CN109991423B - 高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法；该检测平台由单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、分泌蛋白捕获玻璃板、芯片夹具三部分组成；其中细胞捕获与液滴孵育微流控芯片有两层结构，分别是单细胞捕获与液滴孵育层、隔离阀层。该平台可高效快速的进行单细胞的捕获，通过隔离相的加入快速稳定的生成含有单个细胞的微液滴并可进行长期的液滴孵育，同时保证单细胞的高活性，将该芯片与分泌蛋白的检测的抗体阵列玻璃板相结合，可实现单细胞分泌蛋白高通量、快速、高灵敏度的检测。

Description

高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法
技术领域
本发明涉及高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，属于微流控单细胞分析方法技术领域。
背景技术
传统的细胞研究方法，是基于大量细胞的群体性研究，得到的结果往往是所有细胞的平均结果。而有研究表明同一种类型的细胞，不同细胞个体其基因表达情况以及表型有一定的差异(Zhang,Y et al.(2014)Journal of the American Chemical Society136:15257)，称之为细胞的异质性。群体实验得到的实验结果会掩盖了细胞的异质性，影响着癌症的治疗、预后以及复发几率。单细胞研究是指将细胞分散在一个个独立的实验单元中并加以研究，得到独立的实验结果，不会相互影响，因此能够对细胞异质性进行充分的研究，得到更加精确、具有指导性意义的结果，但单细胞的研究要具有较高的通量才能具有很好的统计学意义。分泌蛋白具有促进癌细胞增殖、转移的能力(Konty,T at al.(2011)Biosensors&bioelectronics 26:2707)，对癌细胞进行单细胞分泌蛋白进行研究，有助于理解癌细胞的转移能力以及癌细胞与免疫***之间的关系。
目前，单细胞分泌蛋白的检测主要是将微流控芯片与分泌蛋白捕获工具相结合实现单细胞、多细胞或者血浆中细胞分泌蛋白的检测，并通过荧光信号输出。用于分泌蛋白检测的微流控芯片包括微孔阵列式芯片(Lu,Y at al.(2013)Anal.Chem.85:2548)、鱼骨形液滴生成芯片两大类；其原理都是通过泊松分布来实现单细胞的捕获，因此其存在细胞利用率低、单细胞捕获效率低、试剂浪费严重、检测腔体体积大、检测灵敏度低等问题，因为检测腔体体积较大所以芯片需要超过12小时的孵育才能让分泌蛋白被充分的捕获。缺少一种拥有较小的检测体积使其在较短的孵育时间内能实现快速单细胞分泌蛋白捕获，能允许细胞的微液滴长期孵育，并能保证单细胞的高活性，实现单细胞分泌蛋白高通量、快速、高灵敏度的检测平台。
发明内容
本发明针对现有单细胞分泌蛋白检测平台单细胞捕获效率低、分泌蛋白检测腔体体积大、单细胞分泌蛋白检测灵敏度低、试剂浪费严重等问题，提出一种能实现单细胞高效率的捕获效率、分泌蛋白检测腔体体积小、分泌蛋白检测灵敏度高、快速单细胞分泌蛋白捕获、节约试剂的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台。
本发明的技术方案为：
高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层(23)和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层(24)；
单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道(11)连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道(11)的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道(11)的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，并通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；
隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道(7，11)末端相接；
分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在多聚赖氨酸玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。
在本发明中，所述的多个单元之间，可以采用串联方式连接，也可以采用并联方式连接，还可以是串并联混合方式连接。
优选地，所述的细胞通道(7，11)、溶液通道(10)、隔离相通道(5)宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。
优选地，一个细胞捕获腔体(6)和一个检测通道(9)组成一个孵育单元，在加上一组分泌蛋白捕获抗体条带(20)形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体条带(20)与检测通道(9)内溶液接触。
优选地，每个分泌蛋白检测平台中分泌蛋白检测单元的数目为1-50000个。
优选地，隔离阀通道(16)宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离通道间隔(14)距离为5-1000微米。
优选地，高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台还包括芯片夹具，所述的芯片夹具包括夹具上板和夹具下板，所述的隔离阀层(23)和单细胞捕获与液滴孵育层(24)夹设于夹具上板和夹具下板之间
优选地，芯片夹具上板开口宽度为0.1-2厘米，长度为0.1-2厘米。
优选地，芯片夹具上板设有螺丝固定开口(30)，以及7个芯片通道开口，分别为细胞通道开口(31，33)、溶液通道开口(32，34)、隔离阀通道开口(35，36)与隔离相入口开口(37)。
本发明还提供了如前所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台的应用，其运用于单细胞分泌蛋白/胞内蛋白的检测和/或分析。
本发明还提供一种单细胞分泌蛋白检测方法，包括如下步骤：
1)根据前述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台结构，制备细胞捕获与液滴孵育微流控芯片，和分泌蛋白捕获玻璃板；
2)在与多聚赖氨酸捕获玻璃板热键合的修饰芯片腔体中通入捕获抗体，进行分泌蛋白捕获抗体阵列的修饰；修饰好后，使用缓冲液进行封闭，然后洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干；
3)将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片与单细胞分泌蛋白捕获玻璃板工作区域对齐、贴合并固定；芯片浸泡在超纯水中；对单细胞进行捕获；
A、先往隔离阀通道(16)内注入超纯水，使其压力变大，引起隔膜(29)向下形变，将检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)和溶液通道(10)隔离开来；
B、反向从隔离相入口(5)与溶液通道出口(4)通入隔离相，在细胞捕获腔体(6)中生成一个个带有单细胞的液滴，
C、待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置，然后将气管拔出，将隔离阀通道入口(12，13)的水管拔出，释放隔离阀通道(16)压力，隔膜(29)形貌复原，不再有隔离效果，使检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)重新连通，组成单细胞孵育单元，在将芯片的出入口使用胶带封闭；。
4)接着将平台放入细胞培养箱中，进行细胞液滴的孵育，在整个孵育过程中单细胞处于细胞捕获腔体中，分泌蛋白通过扩散作用转移到细胞检测通道，被分泌蛋白捕获抗体阵列所捕获；将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板，从芯片上拆解下来，并检测单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的信号，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况。
优选地，步骤(3)对单细胞进行捕获，细胞浓度控制在5*105-5*107/mL，细胞相与溶液相流速为0.005-0.05mL/h，反向通入隔离相时隔离相相流速为0.5-2.0mL/h，待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置1-10min然后将气管拔出，将芯片的出入口使用胶带封闭。
优选地，将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板，从芯片上拆解下来，并立即用缓冲液封闭，接着用带有biotin基团的4种分泌蛋白的检测抗体与其孵育45分钟，检测抗体稀释200倍；然后使用1％BSA的PBS洗涤，使用稀释了100倍的SA-APC与分泌蛋白捕获玻璃板孵育20分钟；最后使用PBS、50％PBS、超纯水、超纯水进行梯度洗涤，甩干，使用扫描仪对单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的荧光信号进行检测，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况。
本发明采用流体力学的原理使单细胞被捕获腔体所捕获，单细胞捕获腔体与其相连接的检测通道形成一个孵育单元，不同的孵育单元互不干扰；可通过增加孵育单元的数目实现单细胞分泌蛋白高通量的检测。本发明单细胞捕获效率高、分泌蛋白检测腔体体积小、分泌蛋白检测灵敏度高、单细胞分泌蛋白捕获快速、能够节约试剂。
附图说明
图1为单细胞捕获与液滴孵育层结构俯视图
图2为单细胞捕获与液滴孵育层单元结构俯视图
图3为隔离阀层结构俯视图
图4为隔离阀单元结构俯视图
图5为分泌蛋白捕获玻璃板修饰芯片结构俯视图
图6为分泌蛋白捕获玻璃板修饰芯片单元结构俯视图
图7为单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片结构俯视图
图8为单细胞捕获与液滴孵育单元结构俯视图
图9为高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测芯片结构俯视图
图10为高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测芯片单元结构俯视图
图11为高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台侧视图
图12为高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测芯片夹具上板
图13为高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测芯片夹具下板
图14为高效的单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片荧光液滴孵育阵列生成图。
图15为芯片单细胞捕获情况。上方为单细胞捕获效率柱状图平均单细胞捕获效率达80％，下图为芯片单细胞捕获图。
图16为芯片经7小时液滴孵育后细胞存活情况。A图为芯片在放进去孵育前明场的图片；B图为经7小时孵育后使用钙黄绿素(CA-AM)染色后查看细胞存活情况；C图为经7小时孵育后使用碘化丙啶(PI)染色查看细胞死亡情况。
图17为细胞经7小时孵育后存活/死亡情况。其存活率达94.8％。
图18为巨噬细胞4小时孵育后4种分泌蛋白的分泌热图。
图中 数字标记
1细胞溶液入口 2溶液入口 3细胞溶液出口 4溶液出口 5隔离相入口 6细胞捕获腔体 7直形细胞流动通道 8连接通道 9检测通道 10溶液通道 11 U形或弧形细胞流动通道 12隔离阀通道入口 13隔离阀通道入口 14隔离阀通道间隔 15外扩区域 16隔离阀通道17修饰芯片通道出口 18修饰芯片通道入口 19分泌蛋白捕获抗体阵列间隔 20分泌蛋白捕获抗体阵列条带 21夹具上板 22夹具下板
23隔离阀层 24单细胞捕获与液滴孵育层 25回型铁片 26多聚赖氨酸玻璃板 27液滴孵育层通道 28螺丝 29单细胞捕获与液滴孵育层、隔离阀层之间的隔膜 30螺丝固定开口
31细胞通道开口 32溶液通道开口 33细胞通道开口 34溶液通道开口 35和36隔离阀通道开口 37隔离相入口开口。
具体实施方式
实施例1
参见图1至图14.高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，包括单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、分泌蛋白捕获玻璃板、芯片夹具三部分；其中，
1、参见图11，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层23和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层24；单细胞捕获与液滴孵育层由多个实验单元首尾相连组成，每个实验单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道7，两个直形流动通道之间使用U形或弧形细胞流动通道11连接，细胞捕获腔体6的左端与U形或弧形细胞流动通道11相连，右端通过连接通道8与U形或弧形细胞流动通道11的右端相连，细胞捕获腔体6下方连接检测通道9，检测通道下方与溶液通道10相连；
其中，参见图10，细胞捕获腔体6连接有3个通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形通道11的其中一端左端，该通道的宽度大于细胞直径，用于捕获细胞；第二条通道为连接通道8，宽度小于细胞直径，用于连接U形或弧形通道11的右端；第三条通道为检测通道9，通向溶液通道10；溶液通道10两端分别有一个溶液入口2和一个溶液出口4；
参见图3和图4，隔离阀层由多个相同的结构单元组成，每个结构单元由两个反向的相同的隔离阀通道16间隔一定的距离14组成，其结构单元中部有一个外扩区域15，每条隔离阀通道只有一个入口(12或13)；隔离阀通道16在检测通道9上方，中间间隔一层PDMS隔膜29，并处于检测通道9范围内，隔离阀外扩区域15与检测通道9重合；细胞溶液入口1与出口3在细胞流动通道两端；隔离相通道的入口5与细胞流动通道末端相接。
2、分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板26，分泌蛋白捕获抗体条带20修饰在多聚赖氨酸玻璃板26上。
3、夹具包括：夹具上板21和夹具下板22，玻璃板26处于芯片夹具上板21、夹具下板22之间，并在夹具上板21上放置一块回型铁片25，通过螺丝28加以固定，组成高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，参见图12和图13。
4、高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台的组装：将修饰有分泌蛋白捕获抗体阵列20的多聚赖氨酸玻璃板26，和单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片校准，分泌蛋白捕获抗体阵列20位于检测通道9内，并处于两隔离阀通道16之间，抗体阵列20面向检测通道9并与检测通道9内的溶液直接接触。使用夹具将校准后的芯片固定，芯片通道出、入口和与之对应的夹具开口相对应；平台从上到下分别是回型铁片25、夹具上板21、隔离阀层23、单细胞捕获与液滴孵育层24、分泌蛋白捕获抗体玻璃板26、夹具下板22，参见图13。
优选地，所述的细胞通道(7，11)、溶液通道10、隔离相通道5宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。
优选地，一个细胞捕获腔体6和一个检测通道9组成一个孵育单元，一个孵育单元再加上一组分泌蛋白捕获抗体条带20形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体条带20与检测通道9内溶液接触。
优选地，每个分泌蛋白检测平台中分泌蛋白检测单元的数目为1-50000个。
优选地，隔离阀通道16宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离通道间隔14距离为5-1000微米。
优选地，隔离阀通道16与其下方的检测通道9之间的隔膜厚度为3-50微米
优选地，芯片夹具上板开口宽度为0.1-2厘米，长度为0.1-2厘米。优选地，芯片夹具上板设有螺丝固定开口30，以及7个芯片通道开口，分别为细胞通道开口(31，33)、溶液通道开口(32，34)、隔离阀通道开口(35，36)与隔离相入口开口37。
高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测方法，包括如下步骤：
(1)使用PDMS制作单细胞捕获与液滴孵育层、隔离阀层，并将两层校准贴合在一起，通过热键合的方式将单细胞捕获与液滴孵育层与隔离阀层热键合在一起；
(2)对制作好的芯片进行疏水化修饰与水煮处理，处理好后备用；
(3)使用修饰芯片硅片模板制作修饰通道PDMS芯片，并将修饰芯片与多聚赖氨酸玻璃板热键合，将分泌蛋白捕获抗体修饰到多聚赖氨酸玻璃板上；
(4)设计并制作单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片的夹具，使用夹具将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、修饰了分泌蛋白捕获抗体的多聚赖氨酸玻璃板通过夹具组合在一起制成单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台；
(5)使用平台进行单细胞的捕获，捕获完成后反向通入隔离相生成带有细胞的液滴阵列；将生成带有细胞的液滴阵列平台放入细胞培养箱中进行一段时间的孵育；
(6)将捕获了单细胞分泌蛋白的多聚赖氨酸玻璃板进行免疫酶链反应处理，输出荧光信号，并对荧光信号进行检测分析。
在本发明较佳的实施例中，步骤(4)中，在分泌蛋白被捕获玻璃板上修饰一条BSA-FITC荧光条带，作为参照条带用来校准单细胞捕获与孵育微流控芯片和单细胞分泌蛋白捕获玻璃板；之后使用夹具将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、单细胞分泌蛋白捕获玻璃板固定在一起，使用回型不锈钢板平衡各螺丝位点压力即可进行实验。
在本发明较佳的实施例中，步骤(5)中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片的操作时间应控制在1.5小时以内；反向通入隔离相生成液滴时，隔离相流速应控制在0.8mL/h；操作过程芯片应浸泡在超纯水中。
实施例2
(1)单细胞捕获与液滴孵育层PDMS芯片、隔离阀层PDMS芯片的热键合
先使用正置显微镜，将单细胞捕获及液滴孵育层与隔离阀层对齐、贴合到一起，将芯片然后放到60度烘箱中加热20分钟，然后将其从硅片模板上剥离，并在芯片通道出入口处打孔，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片制作完成。
(2)单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片的修饰
使用电子氟化液1720进行芯片通道的修饰，修饰好后使用烘箱加热1小时确保溶剂完全挥发，然后将芯片置于PBS中进行水煮，水煮后，将芯片浸泡在PBS中，待实验时取出。
(3)单细胞分泌蛋白捕获玻璃板的修饰
制作修饰通道微流控芯片，并在其出入口出打孔；将芯片放入无水乙醇中超声10分钟，接着将芯片放入超纯水中超声10分钟，取出使用氮气将表面水分吹干，将芯片置于干净的皿中，放到80度烘箱中加热30分钟烘干；使用胶带将修饰芯片通道表面残留的杂质去除后，将芯片与多聚赖氨酸玻璃板自然贴合，置于80度烘箱中加热2小时进行热键合；待其冷却后，通入1.5微升的分泌蛋白捕获抗体进行修饰，修饰时间为4小时。修饰好后，使用3％BSA的PBS进行封闭1小时，然后依次使用纯1X PBS、50％PBS、超纯水、超纯水进行梯度洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干，并置于干净的皿中避光保存。
(4)单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片的单细胞捕获以及液滴阵列生成及孵育
在平台的单细胞捕获过程中，应浸泡在超纯水中；单细胞捕获时，应先给隔离阀通道注入超纯水，隔离阀通道与其下方的检测通道之间的隔膜发生向下形变，将检测通道隔离与细胞捕获腔体、流动通道隔离开，防止细胞流入检测通道影响单细胞的捕获；细胞流速为0.01mL/h，细胞被细胞捕获腔体所捕获，并停留在细胞捕获腔体内，所需时间为5分钟。捕获完成后应静置5分钟，释放流动相压力便于反向通入隔离相；反向从隔离相入口与溶液通道出口通入隔离相，隔离相流速为0.8mL/h，生成一个个带有单细胞的捕获腔体液滴，阵列生成后，关闭气阀；液滴生成后静置5分钟，将通道内的气压排尽，然后将气管拔出，将隔离阀通道内水管拔出，释放水压，恢复隔膜形貌，将检测通道与细胞捕获腔体连接在一起，形成一个孵育单元；接着使用胶带将出入口封闭，将微流控芯片浸没在超纯水中，放入细胞培养箱中孵育；在细胞孵育的过程中，单细胞处于细胞捕获腔体，细胞产生的分泌蛋白会经过扩散的作用扩散到检测通道，被检测通道内的分泌蛋白检测抗体阵列所捕获。
实施例3单细胞分泌蛋白捕获玻璃板的修饰
制作修饰通道微流控PDMS芯片，如图5所示，并在其出入口出打孔；将芯片放入无水乙醇中超声10分钟，接着将芯片放入超纯水中超声10分钟，取出使用氮气将表面水分吹干，将芯片置于干净的皿中，放到80度烘箱中加热30分钟烘干；使用胶带将修饰芯片通道表面残留的杂质去除后，将芯片与多聚赖氨酸玻璃板自然贴合，置于80度烘箱中加热2小时进行热键合；待其冷却后，在其5个修饰通道中分别通入BSA-FITC、IL-8捕获抗体、MCP-1捕获抗体、TNF-a捕获抗体、MIP-1b捕获抗体，各1.5微升，进行分泌蛋白捕获抗体的修饰修饰，所使用的捕获抗体稀释一倍，修饰时间为8小时。修饰好后，使用3％BSA的PBS进行封闭1小时，然后依次使用纯1X的PBS、50％1X的PBS、超纯水、超纯水进行梯度洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干，并置于干净的皿中避光保存。
实施例4单细胞的捕获及细胞的存活性验证
将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片与单细胞分泌蛋白捕获玻璃板工作区域对齐、贴合并用夹具固定，即可进行实验；实验过程中，芯片应浸泡在超纯水中。先给隔离阀层通道注入超纯水，引起隔膜向下形变，将检测通道与细胞捕获腔体、溶液通道隔离开来；在细胞通道入口通入细胞(细胞A549)进行捕获，溶液通道通入与细胞悬浮液一致的细胞培养液，细胞浓度应控制在5*106个/mL左右，细胞相与溶液相流速为0.01mL/h，单细胞捕获率可达80％，如图15，捕获完成后静置5分钟，然后将细胞入口与溶液入口的管子拔出，反向从隔离相入口与溶液相出口通入隔离相，隔离相流速应为0.8mL/h，生成一个个带有细胞的液滴阵列，然后关闭气泵开关，静置5min然后将气管拔出，将芯片的出入口使用胶带封闭，放入超纯水中，接着将其放入细胞培养箱中，进行细胞液滴的孵育一段时间后孵育。
孵育完成后将芯片被封闭的出入口揭开，通入CA-AM与PI的混合染料进行细胞染色，判断细胞存活性，20分钟后对细胞的荧光信号进行拍照观察如图16、图17所示，7小时的孵育单细胞的存活率达到了94.8％。
实施例5单细胞分泌蛋白的检测
将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板，从芯片上拆解下来，并立即用3％BSA的PBS封闭30分钟，接着用带有biotin基团的4种分泌蛋白的检测抗体与其孵育45分钟，检测抗体稀释200倍；然后使用1％BSA的PBS洗涤，使用稀释了100倍的SA-APC与分泌蛋白捕获玻璃板孵育20分钟；最后使用PBS、50％PBS、超纯水、超纯水进行梯度洗涤，甩干，使用扫描仪对单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的荧光信号进行检测，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况,图18为巨噬细胞四种分泌蛋白的分泌热图。

Claims (10)

1.单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：所述的检测平台包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层；
单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，检测通道(9)通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；
隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道末端相接；
分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。
2.如权利要求1所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：细胞流动通道、溶液通道(10)、隔离相通道宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。
3.如权利要求1所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：一个细胞捕获腔体(6)和一个检测通道(9)组成一个孵育单元，孵育单元加上一组分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)与检测通道(9)内溶液接触。
4.如权利要求1所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：隔离阀通道(16)宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离阀通道之间的间隔(14)为5-1000微米。
5.如权利要求1所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：还包括芯片夹具，所述的芯片夹具包括夹具上板和夹具下板，隔离阀层、单细胞捕获与液滴孵育层和玻璃板夹设于夹具上板和夹具下板之间。
6.如权利要求5所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：夹具上板开口宽度为0.1-2厘米，长度为0.1-2厘米。
7.如权利要求5所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：夹具上板设有螺丝固定开口(30)，以及7个芯片通道开口，分别为两个细胞通道开口、两个溶液通道开口、两个隔离阀通道开口与一个隔离相通道的入口(5)开口。
8.如权利要求1至7任一项所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台的应用，应用于单细胞分泌蛋白和/或胞内蛋白的检测和/或分析。
9.一种单细胞分泌蛋白检测方法，包括如下步骤：
1)按照权利要求1至7任一项所述的单细胞捕获与单细胞分泌蛋白检测平台的结构，制备细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；
2)在与多聚赖氨酸捕获玻璃板热键合的修饰芯片腔体中通入捕获抗体，进行分泌蛋白捕获抗体阵列的修饰；修饰好后，使用缓冲液进行封闭，然后洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干；
3)将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片与单细胞分泌蛋白捕获玻璃板工作区域对齐、贴合并固定；芯片浸泡在超纯水中；对单细胞进行捕获：
A、先往隔离阀通道(16)内注入超纯水，使其压力变大，引起隔膜(29)向下形变，将检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)和溶液通道(10)隔开；
B、反向从隔离相通道的入口(5)与溶液通道出口(4)通入隔离相，在细胞捕获腔体(6)中生成一个个带有单细胞的液滴；
C、待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置，然后将气管拔出，将隔离阀通道入口的水管拔出，释放隔离阀通道(16)压力，隔膜(29)形貌复原，不再有隔离效果，使检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)重新连通，组成单细胞孵育单元，再将芯片的出入口使用胶带封闭；
4)将平台放入细胞培养箱中，进行细胞液滴的孵育，在整个孵育过程中单细胞处于细胞捕获腔体中，分泌蛋白通过扩散作用转移到细胞检测通道被分泌蛋白捕获抗体阵列所捕获；将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板从芯片上拆解下来，并检测单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的信号，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况。
10.如权利要求9所述的一种单细胞分泌蛋白检测方法，其特征在于：步骤(3)对单细胞进行捕获，细胞浓度控制在5*105-5*107/mL，细胞相与溶液相流速为0.005-0.05mL/h，反向通入隔离相时隔离相流速为0.5-2.0mL/h，待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置1-10min然后将气管拔出，将芯片的出入口使用胶带封闭。
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