CN116496871A - 一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片 - Google Patents

一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，属于微流控芯片技术及生物医学检测领域。所述的***包括微流控芯片和检测溶液。所述的微流控芯片包含进样流道、平行主流道、单细胞检测功能单元和出样流道。其中，所述的单细胞检测功能单元包含用于单细胞锚定的钩状结构和用于单细胞代谢物收集的检测微腔室。所述的检测溶液包含对目标检测物特异性催化的载酶金属有机框架和荧光探针。本发明的微流控芯片可将单细胞捕获、单细胞培养和单细胞检测操作集成在同一芯片上完成，可大规模高效地建立无交叉污染的单细胞微环境，进而实现单细胞内和单细胞外代谢物分子的可视化检测，可用于单细胞代谢异质性分析和肿瘤细胞恶性程度评估。

Description

一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片
技术领域
本发明涉及微流控技术和生物医学检测领域，具体涉及一种微流控芯片***用于单细胞代谢物的检测方法。
背景技术
迄今为止，细胞基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学已经深入到单细胞水平，进而加深了对功能异质性的理解。然而，大多数单细胞分析技术都是破坏性的，使得实时跟踪监测细胞代谢动态存在巨大挑战。作为一个新兴的领域，单细胞代谢物分析能够动态监测细胞的生理状况，对异质性活细胞的检测，特别是对缺乏生物标志物细胞的非破坏性筛选铺平了道路。因此，在单细胞层面对代谢物分子的实时检测技术有望完成特定生物样本中罕见细胞的识别，对于疾病的早筛、诊断和预后具有重大意义。
实现临床样本中单细胞代谢物的检测主要面临以下两项艰巨任务，即单细胞微环境的高效构建和目标代谢物的灵敏检测。微流体技术因其独特的优势，如通量高、体积小、集成度高和操作便携，在单细胞分析中引起了广泛的关注。常用的单细胞微流控方法主要有主动微流控、微阱阵列、液滴微流控和微坝阵列，其中后两种方法常常用于单细胞的分离。虽然液滴微流控技术允许极高通量的单细胞封装，但单细胞液滴的比例遵循泊松分布，极易产生大量的空液滴和多细胞液滴，增加了分析的复杂性。使用水动力学的微坝阵列虽然表现出非常高的单细胞捕获率，但是由于交叉污染的瓶颈问题，很难应用于细胞分泌物的研究。另一个问题是由于目标代谢物的浓度低，导致检测的灵敏度和特异性不高。目前最流行的单细胞代谢物检测策略是质谱法，然而，它是破坏性的，难以实现芯片上细胞代谢的长期监测。酶催化不仅允许高度特异性的生物分子检测，而且允许信号转换和放大，可以满足各种细胞代谢物的精确检测和代谢状态的动态监测。然而，直接使用外源性酶进行细胞代谢物检测仍然面临诸多挑战，因为它们难以进入细胞内部并且在恶劣环境中会严重失活。因此，人们开发了许多策略来克服这些问题，其中金属有机框架因其高孔隙率、热稳定性和易于制备的特点，已被广泛应用于天然酶的保护和递送。
发明内容
针对现有方法的缺点和不足，本发明的主要目的在于提供一种可对单细胞内和单细胞外代谢物进行大规模无损检测的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，所述的微流控芯片由基底和流道层键合而成，所述的流道层上设置有进样流道、分叉流道、平行主流道、单细胞检测功能单元和出样流道，进样流道和出样流道分别与分叉流道相连通，分叉流道通过1分2，2分4，4分8，8分16，16分32，最终分成32条流阻相同的流道。
分叉流道最终形成的32条流道与完全相同的32条平行主流道相连，每条平行主流道两侧交错分布着320个单细胞检测功能单元，出样流道与进样流道对称设置。
进一步地，所述的进样流道为车轮辐射形状，用于分隔大的细胞簇，避免微流控通道堵塞。
进一步地，所述的分叉流道为多级分流结构，且最终每个支流道流阻相同，避免流体倾向性选择某个流阻较小的流道。
更进一步地，所述的平行主流道的宽度为目标捕获细胞直径的2倍，共有32条平行主流道，所述的平行主流道的宽度为30-40μm，高度为目标捕获细胞直径，所述的平行主流道的高度为15-20μm。
进一步地，所述的单细胞检测功能单元包括一个钩状捕获结构和一个代谢物检测腔室，检测腔室的长为50μm、宽为50μm，高为15-20μm。
进一步地，所述的出样流道为车轮辐射形状，同样可通过真空负压实现待测细胞悬浮液的进样；所述的芯片由基底层和流道层键合而成，所述的流道层材料为聚二甲基硅氧烷，所述的基底层材料为二氧化硅、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。
本发明的一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：
(1)将检测溶液从进样流道泵入芯片，同时堵住出样流道，利用PDMS材料的透气性，使得检测溶液填充满微流控芯片的全部代谢物检测腔室；
(2)取待测细胞悬浮液，按照15μL/min的流量从进样流道泵入芯片，细胞被钩状捕获结构捕获成单细胞状态；
(3)按10μL/min的流量从进样通道泵入与水相不相容的氟化液，将未捕获的细胞由出样流道排出芯片，并完成对单细胞微环境的密封；
(4)在37℃下孵育15分钟，用荧光显微镜对待检测微流控芯片进行拍照，并采用图片处理程序对单细胞内或单细胞对应的检测腔室的荧光强度进行分析，完成细胞内外代谢物浓度的检测。
进一步地，所述的检测溶液为载酶金属有机框架和荧光探针的混合溶液；所述的载酶金属有机框架通过将酶溶液、2-甲基咪唑溶液和醋酸锌溶液在室温下反应30分钟来制备。
进一步地，所述的载酶金属有机框架所选用的酶为针对目标代谢分子具有特异性催化作用的酶，包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和辣根过氧化物酶等；选用的荧光探针为可以与过氧化氢反应而发出荧光的染料，包括Amplex Red和DCFH-DA等。
本发明的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法中制备的检测溶液。
本发明所述的微流控芯片***在单细胞分析中的应用。
有益效果：本发明的微流控芯片可将单细胞捕获、单细胞培养和单细胞检测操作集成在同一芯片上完成，可大规模高效地建立无交叉污染的单细胞微环境，进而实现单细胞内和单细胞外代谢物分子的可视化检测，可用于单细胞代谢异质性分析和肿瘤细胞恶性程度评估。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
具有高通量分析能力，可进行10,240个单细胞的同时分析；具备高密度分析单元，每平方毫米含有100个单细胞分析单元；具有高效的单细胞分离效率，单细胞捕获效率可达99％以上；可进行芯片上细胞的长期培养；可以无损检测细胞内和细胞外特定代谢物。
附图说明
图1为本发明实施例的微流控芯片***结构示意图；
图2为本发明实施例的微流控芯片结构设计图；
图3为本发明实施例的操作流程图；
图4为本发明实施例的单细胞捕获效率图；其中图(a)为不同流速下的单细胞捕获效率，图(b)为不同浓度下的单细胞捕获效率。
图5为本发明实施例的探针溶液制备示意图；
图6为本发明实施例的单细胞内葡萄糖检测示意图；
图7为本发明实施例的单细胞外乳酸检测示意图。
图8为本发明实施例的荧光探针反应示意图。
附图标记说明：1、进样流道；2、分叉流道；3、平行主流道；4、单细胞检测功能单元；5、出样流道；6、基底。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
如图1至图8所示，本发明的一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，所述的微流控芯片由基底6和流道层键合而成，所述的流道层上设置有进样流道1、分叉流道2、平行主流道3、单细胞检测功能单元4和出样流道5，进样流道1和出样流道5分别与分叉流道2相连通，分叉流道2通过1分2，2分4，4分8，8分16，16分32，最终分成32条流阻相同的流道。
分叉流道2最终形成的32条流道与完全相同的32条平行主流道3相连，每条平行主流道3两侧交错分布着320个单细胞检测功能单元4，出样流道5与进样流道1对称设置。
所述的进样流道1为车轮辐射形状，用于分隔大的细胞簇，避免微流控通道堵塞。
所述的分叉流道2为多级分流结构，且最终每个支流道流阻相同，避免流体倾向性选择某个流阻较小的流道。
所述的平行主流道3的宽度为目标捕获细胞直径的2倍，共有32条平行主流道，所述的平行主流道3的宽度为30-40μm，高度为目标捕获细胞直径，所述的平行主流道3的高度为15-20μm。
所述的单细胞检测功能单元4包括一个钩状捕获结构和一个代谢物检测腔室，检测腔室的长为50μm、宽为50μm，高为15-20μm。
所述的出样流道5为车轮辐射形状，同样可通过真空负压实现待测细胞悬浮液的进样；所述的流道层材料为聚二甲基硅氧烷，所述的基底层材料为二氧化硅、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。
本发明的一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：
(1)将检测溶液从进样流道1泵入芯片，同时堵住出样流道5，利用PDMS材料的透气性，使得检测溶液填充满微流控芯片的全部代谢物检测腔室；
(2)取待测细胞悬浮液，按照15μL/min的流量从进样流道1泵入芯片，细胞被钩状捕获结构捕获成单细胞状态；
(3)按10μL/min的流量从进样通道1泵入与水相不相容的氟化液，将未捕获的细胞由出样流道5排出芯片，并完成对单细胞微环境的密封；
(4)在37℃下孵育15分钟，用荧光显微镜对待检测微流控芯片进行拍照，并采用图片处理程序对单细胞内或单细胞对应的检测腔室的荧光强度进行分析，完成细胞内外代谢物浓度的检测。
进一步地，所述的检测溶液为载酶金属有机框架和荧光探针的混合溶液；所述的载酶金属有机框架通过将酶溶液、2-甲基咪唑溶液和醋酸锌溶液在室温下反应30分钟来制备。
所述的载酶金属有机框架所选用的酶为针对目标代谢分子具有特异性催化作用的酶，包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和辣根过氧化物酶等；如图8所示，选用的荧光探针为可以与过氧化氢反应而发出荧光的染料，包括Amplex Red和DCFH-DA等。
本发明的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法中制备的检测溶液。
本发明所述的微流控芯片***在单细胞分析中的应用。
试验例1
本实施例用于说明本发明微流控芯片的结构和加工。
使用计算机辅助设计软件AutoCAD设计微流控芯片结构，进样流道设计为车轮辐射结构，可有效分离细胞团，避免通道堵塞。芯片主体含32个平行主流道，每个主流道包含320个单细胞检测功能单元，使得分析总通量高达10,240个单细胞，单位面积分析量可达每平方毫米100个单细胞检测功能单元。其中，每个单细胞检测功能单元都包含一个位于主通道中的钩状捕获结构和一个与主通道相连的代谢物检测腔室。钩状捕获结构的形状、大小和位置经过优化后可用于捕获尺寸介于10-20μm之间的单细胞。此外，腔室的设计尺寸为50μm×50μm×20μm，能够容纳50pL反应缓冲液。
微流控芯片通过传统的软光刻和快速聚二甲基硅氧烷(PDMS)成型技术制备。将负性光刻胶SU-8 3025以6,000rpm的速度旋转涂覆在六甲基二硅氮烷(HMDS)处理过的4英寸硅片上，以获得15μm的厚度。在95℃下软烘12分钟，之后在365nm的光刻机下曝光，曝光能量为135mJ/cm2。曝光后的硅片直接进行曝光后烘烤，在65℃下烤1分钟，然后95℃下烤3分钟。最后在显影液中显影6分钟并在150℃下硬烘10分钟完成模具制备。所获得的模具用三甲基氯硅烷蒸汽熏蒸30分钟，以方便PDMS脱模。随后，将PDMS预聚物和交联剂以10:1的比例混合均匀后浇筑在模具上，在真空干燥器中脱气60分钟，并在70℃下固化3小时。之后将PDMS弹性体从模具上剥离，切成合适的尺寸，并用打孔器完成进/出口打孔。最终，经过氧等离子体处理1min后，将PDMS弹性体不可逆地键合在载玻片上，并在80℃的热板上加热20min完成微流控芯片的制备。
试验例2
本实施例用于说明本发明检测溶液的制备。
通过共沉淀法将不同的酶，包括葡萄糖氧化酶(GOx)、乳酸氧化酶(LOD)和辣根过氧化物酶(HRP)固定在沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8中，得到GOx@ZIF-8和LOD&HRP@ZIF-8。简而言之，将100μL Zn(CH3COO)2·2H2O水溶液(0.31M)和40μL酶溶液(GOx浓度为5mg/mL，LOD浓度为2.5mg/mL，HRP浓度为5mg/mL)同时快速添加到含有1mL 2-甲基咪唑水溶液(1.25M)的10mL玻璃瓶中，并将混合物在带加热板的磁力搅拌器上于25℃下低速搅拌30分钟。待反应完成后，以10,000rpm的速度离心5分钟，以收集产物，用去离子水洗涤，重复以上离心洗涤操作3次，最后将产物冷冻干燥后保存在-20℃冰箱中。
试验例3
本实施例用于说明本发明单细胞检测的操作步骤。
本发明通过三步加载方案来构建单细胞代谢物检测微环境(图3)。首先，将用于检测目标分子的试剂缓冲液灌注到装置中。利用PDMS的高透气性，将所有检测腔室内的空气推入弹性体从而充满检测试剂。然后，以优化的流速和浓度(图5)将少量细胞悬液(～10μL，1×107cells/mL)注入装置中。该体积足以在所有芯片捕获结构中实现饱和单细胞分离。最后，通过用氟化液冲洗微流控通道，使得每个被捕获的单细胞及其相邻的腔室立即与其他细胞分开，以建立独立的单细胞微环境。该协议允许独立的营养供应和分泌物收集，从而避免细胞之间的交叉污染。简而言之，该微流体平台为单细胞代谢物研究提供了精确的时空监测方法。
以MCF-7为模型细胞，将GOx@ZIF-8(20μg/mL)和DCFH-DA(10μM)共同溶解于PBS(1×，pH＝7.4)缓冲液中配制成葡萄糖检测液。可观察到细胞内的绿色荧光强度随着时间的推移而增加，并在细胞孵育15分钟后趋于稳定，荧光信号的强度可反映细胞内葡萄糖的含量。将LOD&HRP@ZIF-8(20μg/mL)和Amplex Red(10μM)共同溶解于PBS(1×，pH＝7.4)缓冲液中配制成乳酸检测液。可观察到细胞所对应腔室的红色荧光强度随着时间的推移而增加，并且在孵育15分钟后趋于稳定，细胞外乳酸浓度可以通过腔室内的红色荧光强度反映出来。
试验例4
本实施例用于说明本发明用于正常细胞和癌细胞的区分。
使用微流控芯片***对正常乳腺细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7的混合溶液进行细胞内葡萄糖分析。采用本说明所述的方法对蓝色荧光(CMAC)标记的MCF-10A细胞和红色荧光(CMTPX)标记的MCF-7细胞进行细胞内葡萄糖的检测(图6)，结果表明，大多数MCF-7细胞内表现比MCF-10A细胞内更强的绿色荧光。进一步统计分析表明，来自五个独立样本的总计约10,000个细胞的统计数据显示，大多数MCF-7细胞显示出比MCF-10A细胞相对更强的绿色荧光，且五组样本的绿色荧光强度分布在两种细胞系中表现出相似的形状和平均值，进一步证实了MCF-10A细胞中的葡萄糖浓度低于MCF-7细胞。表明MCF-7细胞通常具有更高水平的细胞内葡萄糖浓度。通过定义绿色荧光强度的阈值，使强度低于或高于阈值的细胞分别被视为MCF-10A或MCF-7细胞，可以在单细胞水平上区分这两种细胞类型。将检测灵敏度和特异性最接近的阈值定义为最佳阈值，本说明可获得79.88％的平均灵敏度和79.72％的平均特异性，证明了本说明所建立的方法在这两种细胞系之间进行单细胞区分的可行性。
使用微流控芯片***对正常乳腺细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7的混合溶液进行细胞外乳酸分析。采用本说明所述的方法对蓝色荧光(CMAC)标记的MCF-10A细胞和绿色荧光(CMFDA)标记的MCF-7细胞进行细胞外乳酸的检测(图7)，结果表明，大多数MCF-7细胞对应腔室表现比MCF-10A细胞对应腔室更强的红色荧光。进一步统计分析表明，来自五个独立样本的总计约10,000个细胞的统计数据显示，大多数MCF-7细胞对应腔室显示出比MCF-10A细胞对应腔室更亮的红色荧光，且五组样本的红色荧光强度分布在两种细胞系中表现出相似的形状和平均值，进一步证实了MCF-10A细胞分泌的乳酸浓度低于MCF-7细胞。表明MCF-7细胞通常具有更高水平的细胞外乳酸浓度。通过定义红色荧光强度的阈值，使强度低于或高于阈值的细胞分别被视为MCF-10A或MCF-7细胞，可以在单细胞水平上区分这两种细胞类型。将检测灵敏度和特异性最接近的阈值定义为最佳阈值，本说明可获得82.44％的平均灵敏度和82.11％的平均特异性，证明了本说明所建立的方法在这两种细胞系之间进行单细胞区分的可行性。
试验例5
本实施例用于说明本发明对全血样本中癌细胞的检测分析。
将用作模型细胞的MCF-7细胞掺入全血中，浓度范围为每100μL全血含5至1,000个癌细胞，并评估不同浓度下，本微流控芯片对癌细胞的捕获率。研究发现红细胞由于尺寸小和双凹圆盘形状容易逃脱，而一些体积较大的白细胞和癌细胞可以被捕获。基于实施例3所述的单细胞代谢物分析方法，对捕获的MCF-7细胞和血细胞进行细胞异质性分析。与血细胞相比，MCF-7细胞在细胞内显示出更高的绿色荧光强度，在相应的腔室中显示出更强烈的红色荧光信号，表明MCF-7细胞具有较高的细胞内葡萄糖和细胞外乳酸浓度。基于五个独立样本共约1,000个细胞的统计分析表明，大多数血细胞在细胞内葡萄糖和细胞外乳酸的检测中都表现出较低的荧光强度。所述根据细胞内葡萄糖和细胞外乳酸进行癌细胞识别的灵敏度分别为92.35％和94.11％。
此外，本发明同样适用于分析没有特定生物标志物癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231)的分析。同样的，基于五组独立样本共约1,000个细胞的分析结果表明，MDA-MB-231细胞表现出比血细胞更高浓度的细胞内葡萄糖和细胞外乳酸。基于细胞内葡萄糖和细胞外乳酸的代谢差异，全血样本中MDA-MB-231的检测灵敏度分别为89.47％和96.19％。
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片由基底和流道层键合而成，所述的流道层上设置有进样流道、分叉流道、平行主流道、单细胞检测功能单元和出样流道，进样流道和出样流道分别与分叉流道相连通，分叉流道由相互平行的32条平行主流道组成，平行主流道两侧交错分布单细胞检测功能单元，出样流道与进样流道对称设置。
2.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的进样流道为车轮辐射形状，用于分隔大的细胞簇，避免微流控通道堵塞。
3.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的分叉流道为多级分流结构，且最终每个支流道流阻相同，避免流体倾向性选择某个流阻较小的流道。
4.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的平行主流道的宽度为目标捕获细胞直径的2倍，共有32条平行主流道，所述的平行主流道的宽度为30-40μm，高度为目标捕获细胞直径，所述的平行主流道的高度为15-20μm。
5.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的单细胞检测功能单元包括一个钩状捕获结构和一个代谢物检测腔室，检测腔室的长为50μm、宽为50μm，高为15-20μm。
6.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片，其特征在于：所述的出样流道结构为车轮辐射形状，同样可通过真空负压实现待测细胞悬浮液的进样；所述的流道层材料为聚二甲基硅氧烷，所述的基底层材料为二氧化硅、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。
7.一种权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将检测溶液从进样流道泵入芯片，同时堵住出样流道，利用PDMS材料的透气性，使得检测溶液填充满微流控芯片的全部代谢物检测腔室；
(2)取待测细胞悬浮液，按照15μL/min的流量从进样流道泵入芯片，细胞被钩状捕获结构捕获成单细胞状态；
(3)按10μL/min的流量从进样通道泵入与水相不相容的氟化液，将未捕获的细胞由出样流道排出芯片，并完成对单细胞微环境的密封；
(4)在37℃下孵育15分钟，用荧光显微镜对待检测微流控芯片进行拍照，并采用图片处理程序对单细胞内或单细胞对应的检测腔室的荧光强度进行分析，完成细胞内外代谢物浓度的检测。
8.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法，其特征在于：所述的检测溶液为载酶金属有机框架和荧光探针的混合溶液；所述的载酶金属有机框架通过将酶溶液、2-甲基咪唑溶液和醋酸锌溶液在室温下反应30分钟来制备，荧光探针为Amplex Red C14H11NO4和DCFH-DA C24H16Cl2O7。
9.权利要求8的用于循环肿瘤细胞捕获及单细胞分析的微流控芯片的检测方法中制备的检测溶液。
10.权利要求1所述的微流控芯片***在单细胞分析中的应用。
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