发明内容
解决的技术问题:本发明提供一种原始卵泡激活剂及其在人卵巢皮质培养液中的应用。
技术方案:原始卵泡激活剂,由mTOR信号通路激活剂和PI3K信号通路激活剂组成,所述mTOR信号通路激活剂包括mTOR信号通路激活剂I,mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸;所述PI3K信号通路激活剂包括PI3K信号通路激活剂II,PI3K信号通路激活剂II为100-1000μg/mL的740Y-P。
上述磷脂酸为100μM,所述740Y-P为1000μg/mL。
上述原始卵泡激活剂在制备人卵巢皮质培养液中的应用。
上述人卵巢皮质培养液,包括以下组分:1)mTOR信号通路激活剂I;2)PI3K信号通路激活剂II;3)基础培养液。
上述人卵巢皮质培养液,所述基础培养液为:MEMa细胞培养液,其中添加丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10wt.%。
上述人卵巢皮质培养液,试剂组成为:溶液I:基础培养液;试剂I:mTOR信号通路激活剂I,为50-200μM的磷脂酸,按照30mL基本培养液的剂量分别预先分装;试剂II:PI3K信号通路激活剂II,为100-1000μg/mL的740Y-P,按照30mL基本培养液的剂量分别预先分装。
非诊断治疗目的的人卵巢皮质培养液的应用方法,步骤如下:1)取卵巢组织于10mL L-15细胞培养液(另行准备),分离卵巢皮质并切割成1~5mm3的小块;2)取1mL溶液I与试剂I和试剂II混合,配制成10mL的组织培养液;3)将卵巢皮质培养于含有悬浮小网的24-孔板,在小网下方加入400-3000μL组织培养液,培养2小时,培养条件为37℃,5%CO2;4)2小时后,组织培养完成,培养的组织可用于后续操作。
有益效果:综上,含有mTOR和PI3K信号通路激活剂的人卵巢皮质培养液培养小鼠或人卵巢皮质,可以在短时间内(2小时)激活原始卵泡并促进卵泡的发育。培养完毕的卵巢皮质,经过外科植入术,可以重新移植回母体,继续正常的发育,直到发育成熟,因此本发明提供了一种短时培养就可达到激活效果的新型卵巢皮质培养液,以使该技术更高效快捷方便应用于医学辅助生殖领域。
附图说明
图1A为不同激活剂组合处理后小鼠卵巢的发育图。新生小鼠卵巢应用不同激活剂组合处理后,移植入受体小鼠的肾被膜下14天后卵巢的发育情况。上图,本专利申请涉及的激活剂处理方案,mTOR信号通路激活剂磷脂酸,PI3K信号通路激活剂740Y-P联合处理2小时;中图,专利2014071000576350中的处理方案,磷脂酸24小时,然后bpV和740Y-P处理24小时;下图,文献中的激活处理方案,mTOR信号通路激活剂MHY1485,bpV和740Y-P处理24小时,然后MHY1485和740Y-P处理24小时。所有C为对照未处理卵巢。图中结果表明,本专利申请涉及的处理方案,虽然处理时间缩短,但对于卵巢组织的发育具有更佳的激活效果,激活后的卵巢与其它两组相比,卵巢的形态更加饱满。
图1B为小鼠卵巢组织的形态学分析图。小鼠卵巢用mTOR激活剂磷脂酸,PI3K激活剂740Y-P处理2小时后,移植入受体小鼠肾被膜下发育14天。收集的卵巢组织固定后,经H&E染色进行形态学分析,可见处理组的卵巢内次级卵泡和有腔卵泡明显增多。
图1C为小鼠卵巢连续切片卵泡计数结果示意图。原始,原始卵泡;初级,初级卵泡;次级,次级卵泡;有腔,早期有腔卵泡和大有腔卵泡。同形态学分析一致,卵泡计数结果显示激活剂处理的卵巢内发育卵泡的比例明显增高。
图1D为移植卵巢内卵泡发育成熟、收集成熟卵子、体外受精及胚胎发育图。卵巢经激活剂处理后移植入受体鼠肾被膜下发育18天,受体鼠经一次性腹腔注射hCG促进***。收集卵巢,通过针刺***卵泡的方法收集卵子,体外受精24小时后发育至二细胞。
图1E为二细胞胚胎移植后健康的后代出生图,图1D中所得的二细胞经胚胎移植后生产的健康后代。
图2A为人卵巢皮质培养2小时,原始卵泡激活标志分子rpS6的磷酸化表达图。与对照组比较,磷酸化rpS6的表达在处理组皮质的基质中表达明显升高(b vs a)
图2B为人卵巢皮质体外培养2小时后,PCNA染色主要定位于***核和部分颗粒细胞图,表明该部分细胞处在增殖中。
图2C为人卵巢皮质体外处理2小时后,检测对照组和处理组组织凋亡情况图。无论在对照组还是在处理组,细胞凋亡情况主要集中在组织边缘,组织中的卵泡并没有受到影响。然而,处理组的细胞凋亡情况与对照组相比明显降低,说明该新型人卵巢皮质培养液能维持组织的存活。
图3为人卵巢皮质在新型培养液中培养后,皮质中卵泡的发育情况图。人卵巢皮质体外培养2小时后,异种移植到免疫缺陷小鼠肾被膜下发育一个月。收集移植组织固定并进行H&E染色,可见组织内卵泡的发育,处理组卵泡的发育明显好于对照组。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
新型人卵巢皮质体外培养液,包括以下组分:
其中,溶液I配制方法如下:
基本培养液:MEMa(GIBCOTM Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液,添加人血清白蛋白10wt.%、丙酮酸钠0.23mM;
其中,试剂I配制方法如下:
mTOR信号通路激活剂I,含有100μM的磷脂酸,按照30mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装;
其中,试剂II配制方法如下:
PI3K信号通路激活剂II,含有1000μg/mL的740Y-P,按照30mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装;
将上述两种激活剂预先包装到小包装盒中,然后同溶液I一起包装到大一些的包装盒中,使用时根据说明书中描述的人卵巢皮质培养方法进行操作。
培养液使用方法如下:
1)取小鼠卵巢于5mL L-15细胞培养液中,并用培养液反复清洗三次以上。
2)取1mL溶液I与试剂I,试剂II混合,待试剂I,试剂II完全溶解后,用溶液I配置成10mL的组织培养液。
3)将小鼠卵巢培养于含有悬浮小网(Millicell cell culture inserts,Millipore)的24-孔板,在小网下方加入500μL激活细胞培养液,培养2小时,培养条件为37℃,5%CO2。
4)2小时后,激活过程完成,将处理过的小鼠卵巢移植于受体小鼠的肾包囊下,并同时将受体小鼠的双侧卵巢摘除。
5)术后第二天,受体小鼠给予促卵泡素(FSH 1IU/只)注射,连续18天。
6)在最后一天,给予受体小鼠10IU的人绒毛膜***(hCG)处理。24小时后,收集移植的卵巢,通过针刺方法,释放发育成熟的卵子。
7)将卵子与来自于同一品系的公鼠***进行体外受精后,将发育到的2细胞胚胎移植于假孕小鼠,并成功建立妊娠。最后统计处理后的卵巢得到的成熟卵子其受精率和产仔数与正常成年卵巢经超数***得到的成熟卵子的区别。
实验结果见表1,表1为正常超***子与体外激活卵子体外受精后2细胞的胚胎发育率以及胚胎移植后成活率的比较。
从表1的结果可以看出,处理组的成熟卵子经体外受精后,2-细胞胚胎的发育率为73.33%,正常超***子的2-细胞胚胎发育率为89.89%。与先前专利中两种激活方案的2-细胞发育率相比(49%,201110387201.8;65%,201310309594.X),虽然,所有激活处理组的2-细胞胚胎发育率均低于正常超***子组,然而,本专利所涉及的激活方案明显获得更多的2-细胞,说明该激活方案所形成的培养液能够更好的促进卵泡发育并提高***的质量。
表1
|
MII |
2细胞胚胎 |
(%) |
2细胞胚胎 |
成活仔数 |
(%) |
处理组卵 |
90 |
66 |
73.33 |
45 |
11 |
24.4 |
超*** |
178 |
160 |
89.89 |
45 |
14 |
31.1 |
实施例2
mTOR信号通路激活剂,mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸(phosphatidicacid,
PA),所述磷脂酸为100μM。
所述mTOR信号通路激活剂在制备新型人卵巢皮质培养液中的应用。
PI3K信号通路激活剂,PI3K信号通路激活剂II,为1000μg/mL的740Y-P(740Y-P为多肽,其氨基酸序列为:RQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS(Modifications:Tyr-25=pTyr))。
所述PI3K信号通路激活剂与mTOR信号通路激活剂联合应用在制备新型人卵巢皮质培养液中的应用。
新型人卵巢皮质培养液包括以下组分:
1)mTOR信号通路激活剂I;
2)PI3K信号通路激活剂I和II;
3)基本培养液。
所述的培养液,组成方案为,mTOR信号通路激活剂I为磷脂酸,其浓度为:50-200μM,PI3K信号通路激活剂II为100-1000μg/mL的740Y-P;基本培养液:MEMa(GIBCOTM MinimumEssential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液,添加丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10wt.%。
所述的试剂盒,将试剂I、试剂II预先包装到小一些的试剂盒中,再同溶液I一起包装到大一些的试剂盒中。
所述的培养液制备方法,其中基本激活细胞培养液配制方法如下:
MEMa细胞培养液为母液,添加丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10wt.%;
所述试剂I含有mTOR信号通路激活剂包括:mTOR信号通路激活剂I,50-200μM的磷脂酸;
所述试剂II含有PI3K信号通路激活剂包括:100-1000μg/mL的740Y-P。
培养液的应用方法,步骤如下:
1)取人卵巢皮质于5mL L-15培养液,将卵巢皮质切割成1~5mm3的小块,并用培养液反复清洗;
2)取1mL溶液I与试剂I,试剂II混合,待完全溶解后,用溶液I配制成10mL的最终组织培养液;
3)将卵巢皮质培养于含有悬浮小网(Millicell cell culture inserts,Millipore)的24-孔板,在小网下方加入500μL基本激活细胞培养液,培养2小时,培养条件为37℃,5%CO2;
4)培养2小时后,组织可用于后续操作。
其中,mTOR信号通路激活剂PA,中文名字磷脂酸,为一种小分子化合物,选自:1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt),属于现有技术,可以从市场上购买得到,其用量为:50-200μM;其中PA的结构式如下:
其中,PI3K激活剂740Y-P,为一种人工合成的多肽分子,属于现有技术,可以从市场上购买得到,其用量为:150-250μg/mL;其中740Y-P多肽其氨基酸序列为:RQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS((Modifications:Tyr-25=pTyr))TocrisBioscienceCASNo:1236188-16-1;
以上培养液和方法经过试验证明效果明显,有关效果试验如下:
1)2小时新型人卵巢皮质培养液培养能够促进新生小鼠卵巢中原始卵泡的发育
新生第三天小鼠卵巢用新型人卵巢皮质培养液培养2小时后,将卵巢移植入受体鼠的肾被膜下,同时将受体鼠的双侧卵巢切除。术后第二天,每天给小鼠注射FSH至第14天,然后收集卵巢。如图1A所示,在每张图片中上层是处理组卵巢,下层是对照组的卵巢。与对照组相比2小时激活能促进卵巢的发育,并且与其它48小时处理组相比,短时间处理组卵巢的发育更加饱满。将收集的卵巢进行连续切片并卵泡计数后,激活处理的卵巢中,其处于生长发育阶段的卵泡比例明显增多,而原始卵泡所占的比例却明显降低(图1B,图1C),表明激活剂在短时间内能够激活小鼠卵巢中的原始卵泡并促进卵泡的发育。
2)2小时新型人卵巢皮质培养液培养并不影响移植卵巢所获得卵子的质量
将培养过的新生小鼠卵巢,移植入受体鼠的肾被膜下,同时将受体鼠的双侧卵巢切除。术后第二天,每天给小鼠注射FSH至第18天,给于一次性腹腔注射hCG(10IU/鼠),12小时后,收集卵巢,针刺***卵泡并收集成熟的MII卵子,进行体外受精后2-细胞胚胎移植,进一步评价卵子的质量。如图1D所示,24小时后受精卵可以发育到二细胞,将其中一部分2细胞胚胎进行胚胎移植后,得到了健康的具有生殖能力的后代(图1E)。上述结果表明,新的原始卵泡激活方案除了能够加速卵泡的发育并不会影响卵子的质量。
3)2小时新型人卵巢皮质培养液培养能够促进人卵巢皮质的存活和原始卵泡的激活
选用人的卵巢皮质,培养2小时后收集组织并进行后续分析。如图2A,激活剂处理2小时后,皮质中的原始卵泡开始表达激活标记蛋白磷酸化rps6;与对照组比较,激活标记蛋白磷酸化rps6在处理组皮质的基质中也呈现高表达(a vs b);经过2小时激活后,增殖细胞核抗原PCNA信号出现在***核和部分颗粒细胞(图2B)中;应用TUNNEL检测细胞凋亡,处理组皮质的细胞凋亡情况明显弱于对照组组织(图2C)。
4)2小时新型人卵巢皮质培养液培养能够促进人原始卵泡的发育
人卵巢皮质体外培养2小时后,异种移植入受体免疫缺陷小鼠的肾被膜下。术后1周开始每隔一天给小鼠注射FSH(1IU/只),术后一个月取材。如图3所示,处理的卵巢皮质在免疫缺陷小鼠内能够正常发育,组织切片中可见原始卵泡和初级卵泡,并且组织发育的情况明显优于对照组。
序列表
<110> 南京艾维艾康生物技术有限公司
<120> 原始卵泡激活剂及其在人卵巢皮质培养液中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Ser Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser
20 25