CN116492454A - 一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属兽用生物制品技术领域，提供了一种改进的兔巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备和应用。本发明对兔巴氏杆菌病灭活疫苗（单苗或联苗）进行了改进。改进后的兔巴氏杆菌病灭活疫苗单苗或联苗中包含巴氏杆菌菌体和重组巴氏杆菌蛋白，免疫保护效果得到了提升，具体表现为对同源菌株和异源菌株的攻毒的免疫保护效力均得到提升，从而为更好地防控兔巴氏杆菌病提供了良好工具。
Description
技术领域
本发明属兽用生物制品技术领域，具体涉及一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备和防控兔巴氏杆菌方面的应用。
背景技术
兔巴氏杆菌病(Pasteurellosis)是主要由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)引起的一种严重危害养兔业的主要细菌性疫病。各种年龄、品种的家兔对于多杀性巴氏杆菌均易感，尤其2-6月龄的家兔易感染发病，该病是造成9周龄到6月龄家兔死亡的主要疫病之一。伴随兔瘟疫苗广泛使用，兔瘟(兔病毒性出血症)在我国全国范围内发病危害减少，巴氏杆菌病开始上升为危害养兔业的主要疫病。
目前已经有灭活疫苗用于兔巴氏杆菌病的防控，但是由于制备工艺不够稳定，批次间抗原免疫原性差异较大，效力检验中攻毒保护率较低。而且兔巴氏杆菌病灭活疫苗存在灭活疫苗的固有缺点——对异源菌株的免疫保护效力差，因而兔巴氏杆菌病疫苗的临床效果并不能让人完全满意。
本发明的目的是提供一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其对于对同源巴氏杆菌菌株和异源巴氏杆菌菌株的攻毒均具有更强的免疫保护效力。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：通过筛选和试验获得一种兔巴氏杆菌疫苗(单苗或联苗)，该疫苗对同源菌株的攻毒具有更强的免疫保护效力，对异源菌株的攻毒也具有免疫保护效力。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重巴氏杆菌抗原组合，用于制备兔巴氏杆菌疫苗。
所述疫苗中包含巴氏杆菌灭活菌体和重组巴氏杆菌蛋白，其中巴氏杆菌为C51-17株，所述巴氏杆菌蛋白为PlpE和PtfA重组蛋白。
所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述巴氏杆菌C51-17株，其保藏编号为：CCTCC M 2018401，保藏日期为2018年6月26日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。
所述PlpE重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，PtfA重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述编码PlpE重组蛋白的基因核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码PtfA重组蛋白的基因核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
所述疫苗还包含兔出血症病毒VP60抗原蛋白，获得改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗。
所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗单苗制备方法为巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后，在灭活前向疫苗中加入PlpE重组蛋白和PtfA重组蛋白并稀释菌液，使疫苗中的两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，巴氏杆菌终浓度为7.5×109CFU/ml，然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗。
所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗制备方法具体步骤为：巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后，在灭活前稀释菌液并向疫苗中加入PlpE重组蛋白、PtfA重组蛋白及兔出血症病毒VP60蛋白，使疫苗中巴氏杆菌终浓度为7.5×109CFU/ml，两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，VP60蛋白血凝价不低于1：256，然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗。
所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗在防控兔巴氏杆菌病合兔病毒性出血症方面的应用。
本发明所述可以用于制备兔巴氏杆菌病灭活疫苗的抗原组合的筛选过程如下：
(1)收集近几年我国家兔养殖场的巴氏杆菌临床分离株，通过MLST分子分型方法分型，选择不同群体的代表菌株进行后续实验。
(2)比较巴氏杆菌C51-17株灭活疫苗对于不同菌株的免疫保护作用。
(3)筛选对巴氏杆菌C51-17株攻毒有效的重组巴氏杆菌蛋白，确定PlpE重组蛋白。
(4)分析重组PlpE蛋白对其他兔源巴氏杆菌攻毒的免疫保护力，确定PlpE无法提供有效免疫保护的异源菌株JY-1和SD-7。
(5)制备JY-1株菌体蛋白的重组蛋白，并筛选对JY-1株攻毒具免疫保护作用的重组巴氏杆菌蛋白，确定PtfA重组蛋白符合要求。
(6)制备巴氏杆菌C51-17株的培养液，加入重组PlpE蛋白和PtfA(进一步加入兔出血症病毒VP60抗原则制成联苗)，灭活并加入佐剂后获得改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗单苗，对同源菌株和异源菌株攻毒都具有更加良好免疫保护作用。
本发明的有益效果是：兔巴氏杆菌病灭活疫苗存在对同源菌株攻毒免疫保护效力不够强，对异源菌株的攻毒免疫效力差的问题，目前现有技术尚无很好的改进方法。本发明在分析兔源巴氏杆菌群体构成的基础上，对不同类型兔巴氏杆菌的保护性抗原进行了筛选，最终筛选出对不同菌株均有免疫保护作用的巴氏杆菌抗原组合。将这种抗原组合制备成兔巴氏杆菌病灭活疫苗后能有效保护同源菌株和异源菌株的攻毒。
总之，本发明通过筛选不同类型巴氏杆菌抗原，获得了一种抗原组合，制备成灭活疫苗后能有效应对同源菌株和异源菌株攻毒，为后期生产更强效兔巴氏杆菌病灭活疫苗单苗和联苗及兔巴氏杆菌病防控提供了基础。
本发明中所用到的巴氏杆菌C51-17株，分类名为：Pasteurella multocida；为无芽孢，不运动，兼性厌氧，菌体两端常染色浓重的革兰氏染色阴性小杆菌。保藏号为：CCTCCM 2018401。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间是2018年6月26日。
附图说明
图1为本发明所确定的兔源巴氏杆菌的RIDIC MLST分型结果及群体结构。
图2为本发明所获得的源自巴氏杆菌C51-17株的重组巴氏杆菌蛋白。所有蛋白都已经经过Ni亲和纯化。
图3为免疫21天后各免疫组小鼠体内针对所免疫抗原的抗体水平检测结果。所有血清都经过1/100稀释。以PBS免疫组为对照(Control)。
图4为本发明所获得的源自巴氏杆菌JY-1株的重组巴氏杆菌蛋白。所有蛋白都已经经过Ni亲和纯化。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：兔源巴氏杆菌群体结构分析
本发明在2011年至2020年收集了30株兔源巴氏杆菌(包括兔巴氏杆菌病疫苗株C51-17)。这些菌株从我国主要家兔产区分离得到，所分离的家兔养殖场不同也无相关性，分离的病料包括发生鼻炎家兔鼻涕、发生肺炎的兔肺脏及死于败血症家兔的肝脏中。根据RIRDC MLST分子分型方案对所有菌株进行MLST分型：首先对这些巴氏杆菌的7个看家酶基因(adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh和pgi)克隆并测序；然后在RIRDC MLST数据库中搜索每个菌株的7个位点序列(https://pubmlst.org/P.multocidaultocida/)并确定ST型或CC群。
兔源巴氏杆菌群体结构分析结果见图1。本发明表明兔源巴氏杆菌共有8个ST分子型：ST3(n＝1)、ST9(n＝2)、ST74(n＝8)、ST129(n＝3)、ST204(n＝7)、ST302(n＝7)、ST345(n＝1)和ST348(n＝1)。根据遗传相关性，这些ST型进一步划分成三个CC群(克隆复合群)：CC9(ST9、ST204和ST345，10/30)和CC74(ST74、ST302和ST347,16/30)、CC129(ST129,3/30)。即兔源巴氏杆菌主要包括3个群体，CC9，CC74和CC129，分别选择一个代表菌株(SD-7，JY-1，和C51-17)用于后续研究。
实施例2：巴氏杆菌C51-17株灭活疫苗的免疫保护效力
巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后稀释菌液，使疫苗中最终含有巴氏杆菌7.5×109CFU/ml。然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成疫苗。
选取SPF级ICR雌性小鼠(4-6周龄)90只，随机分成9组，6组为实验组，3组为对照组，每组10只小鼠。每只小鼠都免疫巴氏杆菌C51-17灭活疫苗，间隔3周免疫两次，每次免疫剂量均为100μl/只,皮下注射方式接种。第二次接种10天后分别使用巴氏杆菌C51-17株、JY-1株、SD-7株攻毒，每株菌都检测低剂量(10×LD50)、高剂量(100×LD50)下的攻毒存活率，对照组仅检测低攻毒剂量下的存活率。
实验结果(表1)表明C51-17株的免疫接种后，动物能抵抗低剂量的同源菌株攻击，对高剂量的同源菌株攻毒的免疫保护效应不佳；动物对部分异源菌株免疫保护作用不好，特别是在高剂量攻毒下没有免疫保护作用。
表1疫苗菌株C51-17对不同菌株攻毒的免疫保护效应(存活率，存活数/总数)
实施例3：巴氏杆菌C51-17菌体表面蛋白的重组表达与筛选
(1)以兔源巴氏杆菌灭活疫苗菌株C51-17株的基因组序列(NZ_MAPQ01000003.1)为参考序列，找到如下表面蛋白的ORF：LspB、OapA、OmpW、OmpH、OmpA、ComE、OmpLA、VacJ、PlpE、PlpB。进而设计引物如表2所示(小写字母为与载体相同的同源臂)。使用细菌基因组提取试剂盒提取兔源巴氏杆菌灭活疫苗菌株C51-17株的基因组。按照各自引物的退火温度和对应片段长短设定PCR参数进行PCR扩增。将扩增产物纯化后，使用BamHI和HindIII按照说明书(Takara)要求双酶切PET28a(+)质粒，胶回收法(美基)纯化后通过同源重组克隆试剂盒(诺唯赞)将上述的PCR扩增片段整合到质粒上，然后将阳性重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后送公司测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上。接下来使用HB-PET自诱导培养基16℃过夜诱导表达重组蛋白并用超声波破碎仪器进行破碎。离心收集上清，使用蛋白纯化仪(GE)进行Ni亲和纯化。对于以包涵体表达是蛋白，最后进行SDS-PAGE，并进行考马斯亮蓝染色，检测表达和纯化效果。
通过这些工作我们成功完成了对这些表面蛋白重组表达，并获得了纯化后的可溶性重组蛋白：LspB(～60kDa)、OapA(～45kDa)、OmpW(～30kDa)、OmpH(～45kDa)、OmpA(～40kDa)、ComE(～67kDa)、VacJ(～33kDa)、OmpLA(～40kDa)、PlpE(～43kDa)、PlpB(～55kDa)(图2).
表2用于重组蛋白的基因克隆的引物
(2)强免疫保护效力蛋白筛选取SPF级ICR雌性小鼠(4-6周龄)随机分成11组，每组10只，每个组对应一种重组蛋白，最后一组作为免疫对照组。调整抗原浓度后将重组蛋白与氢氧化铝胶佐剂按体积比9:1混合均匀，使抗原含量达到1000μg/ml(混合PBS与铝胶佐剂作为对照使用)。间隔3周免疫两次，每次免疫剂量均为100μl/只,皮下注射方式接种。加强免疫10天后采血制备血清，测定抗体水平。确定抗体水平较高后使用多杀性巴氏杆菌兔源强毒菌株C51-17皮下注射攻毒，10×LD50/只，连续一周观察记录小鼠发病死亡情况。
实验结果表明，加强免疫10天后小鼠体内产生针对各抗原蛋白高水平抗体，见图3。攻毒后，PlpE免疫组表现出最好的免疫保护效力，至观察期结束未发现死亡，保护率100％。其他蛋白的免疫保护效应均不超过50％，弱于PlpE(表3)。这一结果表明，PlpE是一个具有较高免疫保护效力的保护性抗原，可以用于后续实验。
表3巴氏杆菌C51-17株重组菌体蛋白的免疫保护效应比较
(3)PlpE对异源菌株免疫保护作用检测取SPF级ICR雌性小鼠(4-6周龄)随机分成4组，每组10只，两组免疫PlpE重组蛋白，另两组作为对照组免疫PBS。免疫方法与与(2)相同。加强免疫2周后使用巴氏杆菌SD-7株(CC9群，10×LD50)和JY-1(CC74群，约10×LD50)皮下注射攻毒，连续一周观察记录小鼠发病死亡情况。
实验结果(表4)表明攻毒后，对照组小鼠均全部死亡，PlpE的免疫对SD-7株和JY-1株的攻毒并没有表现出免疫保护效力，保护率为接近0％。这就表明仅巴氏杆菌PlpE重组蛋白用于提升灭活疫苗效力还不够，需要加入其他的巴氏杆菌重组蛋白。
表4 PlpE免疫保护力检测
实施例4：巴氏杆菌JY-1株菌体蛋白的重组表达与筛选
以多杀性巴氏杆菌3480菌株的基因组序列(NC_017764.1)为参考序列，找到部分菌体蛋白的ORF并设计扩增设计引物，菌体蛋白及引物信息如表5所示(小写字母为与载体相同的同源臂)。使用细菌基因组提取试剂盒提取JY-1株的基因组。按照各自引物的退火温度和对应片段长短设定PCR参数进行PCR扩增。将扩增产物纯化后通过同源重组克隆试剂盒连接到线性化的pET28a(+)或pET32a质粒载体，然后将阳性重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后送公司测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上。接下来使用HB-PET自诱导培养基26℃过夜诱导表达重组蛋白并用超声波破碎仪器进行破碎。离心收集上清，使用蛋白纯化仪(GE)进行Ni或GST亲和纯化。对于以包涵体形式表达的蛋白，纯化后先复性再使用。最后进行SDS-PAGE，并进行考马斯亮蓝染色，检测表达和纯化效果。
表5本发明所涉及JY-1菌体蛋白及其克隆引物
通过这些工作我们成功完成了对这些表面蛋白重组表达，并获得了纯化后的巴氏杆菌重组蛋白：TbpA(～35kDa)、Pm1809(～68kDa)、Pm0663(～43kDa)、Pm1069(～45kDa)、PtfA(～22kDa)、Pm1428(～70kDa)、Pm0336(～35kDa)、Pm0592(～70kDa)(图4)。
(2)免疫保护效力蛋白筛选取SPF级ICR雌性小鼠(4-6周龄)随机分成9组，每组10只，每个组对应一种重组蛋白，最后一组作为免疫对照组。调整抗原浓度后将重组蛋白与氢氧化铝胶佐剂按体积比9:1混合均匀，使抗原含量达到1000μg/ml(混合PBS与铝胶佐剂作为对照使用)。间隔3周免疫两次，每次免疫剂量均为100μl。加强免疫2周后使用巴氏杆菌JY-1株皮下注射攻毒，10×LD50/只，连续一周观察记录小鼠发病死亡情况。
实验结果表明，攻毒后，PtfA免疫组表现出最好的免疫保护效力，至观察期结束保护率80％。其他蛋白的免疫保护效应均不超过30％(表6)。这一结果表明，PtfA是一个对JY-1株攻毒具有较高免疫保护效力的保护性抗原，可以用于后续实验。
表6巴氏杆菌JY-1株重组菌体蛋白的免疫保护效应比较
实施例5改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗的制备
(1)原始灭活疫苗制备：巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后稀释菌液，使疫苗中最终含有巴氏杆菌7.5×109CFU/ml。然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成传统的兔巴氏杆菌病灭活疫苗。
(2)亚单位疫苗制备：将纯化后的PlpE重组蛋白和PtfA重组蛋白稀释，使疫苗中两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，最后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成疫苗。
(3)改进型灭活疫苗单苗制备：巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后在灭活前向疫苗中加入PlpE重组蛋白和PtfA重组蛋白并稀释菌液，使疫苗中的两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，巴氏杆菌终浓度为7.5×109CFU/ml。然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗单苗。
(4)改进型灭活疫苗联苗制备：巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后在灭活前稀释菌液并向疫苗中加入PlpE重组蛋白、PtfA重组蛋白及兔出血症病毒VP60蛋白，使疫苗中巴氏杆菌终浓度为7.5×109CFU/ml，两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，VP60蛋白血凝价不低于1：256。然后加入总菌液体积0.2％的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗。
实施例6改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗保护力分析
(1)对同源菌株的免疫保护将家兔(35～42日龄)随机分成5组，每组10只，公母各半，四组为实验组分别免疫原始灭活苗、亚单位疫苗、改进型灭活疫苗单苗、改进型灭活疫苗联苗，最后一组作为免疫对照组。选择家兔颈部皮肤疏松的部位，以75％酒精棉球对注射部位进行消毒，每只家兔注射疫苗1.0ml。对照组免疫同体积的PBS(包含10％铝胶佐剂)。免疫21天后使用巴氏杆菌C51-17皮下注射攻毒，100CFU/只(约为50×MLD)，连续一周观察记录家兔发病死亡情况。实验结果见表7，原始灭活疫苗无法对同源菌株或异源菌株的攻毒提供有效免疫保护，而改进型灭活疫苗和改进型联苗免疫组表现出良好的免疫保护效力，即改进型灭活疫苗对同源菌株攻毒具有更好的免疫保护力。
表7改进前后巴氏杆菌灭活疫苗对同源菌株攻毒的免疫保护效力
(2)对异源菌株的免疫保护将100只家兔(35～42日龄)随机分成10组，每组10只，公母各半，两组免疫原始灭活疫苗，两组免疫亚单位疫苗，两组免疫改进型灭活疫苗单苗，两组免疫改进型灭活疫苗联苗，剩下两组免疫PBS(包含10％铝胶佐剂)做对照组。选择家兔颈部皮肤疏松的部位，以75％酒精棉球对注射部位进行消毒，每只家兔注射疫苗1.0ml。21天后分别使用巴氏杆菌SD-7株或JY-1皮下注射攻毒，攻毒剂量均为1×MLD，连续七天观察记录家兔发病死亡情况。实验结果见表8，原始灭活疫苗或亚单位疫苗无法对所有异源菌株的攻毒提供完全的免疫保护作用，而改进型灭活单苗组和改进型联苗组则对不同异源菌株的攻毒都表现出良好的免疫保护效力。
综合(1)和(2)的实验结果可知，改进型灭活疫苗单苗或联苗对巴氏杆菌同源菌株或异源菌株的攻毒都具有更好的免疫保护作用。
表8异源菌株攻毒后巴氏杆菌灭活疫苗的保护力
(3)选取20只2-3月龄健康易感家兔，随机分成两组，一组对照，另一组实验，每组10只。实验组免疫改进型联苗，每只1ml；对照组免疫PBS，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。免疫3周后使用兔出血症病毒皖阜株攻毒，100×LD50/只，连续7天观察家兔存活情况。兔出血症病毒攻毒后实验组家兔全部存活(存活率100％)，对照组全部死亡(存活率0/10)。这些实验结果表明改进工作不会对联苗中的兔出血症病毒抗原产生影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗中包含巴氏杆菌灭活菌体和重组巴氏杆菌蛋白，所述巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌C51-17，所述巴氏杆菌蛋白为PlpE和PtfA重组蛋白。
2.根据权利要求1所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述多杀性巴氏杆菌C51-17，其保藏编号为：CCTCC M 2018401，保藏日期为2018年6月26日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。
3.根据权利要求1所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述PlpE重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，PtfA重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，编码PlpE重组蛋白的基因核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码PtfA重组蛋白的基因核苷酸序列为SEQ IDNO:4。
5.根据权利要求1所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含兔出血症病毒VP60抗原蛋白，获得改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗。
6.权利要求1所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗制备方法为：在多杀性巴氏杆菌C51-17培养液中加入PlpE和PtfA重组蛋白，灭活并加入佐剂，获得改进型兔巴氏杆菌灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗制备方法，其具体步骤为：多杀性巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后，在灭活前向疫苗中加入PlpE重组蛋白和PtfA重组蛋白并稀释菌液，使疫苗中的两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，多杀性巴氏杆菌C51-17终浓度为7.5×109CFU/ml，然后加入总菌液体积0.2%的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗。
8.权利要求5所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗制备方法，其具体步骤为：多杀性巴氏杆菌C51-17株经过夜培养后，在灭活前稀释菌液并向疫苗中加入PlpE重组蛋白、PtfA重组蛋白及兔出血症病毒VP60蛋白，使疫苗中巴氏杆菌终浓度为7.5×109CFU/ml，两种重组蛋白终浓度均为0.5mg/ml，VP60蛋白血凝价不低于1：256，然后加入总菌液体积0.2%的甲醛溶液灭活24h，经检测无菌后加入1/10体积的无菌铝胶佐剂制成改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗联苗。
9.权利要求1所述一种改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗在防控兔巴氏杆菌病方面的应用。
10.权利要求5所述改进型兔巴氏杆菌病灭活疫苗在防控兔病毒性出血症方面的应用。
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