子结构优异，高比表面积、大孔体积和化学惰性。其在样品的预处理层面，对金属离子的移除和芳香族化合物的吸附，都有着很高的性能。在生物样品的富集方面，经过研究石墨型氮化碳材料在特定的情况下可以分离纯化血红蛋白，血红蛋白与石墨型氮化碳材料主要通过氢键作用力和疏水作用力进行相互作用。然而，氮化碳具有的微/纳米结构和形态，作为血液循环过程中的吸附剂，g-C3N4的生物安全性是一个需要解决的问题，将粉末g-C3N4应用于血液循环时，具有易聚集、难回收，不可避免地泄漏于血液中，影响在临床上的使用。壳聚糖(CS)是一种生物相容良好的天然高分子材料，壳聚糖与血红蛋白具有疏水结合性能。然而，用于去除血红蛋白的CS吸附剂的主要问题是其吸附能力低和机械强度差，限制其应用。卡拉胶(k-Car)是一种天然线性水溶性硫酸盐多糖，还能与壳聚糖形成凝胶珠，增强凝胶的稳定性以及弹性。k-Car因其具有一定的吸附能力，与血红蛋白间主要存在静电吸引力较弱，吸附能力仍然非常有限。为此，本发明提供一种吸附血红蛋白的水凝胶及其制备方法。
发明内容
本发明提供了一种吸附血红蛋白的水凝胶及其制备方法，有效解决了氮化碳粉末单独用于体外循环过滤装置时易泄漏于血液，易聚集，难回收；壳聚糖和卡拉胶对血红蛋白吸附能力弱的技术问题，同时构建了一种对血液中游离血红蛋白吸附能力强、方便回收且生物安全性好的水凝胶。
本发明提供了一种吸附血红蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；
S2，室温下，将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
优选的，S1中，所述乙酸溶液中乙酸的质量百分比为2％。
优选的，S1中，所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL。
优选的，S1中，所述卡拉胶氮化碳混合液中，氮化碳的质量百分比为0.2％～0.4％。
优选的，S1中，所述卡拉胶氮化碳混合液中卡拉胶的质量浓度为20mg/mL。
优选的，S2中，所述卡拉胶氮化碳混合液与氯化钙与壳聚糖的混合溶液的用量比为1:2。
优选的，S2中，所述交联的时间为20～30min。
优选的，S3中，所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻2～6h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6～8h。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的吸附血红蛋白的水凝胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种吸附血红蛋白水凝胶及其制备方法，本发明将氮化碳粉末、壳聚糖与卡拉胶复配，交联后形成能够高效吸附游离血红蛋白的水凝胶，从而有效避免了氮化碳粉末在血液中泄漏，易聚集，难回收的问题，大大提高了血液中游离血红蛋白的吸附效果。本发明实施例2制备的吸附血红蛋白的水凝胶，其在120min时对血红蛋白的吸附量高达178.82mg/g；实施例1和实施例2制备的吸附血红蛋白的水凝胶的活化部分凝血活酶时间及血浆凝血酶时间与Control组和对比例1(壳聚糖/卡拉胶水凝胶)无显著差异；将实施例1、实施例2和对比例1制备的水凝胶分别加入等量的红细胞悬液中，实施例1的溶血率仅为1.721％，三种水凝胶使得溶血率均未超过5％。综上，本发明吸附血红蛋白水凝胶能够实现对游离血红蛋白的高效吸附，同时具有良好的血液相容性与生物安全性，具有临床应用潜力。
附图说明
图1为本发明吸附血红蛋白的水凝胶的扫描电镜图；其中，A图为对比例1壳聚糖/卡拉胶水凝胶(CS/K-car)；B图为实施例1制备的吸附血红蛋白的水凝胶(CS/K-car/C3N4-0.2％)；C图为实施例2制备的吸附血红蛋白的水凝胶(CS/K-car/C3N4-0.4％)；D图为实施例2吸附血红蛋白的水凝胶的宏观图；E图为对比例1、实施例1和实施例2水凝胶的直径尺寸图；
图2为本发明对比例1(CS/K-car)、实施例1(CS/K-car/C3N4-0.2％)和实施例2(CS/K-car/C3N4-0.4％)的吸附血红蛋白的水凝胶的吸附效率对比图；
图3为本发明Control组、对比例1(CS/K-car)、实施例1(CS/K-car/C3N4-0.2％)和实施例2(CS/K-car/C3N4-0.4％)的水凝胶的活化部分凝血活酶时间对比图；
图4为本发明Control组、对比例1(CS/K-car)、实施例1(CS/K-car/C3N4-0.2％)和实施例2(CS/K-car/C3N4-0.4％)的水凝胶的血浆凝血酶时间对比图；
图5为本发明阳性对照组(+，无菌蒸馏水)、阴性对照组(-，生理盐水)对比例1(CS/K-car)、实施例1(CS/K-car/C3N4-0.2％)和实施例2(CS/K-car/C3N4-0.4％)的水凝胶置于等量红细胞悬液中溶血率对比图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述试验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。
实施例1(CS/K-car/C3N4-0.2％)
一种吸附血红蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；上述混合液中氮化碳的质量百分比为0.2％，卡拉胶的质量浓度为20mg/mL；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联20min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻2h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6h。
实施例2(CS/K-car/C3N4-0.4％)
一种吸附血红蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；上述混合液中氮化碳的质量百分比为0.4％，卡拉胶的质量浓度为20mg/mL；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联20min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻2h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6h。
实施例3
一种吸附血红蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；上述混合液中氮化碳的质量百分比为0.3％，卡拉胶的质量浓度为20mg/mL；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联30min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻6h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥8h。
实施例4
一种吸附血红蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；上述混合液中氮化碳的质量百分比为0.25％，卡拉胶的质量浓度为20mg/mL；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联22min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻4h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6.5h。
实施例5
一种吸附血红蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；上述混合液中氮化碳的质量百分比为0.35％，卡拉胶的质量浓度为20mg/mL；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联28min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻5h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥7.5h。
为了进一步说明本发明的技术效果，本发明还设置了对比例，如下：
对比例1(CS/K-car)
一种吸附血红蛋白的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于质量百分比为2％的乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；上述混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
制备得到质量浓度为20mg/mL的卡拉胶溶液；
S2，室温下，按照1:2的质量比将S1的卡拉胶溶液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联20min，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
所述冷冻干燥的程序为：所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻2h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6h。
一、本发明吸附血红蛋白的水凝胶的形貌特征
上述实施例1～5制备得到的吸附血红蛋白的水凝胶的技术效果近似，本发明仅以实施例1和实施例2为例，其制备得到的吸附血红蛋白的水凝胶与对比例1的壳聚糖/卡拉胶水凝胶的扫描电镜图如图1所示。
由图1可知，由图1中的A图可以看出对比例1中干燥的CS/K-Car具有颗粒且不平整，图1中的B图和C图可以看出加入氮化碳的复合水凝胶表面较为光滑，质地均匀。
二、本发明吸附血红蛋白的水凝胶的吸附性能试验
大鼠心脏取血2mL，800rpm转速离心5分钟，弃上清液，收集红细胞，使用稀释的磷酸盐缓冲溶液(PBS)混悬红细胞，震荡使红细胞破碎释放血红蛋白，13000rpm转速离心5min获得血红蛋白上清液。分别取5mg对比例1(CS/K-Car)、实施例1(CS/K-Car/C3N4-0.2％)、实施例2(CS/K-Car/C3N4-0.4％)的水凝胶吸附剂置入离心管分别加入2mL血红蛋白上清液，37℃下摇床震荡吸附，在不同时间段定期离心悬浮液，溶液上清液中的浓度使用酶标仪测量，Hb在540nm处测量吸光度，Hb的吸附量(mg/g)由质量平衡方程计算不同水凝胶对血红蛋白的吸附容量，如图2所示。根据公式计算出复合水凝胶对的血红蛋白的吸附容量，由下面公式计算：
qt＝[(C0-C1)×V]/m
其中，C0为吸附前样品溶液中血红蛋白的浓度；C1为不同时间段吸附后样品上清液中血红蛋白的浓度；V为加入溶液的体积(L)；m为水凝胶的重量。
由图2可知，对比例1的CS/K-car、实施例1的CS/K-car/C3N4-0.2％、实施例2的CS/K-car/C3N4-0.4％在120min时达吸附平衡，对血红蛋白的吸附量分别为120.60mg/g、150.39mg/g、178.82mg/g。由此可见，实施例1和2中加入氮化碳的水凝胶较对比例1未加入氮化碳的水凝胶对血红蛋白的吸附容量更高。
三、血液相容性试验
(1)活化部分凝血活酶时间(APTT)和血浆凝血酶时间(TT)试验
分别取对比例1、实施例1、实施例2三种水凝胶材料5mg，置于1mL贫血小板血浆37℃孵育1h，以无标本的空白组织培养板(TCP)作为对照组(Control组)，使用凝血分析***进行APTT和TT试验，其结果如图3和图4所示。
由图3和图4可知，对比例1的CS/K-Car、实施例1的CS/K-Car/C3N4-0.2％、实施例2的CS/K-Car/C3N4-0.4％的活化部分凝血活酶时间(APTT)分别为25.33s、25.83s、25.52s，血浆凝血酶时间(TT)分别为16.47s、16.51s、16.40s。与control组相比较，水凝胶不会引起活化部分凝血活酶时间(APTT)和血浆凝血酶时间(TT)的较大变化，血液相容性好。
(2)溶血率
用采血针从SD大鼠心脏采集血液，注入含肝素的离心管中，离心管5000rpm离心8min，弃上清，然后将生理盐水和沉淀的红细胞稀释成适当浓度的红细胞悬液，同时将对比例1、实施例1、实施例2三种水凝胶材料取5mg，分别加入制备的红细胞悬液2mL。阳性对照组(+)加无菌蒸馏水2mL，阴性对照组(-)加生理盐水2mL。同时，所有试管均在37℃下水浴锅中孵育2h。待测样品依次在转速为2000转/分下离心10min，取上清液添加置于96孔板中，使用酶标仪在540nm处检测吸光度值。溶血率(HR)计算如下:
A0表示实验组吸光度；A1为阳性对照组的吸光度；A2为阴性对照组的吸光度，每组计算3次得到HR值，结果如图5所示。
由图5可知，对比例1的CS/K-Car、实施例1的CS/K-Car/C3N4-0.2％、实施例2的CS/K-Car/C3N4-0.4％的溶血率分别为1.78％、1.62％、1.72％。由此可知氮化碳的加入以及含量的增加不会造成溶血率的上升。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种吸附血红蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，形成壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液中加入氯化钙，混匀，得到氯化钙与壳聚糖的混合溶液；
将氮化碳粉末于蒸馏水中超声分散，得到氮化碳溶液，向所述氮化碳溶液中加入卡拉胶，混匀，得到卡拉胶氮化碳混合液；
S2，室温下，将S1的卡拉胶氮化碳混合液滴加至所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液，形成凝胶珠，交联，洗涤，得到湿样水凝胶；
S3，将S2所述的湿样水凝胶冷冻干燥，即得吸附血红蛋白的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述乙酸溶液中乙酸的质量百分比为2％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述氯化钙与壳聚糖的混合溶液中，氯化钙的物质的量浓度为0.1mol/L，壳聚糖的质量浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述卡拉胶氮化碳混合液中，氮化碳的质量百分比为0.2％～0.4％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述卡拉胶氮化碳混合液中卡拉胶的质量浓度为20mg/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述卡拉胶氮化碳混合液与氯化钙与壳聚糖的混合溶液的用量比为1:2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述交联的时间为20～30min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，所述冷冻干燥的程序为：将S2的湿样水凝胶于离心管中，-20℃冷冻2～6h，将冷冻的离心管口用封口膜包裹，封口膜扎口，放入冷冻干燥机中干燥6～8h。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的吸附血红蛋白的水凝胶。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |