CN116478990A - 靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立与应用。具体地公开了靶向ZFX基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9***通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFX基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了ZFX基因第一内含子上的有效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记X染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY***，最终用于性别控制。

Description

靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细 胞系的建立与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立与应用。
背景技术
CRISPR/Cas基因编辑技术是一种由规律成簇间隔短回文序列及其相关蛋白组成的来自细菌和古生菌的获得性免疫***。其中II型CRISPR/Cas9***以其操作简便、成本低、效率高等优势，成为基因编辑主流技术。CRISPR/Cas9***通过单向导RNA(singleguide RNA，sgRNA)识别DNA靶标之后，Cas9通常会产生双链断裂。然后细胞会通过非同源末端连接机制进行修复和同源重组修复机制修复双链断裂，从而产生***、缺失或者在有供体模板时产生基因***和特定碱基改变。目前CRISPR/Cas9技术已广泛应用于微生物、动植物等诸多物种。
性别控制技术在畜牧生产中有着重要的意义。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。性别控制可以通过***分离来实现。X连锁锌指蛋白基因(Zinc Finger Protein X-Linked，ZFX)是位于X染色体的单拷贝基因，在脊椎动物中高度保守。全长蛋白包含一个转录激活结构域，一个核定位序列和一个由13个C2H2型锌指组成的DNA结合结构域。对小鼠胚胎和成体造血干细胞的研究表明，该基因是两种干细胞类型自我更新的转录调节剂。ZFX基因为性别特异基因，研究和开发针对该基因高效的定点整合转基因技术，构建定点整合外源DNA的转基因细胞系，可实现XY***的分离，最终实现性别控制，极大地减少畜禽分子育种年限，对推动现代畜禽养殖技术的发展具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种打靶效率高的特异性靶向ZFX基因的sgRNA，和/或，提供一种定点整合外源基因的细胞系及其构建方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为实现上述目的，本发明首先提供了sgRNA，所述sgRNA可靶向ZFX基因，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.1。
所述sgRNA的靶序列位于ZFX基因的第一内含子上；所述sgRNA可基于CRISPR/Cas9***。
所述ZFX基因为X连锁锌指蛋白基因(Zinc Finger Protein X-Linked)，是位于X染色体的单拷贝基因。所述ZFX基因的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NC_056080.1的第22500545-22537460位(Update Date 4-Nov-2022)，其中第一内含子的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NC_056080.1的第22500591-22516848位(Update Date4-Nov-2022)。
所述ZFX基因的核苷酸序列也可为GenBank Accession No.NW_017189516.1的第45877351-45913094位(Update Date 16-Aug-2022)，其中第一内含子的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NW_017189516.1的第45896367-45912602位(Update Date16-Aug-2022)。
本发明还提供了编码所述sgRNA的DNA分子。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有所述DNA分子的表达盒；
B2)含有所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有所述sgRNA或所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有所述sgRNA或所述DNA分子的重组宿主细胞、或含有B1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有B2)所述重组载体的重组宿主细胞。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
上述生物材料中，所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，所述动物细胞可为哺乳动物细胞。在本发明的一个或多个实施方案中，所述哺乳动物细胞为绵羊成纤维细胞或山羊成纤维细胞。
上述生物材料中，所述重组载体可为CRISPR/Cas9打靶载体。
本发明还提供了所述sgRNA，或所述DNA分子，或所述生物材料的下述任一种应用：
A1)在特异性识别和/或靶向ZFX基因中的应用；
A2)在ZFX基因中定点整合外源基因中的应用；
A3)在制备ZFX基因中定点整合外源基因的细胞系中的应用；
A4)在利用基因编辑技术对绵羊或山羊X染色体进行标记中的应用；
A5)在绵羊或山羊XY染色体分离中的应用；
A6)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；
A7)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；
A8)在绵羊或山羊分子育种中的应用；
A9)在制备ZFX基因功能研究细胞模型或动物模型中的应用。
所述控制绵羊或山羊性别的方法包括：利用所述sgRNA构建在绵羊或山羊成纤维细胞ZFX基因中定点整合报告基因(如tdTomato基因)的细胞系，利用该细胞系结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊或山羊，根据报告基因的表达情况筛选出X***，从而分离XY***，最终实现性别控制。
本发明还提供了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，所述方法可包括：利用CRISPR/Cas9***通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFX基因的靶点中，所述靶点的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：
E1)构建表达所述sgRNA的载体；
E2)构建含有外源基因和用于与打靶位点(SEQ ID No.1)两端同源重组的同源臂的供体质粒；
E3)将E1)所述载体和E2)所述供体质粒共转染受体细胞。
上述方法中，所述外源基因可为报告基因。
进一步地，所述报告基因可包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光素酶基因(如细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶基因)、碱性磷酸酶基因等但不限于此。
上述方法中，所述报告基因可为tdTomato基因(一种红色荧光蛋白基因)。
进一步地，所述tdTomato基因的核苷酸序列可为GenBank AccessionNo.KT878736.1的第2529-3959位(Update Date 06-OCT-2015)。
上述方法中，所述受体细胞可为绵羊成纤维细胞或山羊成纤维细胞。
进一步地，上述方法中，所述CRISPR/Cas9***包括表达sgRNA的载体，所述sgRNA靶向所述ZFX基因的靶点(SEQ ID No.1)。
进一步地，所述E1)可包括如下步骤：
D1)设计合成可退火形成带有粘性末端片段的单链oligo：ZFX-sgRNA-2-F(SEQ IDNo.2)和ZFX-sgRNA-2-R(SEQ ID No.3)；
D2)将所述单链oligo退火，形成退火产物(双链DNA)；
D3)将所述退火产物(双链DNA)连接到载体中，得到表达所述sgRNA的载体。
进一步地，D3)中所述载体可为PX458载体。
进一步地，所述表达sgRNA的载体可为PX458-ZFX-sgRNA-2，所述PX458-ZFX-sgRNA-2是将D2)中所述退火产物(双链DNA)连接到PX458载体中，得到的重组载体。
进一步地，E2)中所述同源臂可包括左同源臂和右同源臂，所述左同源臂的核苷酸序列可如SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示，所述右同源臂的核苷酸序列可如SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示。
进一步地，E3)中所述转染的方法可包括：将E1)所述载体和E2)所述供体质粒(摩尔比可为1:1.5)通过电转的方法转染至绵羊成纤维细胞或山羊成纤维细胞。
本发明还提供了由本文中任一所述方法构建得到的细胞系，和/或，所述细胞系的下述任一应用：
C1)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；
C2)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；
C3)在绵羊或山羊分子育种中的应用；
C4)在制备ZFX基因功能研究细胞模型或动物模型中的应用。
本文所述动物模型可包括绵羊或山羊模型。
本发明在山羊成纤维细胞中通过CRISPR/Cas9技术筛选了ZFX基因的第一内含子上的有效sgRNA。并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了CBh强启动子启动的tdTomato基因，获得了标记X染色体的绵羊成纤维细胞。性别控制技术在畜牧生产中有着重要的意义，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY***，最终用于性别控制。
实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
定点整合技术能够使外源基因的整合位置安全可控、遗传稳定，但传统的同源重组(Homologous recombination，HR)靶向整合效率很低，非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)会产生随机整合，且在连接位点会出现各种形式的***、突变或删除。本发明设计并筛选了打靶效率高的特异性靶向ZFX基因的sgRNA，并利用该sgRNA通过CRISPR/Cas9技术结合同源臂介导的末端连接(Homology-mediated endjoining，HMEJ)技术，成功的在ZFX基因中敲入了外源基因，比现有的基因敲入策略效率更高。
性别控制可以通过***分离来实现。目前现有技术利用X***和Y***不同的物理特性(体积、密度、电荷、运动性)，采用离心法、电泳法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现***的分离，但是都有一个共同的问题——可重复性差。而且这些差异随着环境条件的不同而发生变化。本发明从基因水平研究性别控制，首次通过CRISPR/Cas9技术结合HMEJ技术，成功地在绵羊成纤维细胞ZFX基因中敲入报告基因(tdTomato基因)，构建了定点整合报告基因(如tdTomato基因)的细胞系，利用该细胞系结合体细胞核移植技术可以获得转基因绵羊，根据报告基因的表达情况筛选出X***，从而分离XY***，最终实现性别控制，减少育种年限，提高选育的效率。
附图说明
图1为T7E1检测山羊ZFX基因三个靶点效率的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为pCBh-tdTomato-SV40 polyA质粒的在山羊成纤维细胞中的验证。
图3为ZFX山羊来源同源臂的扩增结果。
图4为实施例2中供体质粒的Sanger测序结果。
图5为基因打靶质粒和供体质粒共转染绵羊成纤维细胞荧光图。其中，图5中分别是转染ZFX打靶质粒和供体质粒的明场图片(左上图)、转染ZFX靶点2(ZFX-sgRNA-2)的打靶质粒(左下图)、转染表达CBh-tdTomato(在两端加入ZFX靶点2(ZFX-sgRNA-2)位点两端同源臂)的供体质粒(右上图)及转染打靶质粒和供体质粒表达(右下图)共定位的图片。
图6为基因打靶质粒和供体质粒共转染绵羊成纤维细胞流式图。
图7为PCR鉴定定点整合tdTomato基因的绵羊成纤维细胞。
图8为Sanger测序验证tdTomato阳性细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PX458载体购于Addgene质粒共享信息库。
下述实施例中的原代山羊和绵羊成纤维细胞来源于为实验室自己分离。制备方法如下：取出生2周内的山羊或绵羊少许耳组织，放入PBS中。在超净台中，将耳组织放在75％酒精中消毒1min，PBS洗3遍，用无菌的剪子将耳组织剪碎至1mm3大小，加入200μL胎牛血清，移至细胞培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中倒置放1h。小心加入完全培养基，添加时注意不要将组织块冲起。培养约1周后，从组织块爬出成纤维细胞。待长满后胰酶消化下来，扩大培养后，冻存备用。
下述实施例中的山羊ZFX基因的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NW_017189516.1的第45877351-45913094位(Update Date 16-Aug-2022)，其中第一内含子的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NW_017189516.1的第45896367-45912602位(Update Date16-Aug-2022)。
下述实施例中绵羊ZFX基因的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NC_056080.1的第22500545 -22537460位(Update Date 4-Nov-2022)，其中第一内含子的核苷酸序列可为GenBank Accession No.NC_056080.1的第22500591-22516848位(Update Date4-Nov-2022)。
下述实施例中tdTomato基因的核苷酸序列为GenBank Accession No.KT878736.1的第2529-3959位(Update Date 06-OCT-2015)。
实施例1、CRISPR/Cas9基因打靶载体的构建及效率检测
1、CRISPR/Cas9基因打靶载体构建
1.1、酶切PX458载体
酶切体系：PX458载体5μg，BbsI(纽英伦生物技术(北京)有限公司)50units，cutsmart 10μL，ddH2O补齐至100μL。37℃条件下酶切5h。酶切完成后，将酶切产物通过产物纯化试剂盒(广州美基生物科技有限公司)进行纯化，得到PX458 BbsI酶切产物。
针对山羊ZFX基因的第一内含子设计3个靶点(3对oligo)，按照表1合成靶点序列。
表1、sgRNA靶点序列
1.2、oligo退火
设计的3对oligo按照如下退火体系和退火程序进行退火，形成退火产物(双链DNA)。
退火体系：ZFX-sgRNA-F(100μM)2.5μL，ZFX-sgRNA-R(100μM)2.5μL，T4 ligasebuffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。退火程序：金属浴95℃5min，关闭金属浴，打开盖子，待其温度降至室温后取出。
1.3、连接
将上述退火产物稀释50倍，并按照如下连接体系和连接程序与步骤1.1中的PX458BbsI酶切产物进行连接。
连接体系：PX458 BbsI酶切产物90ng，退火产物(稀释后)1μL，T4 ligase 0.5μL，T4 ligase buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。连接程序：25℃反应1h。
取上述连接产物10μL用于转化，挑菌测序并质粒大提，构建得到CRISPR/Cas9基因打靶载体(即sgRNA表达载体)，分别命名为PX458-ZFX-sgRNA-1、PX458-ZFX-sgRNA-2和PX458-ZFX-sgRNA-3。
2、靶点效率的验证
2.1、细胞电转步骤
将状态良好的原代山羊成纤维细胞传到10cm培养皿中并培养至细胞汇合度为80％左右。胰酶消化收集细胞至EP管。用100μL电转液(北京英格恩生物科技有限公司，货号98668-20)悬浮，加入CRISPR/Cas9基因打靶质粒并混合均匀。放入Lonza AmaxaNucleofector 2B细胞核转染仪中，调至程序A-033，电转。电转结束后，立马加入500μLDMEM高糖培养基，37℃细胞培养箱静置10min。用含20％ FBS的完全培养基将细胞铺至6孔板中。6h后，换为含15％ FBS的完全培养基。
2.2、获得用于T7E1检测的打靶位点片段
表2、靶点引物序列
电转48h后的细胞通过基因组提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号D3018-02)提取基因组。将提取好的山羊基因组，取100ng作为模板进行PCR扩增。扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，使用表2中引物进行扩增，其各种成分分别为：DNA模板100ng，10μmol/L引物各1μL，PrimeSTAR(宝日医生物科技有限公司)25μL，用灭菌去离子水补齐至50μL。PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s(33个循环)；72℃延伸5min。PCR完成后将PCR产物通过产物回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号D2111-02)进行回收并测定浓度。
2.3、T7E1酶切
取上一步PCR回收产物，配制酶切体系如下：扩增产物500ng，cutsmart 1.1μL，ddH2O补至11.5μL。混合均匀后，按照杂交程序：95℃10min；-2℃/s降至85℃；-0.1℃/s降至25℃。加入0.5μL的T7E1(纽英伦生物技术(北京)有限公司)，37℃酶切15min，立即加入2μLLoading Buffer，配制2％的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像***观察并分析酶切后结果。
通过琼脂糖凝胶电泳图(图1)观察到，在ZFX基因靶点3个靶点，靶点1、靶点2和靶点3的***缺失效率(indel％)分别为9.3％、14.9％和10.5％，其中靶点2的***缺失效率最高(14.9％)，证明该靶点有良好的编辑活性，可以用于后续实验，sgRNA(ZFX-sgRNA-2)的靶点序列为5’-GGGATACTCATCCACCATAA-3’(SEQ ID No.1)。
针对该靶点设计的可退火形成带有粘性末端片段的单链oligo为：
ZFX-sgRNA-2-F：5’-caccGGGATACTCATCCACCATAA-3’(SEQ ID No.2)，
ZFX-sgRNA-2-R：5’-aaacTTATGGTGGATGAGTATCCC-3’(SEQ ID No.3)。
实施例2、tdTomato红色荧光蛋白供体质粒的构建
1、pCBh-tdTomato-SV40 polyA质粒的验证
pCBh-tdTomato-SV40 polyA为本实验室保存质粒，该质粒的构建过程：首先通过SpeI和XbaI双酶切pROSA26-promoter(addgene 21710)，得到酶切后的pROSA26-promoter，将SEQ ID No.4(tdTomato-SV40 polyA序列)所示的DNA分子通过无缝克隆组装技术与酶切后的pROSA26-promoter连接，得到pROSA26-tdTomato-SV40 polyA。再用KpnI和AgeI双酶切px458获得CBh启动子，按照表3中引物以pROSA26-tdTomato-SV40 polyA为模板扩增除ROSA26启动子以外的序列，通过无缝克隆组装技术，构建得到pCBh-tdTomato-SV40 polyA。
表3、pCBh-tdTomato-SV40 polyA载体构建引物序列
将该质粒脂质体转染原代山羊成纤维细胞中。将原代山羊成纤维细胞铺板至6孔板并培养至汇合度为80％左右。取两个500μL管，一管加入25μL Opti-MEM培养基和1.5μLLipofectamine 3000(赛默飞世尔科技公司)，并混合均匀，另一管加入25μL Opti-MEM培养基、500ng质粒pCBh-tdTomato-SV40 polyA和1μL P3000，混匀后室温放置15min。滴加至山羊成纤维细胞培养基中。24h观察荧光表达情况。24h后，通过荧光显微镜观察，发现有细胞在激发光的照射下，呈现明亮的红色，该结果证明构建的pCBh-tdTomato-SV40 polyA能够在山羊成纤维细胞中正常表达(图2)。
2、在质粒pCBh-tdTomato-SV40 polyA两端加上同源臂和靶点识别序列
通过荧光观察，构建的pCBh-tdTomato-SV40 polyA质粒能够在原代山羊成纤维细胞中，正常表达红色荧光。之前证明ZFX靶点2(ZFX-sgRNA-2)为高效靶点，因此以ZFX靶点2核酸酶切割的位置(PAM上游3-4bp处)两边的序列作为同源臂(山羊左同源臂为947bp，核苷酸序列为SEQ ID No.5，山羊右同源臂为924bp，核苷酸序列为SEQ ID No.6)。按照表4中引物通过PCR扩增左右同源臂后，通过PCR产物回收试剂盒(美基生物科技有限公司)回收(图3)。
表4、ZFX左右同源臂引物
酶切质粒pCBh-tdTomato-SV40 polyA，通过无缝克隆组装技术将ZFX靶点2的左右同源臂对应克隆至pCBh-tdTomato-SV40 polyA的两端，构建成质粒HA-L-CBh-tdTomato-SV40 polyA-HA-R。紧接着在左右同源臂的外侧加入ZFX靶点2的识别序列，构建HMEJ(同源臂介导的末端连接，Homology-mediated end joining)所需要的供体质粒类型，从而提高基因敲入效率，并通过Sanger测序验证。将质粒进行测序验证，Sanger测序结果证明成功构建HMEJ细胞修复所需要的供体质粒(图4)。另外构建的供体质粒上左右同源臂来源于山羊，与绵羊的对应位点有极高的同源性，通过NCBI BLAST，对比显示左同源臂的的同源性为97.90％，右同源臂的为同源性为98.70％。其中绵羊左同源臂的核苷酸序列为SEQ IDNo.7，绵羊右同源臂的核苷酸序列为SEQ ID No.8。
实施例3、定点***ZFX位点的tdTomato的稳定细胞株筛选
本实施例以tdTomato基因为例，利用实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因打靶载体PX458-ZFX-sgRNA-2和实施例2中构建的供体质粒HA-L-CBh-tdTomato-SV40 polyA-HA-R(携带外源基因tdTomato基因，尽管同源臂来源于山羊，但与绵羊对应的同源臂有很高的同源性，因此预计可用于绵羊)将外源基因(tdTomato基因)通过HMEJ方法介导的重组定点整合到ZFX基因的打靶位点(SEQ ID No.1)中，构建在ZFX基因中定点整合外源基因的绵羊成纤维细胞系。具体步骤如下：
1、基因编辑质粒和供体质粒共转染绵羊成纤维细胞
取构建好的供体质粒HA-L-CBh-tdTomato-SV40 polyA-HA-R 5000ng和携带ZFX靶点2的基因打靶载体PX458(PX458-ZFX-sgRNA-2)9536ng(摩尔比1:1.5)通过电转(电转步骤同实施例1中2.1的电转步骤，仅添加的质粒不同)至原代绵羊成纤维细胞，24h后通过流式分选tdTomato和EGFP阳性的原代绵羊成纤维细胞，并以约每皿500个细胞铺到10cm细胞培养皿中。培养2周后，通过克隆环将细胞皿中的细胞单克隆消化至96孔板中培养(图5和图6)。
2、定点整合tdTomato的绵羊成纤维细胞筛选
待96孔板的细胞克隆长满后，消化细胞，留一半原孔培养，另取一半细胞至1.5mL离心管中。12000rpm，离心3min，弃去上清，加入50μL的细胞鉴定裂解液(细胞鉴定裂解液配制：Tris-HCl(1M，PH＝8.0)2mL，Triton X-100 0.45mL，NP-40 0.45mL，蛋白酶K 0.02g，加入去离子水溶解并定容至50mL，0.22μm滤器过滤)，充分悬浮细胞，按以下程序裂解：65℃，30min；95℃，15min；16℃，∞。获得的裂解液作为DNA模版。
按照表5设计引物并进行PCR鉴定。
表5、定点整合鉴定引物
扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：DNA模板1μL，10μmol/L引物各1μL，PrimeSTAR(宝日医生物科技有限公司)10μL，用灭菌去离子水补齐至20μL。PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸50s(33个循环)；最后72℃延伸5min。PCR结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
结果显示，裂解了28个细胞单克隆，通过PCR鉴定到4个克隆为ZFX定点整合的细胞单克隆(图7，分别是克隆8、9、20和27，其中克隆8和克隆27右同源臂NHEJ方式***)，定点整合效率为14.29％。后续将克隆8、27进行Sanger测序，测序结果同样显示是定点整合到ZFX靶点(图8)。同时通过荧光显微镜观察，克隆8、9、20、27均发出红色的荧光。以上说明外源基因(tdTomato基因)在打靶位点(SEQ ID No.1)处发生了定点整合，成功构建了在ZFX基因中定点整合外源基因的绵羊成纤维细胞系。
综上结果表明，本发明成功筛选到ZFX位点的高效编辑sgRNA，并且利用该sgRNA在绵羊的X染色体上的ZFX基因位点定点整合了CBh启动子启动的tdTomato基因。整合位置为ZFX基因的第一内含子上，不影响ZFX基因的表达和功能发挥。本项发明成功地对X染色体进行标记，在XY染色体分离、性别控制、评估编辑效率等相关研究中起着重要作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.sgRNA，其特征在于，所述sgRNA靶向ZFX基因，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。
2.编码权利要求1中所述sgRNA的DNA分子。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有权利要求2所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述DNA分子的重组宿主细胞、或含有B1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有B2)所述重组载体的重组宿主细胞。
4.权利要求1所述的sgRNA，或权利要求2所述的DNA分子，或权利要求3所述生物材料的下述任一种应用：
A1)在特异性识别和/或靶向ZFX基因中的应用；
A2)在ZFX基因中定点整合外源基因中的应用；
A3)在制备ZFX基因中定点整合外源基因的细胞系中的应用；
A4)在利用基因编辑技术对绵羊或山羊X染色体进行标记中的应用；
A5)在绵羊或山羊XY染色体分离中的应用；
A6)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；
A7)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；
A8)在绵羊或山羊分子育种中的应用；
A9)在制备ZFX基因功能研究细胞模型或动物模型中的应用。
5.一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9***通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFX基因的靶点中，所述靶点的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
E1)构建表达所述sgRNA的载体；
E2)构建含有外源基因和用于与打靶位点(SEQ ID No.1)两端同源重组的同源臂的供体质粒；
E3)将E1)所述载体和E2)所述供体质粒共转染受体细胞。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述外源基因为报告基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述报告基因为tdTomato基因。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于，所述受体细胞为绵羊成纤维细胞或山羊成纤维细胞。
10.由权利要求5-9中任一所述方法构建得到的细胞系，和/或，所述细胞系的下述任一应用：
C1)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；
C2)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；
C3)在绵羊或山羊分子育种中的应用；
C4)在制备ZFX基因功能研究细胞模型或动物模型中的应用。
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