CN116492351B - 氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，发现了氯替泼诺在治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏等疾病中的重要作用。本发明发现氯替泼诺可以显著促进小鼠卵巢原始卵泡的激活和发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至***，这表明氯替泼诺可以显著促进小卵泡的作用直至***，并且氯替泼诺可以促进颗粒细胞增殖，减少卵巢细胞凋亡，这种作用是通过激活PI3K信号通路实现的。本发明还取得人类卵巢组织进行验证，发现氯替泼诺促进了卵泡的原始存活，并可以刺激原始卵泡的激活及进一步发育。这提示氯替泼诺可以用于治疗或改善早发性卵巢功能不全等病症。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药以及药物应用技术领域，尤其涉及一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。
背景技术
随着社会的快速发展，人们因生活方式及生育年龄的改变而引起的***不育愈来愈严重。据统计，大约1％的育龄女性是由于早发性卵巢功能不全导致不育。早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，即卵巢早衰(premature ovarianfailure，POF)是指女性在40岁之前卵巢生理活动衰退的临床综合征，POI的发病率占成年女性的1-4％。POI分为原发和继发性。原发性POI临床表现为没有月经和不育；继发性POI临床表现为原来有正常的月经，但过早闭经、不育。无论哪种POI，都有绝经前后症状，如过早老化、骨质疏松、肥胖等，使患者未老先衰，给身心健康带来极大痛苦。近年来研究发现POI临床表现复杂、病因复杂、异质性强且缺乏有效治疗，所以对于POI治疗的临床应用方面尚处于起步阶段，仍面临诸多困难。
虽然现在依赖于***的IVF治疗已经成为了程序化的辅助生殖技术来帮助女性患者生育，但是对于一些卵巢响应匮乏(poor ovarian response,POR)的病人，如POI病患来说，她们的卵巢中只有对***不起反映的小卵泡，注射***无法得到或只能获得非常少量的有腔卵泡，这相对于正常卵巢响应的女性所产生的20到30个有腔卵泡的差距是非常大的，这个结果也就导致了这些病人无法通过常规的IVF达到生育的目的。因而，***研究小卵泡的激活和生长对治疗POR及POI引发的***不育具有重要意义。但在原始卵泡激活领域的临床探究几乎空白。本申请的发明人于2008年发表的Science文章提出PTEN-PI3K控制小卵泡激活的假说，以此为理论基础，2013年斯坦福大学薛人望教授设计了卵泡体外激活技术(In vitro activation,IVA)实现了治疗POI***问题的零突破。该技术利用腹腔镜手术取出POI患者的部分卵巢并玻璃化冷冻保存。对卵巢块进行复苏后把这些卵巢块修剪为更小的立方体以阻断Hippo信号通路；同时在培养中添加PTEN抑制剂及PI3K激动剂以激活PI3K-Akt信号通路，随后这些培养过的卵巢块会移植回POI患者的输卵管膜下以等待卵泡生长发育。待卵巢块中的卵泡发育到有腔卵泡阶段就可以取卵进行常规的IVF辅助生殖，通过这个IVA技术实现了POI病人的生育。IVA技术在临床试验应用的开展为POI患者生育带来曙光，为临床治疗POI生育提供了崭新的思路。
然而，由于在这种IVA技术中使用的PTEN抑制剂及PI3K不是FDA批准的安全药物，所以使用这些试剂处理卵巢组织存在高度致癌风险。同时，该项技术在使用时缺乏对不同POI患者个体差异的考虑，用同一种药物激活原始卵泡的治疗方法很可能导致PI3K下游分子的负反馈，从而导致原始卵泡的激活效果不理想。目前这种IVA技术的成功率只有15％左右，还远远的不能满足临床需求。
因此，探索治疗POI及POR的新的安全有效的药物尤为重要，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，旨在解决现有技术缺少安全有效的用于治疗POI及POR药物的问题。
本发明的技术方案如下：
一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。
所述的应用，其中，所述氯替泼诺通过促进卵巢原始卵泡的激活和发育治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏。
所述的应用，其中，所述氯替泼诺通过激活PI3K信号通路实现促进卵巢原始卵泡的激活和发育。
所述的应用，其中，所述治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物包括药学上可接受的载体。
有益效果：本发明提供了一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，发现了一种国家食品药品监督管理局批准的药物氯替泼诺在治疗早发性卵巢功能不全(POI)及卵巢响应匮乏(POR)这类生殖方面疾病中的重要作用。本发明通过研究发现，氯替泼诺可以显著促进小鼠卵巢原始卵泡的激活和发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至***，这表明氯替泼诺可以显著促进小卵泡的作用直至***，并且氯替泼诺可以促进颗粒细胞增殖，减少卵巢细胞凋亡，这种作用是通过激活PI3K信号通路实现的。本发明还依托医院取得人类卵巢组织进行验证，发现氯替泼诺处理的卵巢组织中可见更多的生长卵泡(初级卵泡以及次级卵泡)，且氯替泼诺促进了原始存活，并可以刺激原始卵泡的激活及进一步发育。这提示氯替泼诺可以用于治疗或改善早发性卵巢功能不全等病症，给POI患者带来福音，并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。
附图说明
图1为已发表文献中提供的IVA示意流程图。
图2为本发明实施例提供的氯替泼诺在体外促进卵泡激活和发育的结果示意图。
图3本发明实施例提供的体外氯替泼诺处理促进新生小鼠始基卵泡激活的卵巢卵泡数量统计学分析的结果示意图。
图4为本发明实施例提供的移植氯替泼诺处理后新生小鼠卵巢到受体鼠体内，新生小鼠卵巢和卵泡进一步发育的结果示意图。
图5为本发明实施例提供的移植7-21天小鼠卵巢重量统计学分析的结果示意图。
图6为本发明实施例提供的移植7-21天小鼠卵巢卵泡数量统计学分析的结果示意图。
图7为本发明实施例提供的氯替泼诺对颗粒细胞增殖的影响结果示意图。
图8为本发明实施例提供的移植7、14天小鼠卵巢初级和次级卵泡含有的EdU阳性细胞数量统计学分析的结果示意图。
图9为本发明实施例提供的氯替泼诺对卵巢细胞的凋亡水平的影响结果示意图。
图10为本发明实施例提供的氯替泼诺激活PI3K信号通路的结果示意图。
图11为本发明实施例提供的氯替泼诺刺激Kit ligand表达的结果示意图。
图12为本发明实施例提供的氯替泼诺促进人类卵巢皮质组织中卵泡的发育和存活的结果示意图。
图13为本发明实施例提供的移植2-8周人卵巢皮质各级卵泡数量统计学分析的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
尽管基于2008年发明人提出的原始卵泡激活PTEN-PI3K假说的卵泡体外激活技术(In vitro activation,IVA)已经实现了治疗POI病人***问题的零突破，但是由于这种IVA技术在应用中使用PTEN的抑制剂及PI3K的激动剂处理卵巢组织从而达到激活PI3K信号通路进而激活卵泡的目的，这些抑制剂或激动剂并不是安全的药物，用这些试剂处理卵巢组织存在致癌风险。同时，该项技术在使用时缺乏对不同POI患者个体差异的考虑，用同一种药物激活原始卵泡的治疗方法很可能导致PI3K下游分子的负反馈，从而导致原始卵泡的激活效果不理想。图1所示即为已经发表文献中的IVA流程图，卵巢破碎/Akt激动剂刺激后自体移植促进POI患者卵泡生长，产生成熟的***用于IVF-胚胎移植、妊娠和分娩。目前这种IVA技术的成功率只有15％左右，还远远的不能满足临床需求。因此，探索治疗POI的新的安全有效的药物对于更早的实现治疗早发性卵巢功能不全尤为重要。
基于此，本发明实施例提供了一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。
在一些实施方式中，所述氯替泼诺通过促进卵巢原始卵泡的激活和发育治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏。
在一些实施方式中，所述氯替泼诺通过激活PI3K信号通路实现促进卵巢原始卵泡的激活和发育。
具体来讲，氯替泼诺(Loteprednol Etabonate,LE)是一种软类固醇激素，主要应用于眼睛局部的抗炎治疗。而本发明实施例通过研究发现，氯替泼诺可以显著促进小鼠卵巢原始卵泡的激活和发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至***，这表明氯替泼诺可以显著促进小卵泡的作用直至***，并且这种作用是通过激活PI3K信号通路实现的。同时本发明还依托医院取得人类卵巢组织进行验证，发现了氯替泼诺可以显著促进人类卵泡的生长，这提示氯替泼诺可以用于治疗或改善早发性卵巢功能不全等病症，给POI患者带来福音，并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。本发明实施例将图1中IVA流程图中的Akt stimulators换成更加安全的已被国家食品药品安全管理局批准的氯替泼诺。最终，本发明实施例发现了一种国家食品药品监督管理局批准的药物氯替泼诺在治疗早发性卵巢功能不全(POI)及卵巢响应匮乏(POR)这类生殖方面疾病中的重要作用。
在一些实施方式中，所述治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物包括药学上可接受的载体。具体的，所述载体如赋形剂、添加剂、香味剂制成各种剂型，所述剂型包括散剂、片剂、微丸、胶囊、微囊、颗粒剂或液体等。
下面通过具体实施例对本发明一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用做进一步的解释说明：
实施例1
本实施例首先收取新生8天小鼠卵巢，将这些卵巢用氯替泼诺处理4天后获得卵巢样本，通过脱水包埋切片及苏木精染色等组化实验对卵巢组织分析，结果如图2A-D所示。相对于对照组(图A和C)，氯替泼诺处理组(图B和D)中初级卵泡(细箭头)和次级卵泡(粗箭头)的数量显著增加。随后本实施例进行了全卵巢组织切片计数，统计学计数结果表明，氯替泼诺处理组中初级和次级卵泡的数量相对于对照组显著增加(图3)，这表明氯替泼诺可以显著促进小鼠卵巢激活卵泡的发育。
实施例2
本实施例将氯替泼诺处理过的小鼠卵巢埋植到小鼠肾被膜下，使这些卵巢组织在小鼠体内生长。首先分离成对的卵巢，实验组在含20μM氯替泼诺的培养基中体外培养4天，对照组在不含氯替泼诺的相同培养基中培养4天，随后将卵巢移植到受体小鼠肾被膜下。结果如图4A-D所示。在埋植7-21天后，氯替泼诺处理组中卵巢组织块的大小相对于对照组，随时间延长，其大小显著增加；统计学分析的结果也证实了这点，移植14天后经氯替泼诺处理的卵巢组的卵巢重量比对照组显著增大(图5)。随后，对这些卵巢组织块进行脱水包埋及苏木精染色分析，结果如图4E-L中所示，埋植14天后，氯替泼诺处理组中出现了大的有腔卵泡(图4H-L箭号)和黄体(图4H-L箭头)，而对照组中大多数为次级卵泡。随后本实施例进行了全卵巢组织切片计数，统计学计数结果表明，埋植7天时，实验组的初级卵泡及次级卵泡数量明显大于对照组，埋植14-19天时，实验组的窦卵泡数量明显大于对照组，埋植21天时，实验组的窦卵泡及黄体数量明显大于对照组(图6A-D)。这表明体外氯替泼诺处理也可以促进小鼠小卵泡在体内的发育直至***。
实施例3
接下来，本实施例探讨了氯替泼诺对小鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响，因为这些生物学过程对卵泡发育至关重要。为了研究体外氯替泼诺处理对体内颗粒细胞增殖的影响，本实施例从PD8小鼠中分离出成对的卵巢，并在有或没有氯替泼诺(20μM)的情况下将它们培养4天，然后将培养的卵巢移植到卵巢切除的成年雌性小鼠肾被膜下。植入7天和14天后，在收集样本前2小时，给受体鼠腹腔注射EdU(20mg/kg)。然后收集卵巢样本并固定用于EdU染色。
如图7A-D所示，移植7天和14天后，与对照组(图7A-B)相比，氯替泼诺处理的卵巢中存在明显更多的EdU阳性颗粒细胞(图7C-D)。定量分析证实，埋植7天后，对照组每个卵泡初级和次级卵泡分别有2.75±1.61和4.90±2.34个EdU阳性细胞，而氯替泼诺治疗组的每个初级和次级卵泡分别有3.65±2.30和6.90±1.92个EdU阳性细胞(图8A)。同样，在移植后14天，在氯替泼诺处理的卵巢中，每个初级和次级卵泡分别含有3.30±2.27和2.77±2.87个EdU阳性细胞，这些显着高于对照组，其每个初级和次级卵泡分别含有1.55±1.32和5.30±2.34个EdU阳性细胞(图8B)。这些结果表明，用氯替泼诺对卵巢进行体外处理，可以促进初级和次级卵泡中颗粒细胞增殖随后的体内增殖至少2周。
本实施例接下来评估了在氯替泼诺对卵巢细胞的凋亡水平的影响。从PD8小鼠培养卵巢，6天后收集卵巢用于蛋白质印迹。结果表明，氯替泼诺处理显着降低了裂解的caspase-3(一种细胞凋亡标记物)的水平(图9)，表明氯替泼诺可能抑制卵巢细胞的细胞凋亡。
综上所述，上述结果表明氯替泼诺可以促进颗粒细胞增殖，减少卵巢细胞凋亡。
实施例4
运用Western blot技术对卵泡发育重要信号通路PI3K相关分子Akt及mTORC1信号通路相关分子4E-BP1、rpS6的表达进行检测。用胶原酶消化新生8天的小鼠卵巢，通过用血清培养获得贴壁的颗粒细胞。这些颗粒细胞首先在无血清的培养基中培养24小时，使细胞饥饿，随后用氯替泼诺分别处理颗粒细胞10min、20min、60min后，收取样本进行Westernblot检测。如图10所示，Western blot结果分析显示，在氯替泼诺处理10、20和60min后，磷酸化的Akt(表明PI3K信号通路被激活)在氯替泼诺处理后10分钟开始显著升高。颗粒细胞mTORC1通路激活后，会激活Kit ligand表达，Kit ligand与***表面Kit受体结合，可以激活***PI3K信号通路，从而激活***。qPCR结果也表明实验组的Kit ligand的mRNA相对水平明显升高(图11)。以上结果表明，氯替泼诺可激活小鼠卵泡颗粒细胞的PI3K信号通路。
实施例5
实施例1-4的结果都表明氯替泼诺可在体外和体内实验中促进小鼠卵巢中卵泡的发育，并且这种作用是通过激活颗粒细胞中的PI3K信号通路介导的。随后，本实施例依托香港大学深圳医院收集人的卵巢皮质样本，探究氯替泼诺对人卵泡发育的影响。
本实施例收集因为疾病切除了单侧或者双侧附件的病人卵巢，在获得卵巢皮质组织后，将其切成约1mm3的立方体，在DMEM/F-12培养基中添加氯替泼诺过夜培养。培养后，将组织移植到切除卵巢的雌性免疫缺陷小鼠肾被膜下发育4个星期后收集人类卵巢组织样本。在此过程中每36h腹腔注射FSH(每只动物2IU)，以促进人类小卵泡的生长。本实施例在移植2-8个星期后收集卵巢皮质样本，结果发现氯替泼诺处理组卵巢组织大小与对照组相比没有显著差异(图12A)，组织重量也相似(图12B)。组织学分析显示，与对照组相比，埋植4周后，氯替泼诺处理的卵巢组织中可见更多的生长卵泡(图12G-H，细箭头-初级卵泡，粗箭头-次级卵泡)。各组织连续切片计数的相对平均卵泡数显示，与对照组相比，埋植4周后，氯替泼诺处理组的各级卵泡均较多(图13A-C)。这些结果初步表明，氯替泼诺促进了原始存活，并可以刺激原始卵泡的激活及进一步发育。
综上所述，本发明提供了一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，发现了一种国家食品药品监督管理局批准的药物氯替泼诺在治疗早发性卵巢功能不全(POI)及卵巢响应匮乏(POR)这类生殖方面疾病中的重要作用。本发明通过研究发现，氯替泼诺可以显著促进小鼠卵巢原始卵泡的激活和发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至***，这表明氯替泼诺可以显著促进小卵泡的作用直至***，并且氯替泼诺可以促进颗粒细胞增殖，减少卵巢细胞凋亡，这种作用是通过激活PI3K信号通路实现的。本发明还依托医院取得人类卵巢组织进行验证，发现氯替泼诺处理的卵巢组织中可见更多的生长卵泡(初级卵泡以及次级卵泡)，且氯替泼诺促进了原始存活，并可以刺激原始卵泡的激活及进一步发育。这提示氯替泼诺可以用于治疗或改善早发性卵巢功能不全等病症，给POI患者带来福音，并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种氯替泼诺在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物包括药学上可接受的载体。
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