CN116474095A - 小g蛋白rbj的抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

提供了小G蛋白RBJ的抑制剂的应用，其可用于提供或提高肿瘤免疫治疗效果。具体而言，本文提供了对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质在制备用于肿瘤免疫治疗或辅助治疗的产品中的应用。本文还提供了测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平的试剂在制备评估该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后和/或选择肿瘤免疫治疗方案的试剂盒中的应用。本文为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点和途径。

Description

小G蛋白RBJ的抑制剂的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及小G蛋白RBJ的抑制剂的应用。

背景技术

随着人口增长、经济发展及社会竞争压力增加，恶性肿瘤正逐步成为全球性的重大健康问题，并呈现年轻化、普遍化的趋势，对人民健康及社会发展都造成极大影响。因此，肿瘤的预防与控制已成为全球卫生防控的重点。根据肿瘤学领域权威期刊《临床肿瘤杂志》发布的最新数据，2018年全球癌症患者新增1810万，死亡人数达960万。癌症已超过心血管疾病成为21世纪全球范围内最主要的死亡原因。(Siegel RL等,Cancer statistics,2018.CA Cancer J Clin.2018；68(1):7-30.)。

T细胞介导的抗肿瘤免疫在宿主防御癌症中起着核心作用。然而，癌细胞却可以与肿瘤免疫微环境共同进化，并发展出不同的策略来逃避T细胞的免疫监视。肿瘤浸润性T细胞由于表达各种T细胞抑制性信号，如细胞毒性淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)等，往往表现为效应功能受损(即杀伤功能障碍)，无法有效清除癌细胞(Jiang,P等，Signatures of T cell dysfunction andexclusion predict cancer immunotherapy response.Nat.Med.2018；24,1550–1558.)。因此，肿瘤免疫治疗，尤其是免疫检查点阻断(immune-checkpoint blockades，ICBs)疗法与CAR-T细胞疗法被越来越广泛地应用于临床，它们能显著提高各类肿瘤患者的生存期。其中，针对CTLA-4与PD-1/PD-L1信号轴的ICBs通过解除肿瘤细胞对免疫***的抑制作用，重新激活T细胞信号通路以识别肿瘤表面抗原，进而发挥杀伤肿瘤的功能。

然而，仍有临床结果表明不同患者对于ICB的响应性呈现明显的个体差异。虽然大多数肿瘤细胞中均可检测出基因突变，但是与此同时又存在大量获得基因突变的细胞只经历终末分化、衰老甚至死亡却不发展为肿瘤细胞。因此，科学家们意识到细胞的命运不仅依赖于遗传改变(如，原癌基因、抑癌基因激活或失活)或表观遗传调控(如，DNA甲基化、组蛋白修饰)，还涉及染色质不稳定性与DNA修复缺陷。

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类与II类分子均能将肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原呈递至T细胞以启动适应性免疫应答。由于大多数肿瘤发生的原因是基因突变而非致瘤病毒，因此突变产生的新抗原越多即肿瘤新抗原负荷越高，MHC与T细胞受体相互作用以杀伤肿瘤细胞的几率越大，使用ICBs治疗产生的免疫应答就越强烈，疗效越好(Schumacher TN等，Neoantigens in cancerimmunotherapy.Science；2015,348(6230):69-74.)。但当肿瘤细胞中肿瘤细胞特异性MHC-I/II(Tumor-specific MHC-I/II，tsMHC-I/II)、抗原加工过程中的蛋白酶体、转运蛋白、β-2-微球蛋白功能缺陷或低表达时，易造成免疫***识别障碍，往往表现为病人患肿瘤年龄更小、抗肿瘤能力更弱，即使使用ICBs阻断其中一种免疫逃逸机制，肿瘤细胞仍可能通过其他途径逃避免疫监视(Marty Pyke R等，Evolutionary Pressure against MHC Class IIBinding Cancer Mutations.Cell；2018,175(2):416-428e413.)。也就是说，ICBs对于高免疫原性的“热”肿瘤治疗效果较好，而对低免疫原性的“冷”肿瘤治疗效果不好。

此外，肿瘤内异质性、肿瘤免疫抑制性微环境、适应性免疫***识别障碍或干扰素表达水平异常等均会导致患者对于免疫治疗无响应。尤其是肿瘤异质性使得肿瘤对阻断单个通路的靶向治疗具有耐药性，因此联合应用多种治疗方法可有效抑制代偿，减少耐药性的发生，协同增强抗肿瘤效果。寻找协同ICB等免疫疗法提高肿瘤治疗效果的策略迫在眉睫。

小G蛋白(small G proteins)是指分子量约20-30kDa的单亚基G蛋白。目前根据其一级结构的同源性，可以将其分成五个家族，包括Ras、Rab、Rho、Arf、和Ran等五个主要的家族。本研究团队在1998年从人树突状细胞cDNA文库中通过大规模测序自主发现了一个小G蛋白分子(GenBank No.AF178983)，含有两类蛋白的特征性功能域：其氨基端含有与Rab蛋白分子同源性较高的GTP结合和GTP酶活性的功能域；其羧基端含一个约70氨基酸残基的J功能域。该分子最初命名为RabJ，后来通过进一步分析发现其可能是一个新的小G蛋白分子家族，被命名为RBJ(也叫做RJL、DnaJC27)。

本研究团队的既往研究表明，RBJ可以在肿瘤细胞核内通过直接锚着MEK/ERK，促进磷酸化MEK/ERK的积累并延长活化时间，从而促进肿瘤发生与发展(Cancer Cell.2014；25:682-96)。当抑制RBJ的表达时，可显著抑制结肠癌细胞的增殖、集落形成及体内的肿瘤生长能力，并且可以促进结肠癌细胞对MEK1/2抑制剂CI-1040的敏感性，提示RBJ可能作为针对肿瘤细胞本身的治疗靶标。然而，目前靶向RBJ的分子对于肿瘤免疫治疗，尤其是对与肿瘤微环境而非肿瘤细胞本身以及其对于其他抗肿瘤药物的促效甚至于协同作用，尚未见报道。

综上所述，本领域中仍然存在针对肿瘤免疫治疗药物或提高已有抗肿瘤药物效果的迫切需求。

发明内容

本文提供了对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质在肿瘤免疫治疗和预后中的应用。

在本文的一些方面中，提供了对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质在制备用于肿瘤免疫治疗或辅助治疗的产品中的应用。

在本文的一些方面中，提供了肿瘤免疫治疗或辅助治疗的方法，其包括给予有需要的对象对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质。

在本文的一些方面中，提供了对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质，其用于肿瘤免疫治疗或辅助治疗。

在一些实施方式中，小G蛋白RBJ选自：由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码的分子，或其同源序列、变异体或修饰形式。

在一些实施方式中，所述小G蛋白RBJ选自例如：

(a)由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码的蛋白质或其同源序列；

(b)AAF44347.1所示的氨基酸序列或其同源序列；或

(c)在(a)和(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有促肿瘤作用的衍生蛋白质或多肽。

在一些实施方式中，小G蛋白RBJ的编码分子选自：具有AF178983所示人RBJ基因序列的分子，其CDS序列，在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，且其中所述基因的表达对肿瘤的发生和发展具有促进作用。

在一些实施方式中，对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质选自：抑制RBJ表达和/或功能的物质，优选特异性靶向RBJ的物质.

在一些实施方式中，针对RBJ或其编码序列的：抗RBJ的抗体(优选单克隆抗体)、siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、基因敲除或敲减工具(例如用于其CRISP/Cas敲除的gRNA)、拮抗或阻断化合物。

在一些实施方式中，对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质选自例如：选自如下序列的siRNA：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；选自如下序列的gRNA：SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6。

在一些实施方式中，对象为哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物等，优选人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴.

在一些实施方式中，肿瘤选自：肺癌(如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、肝癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。

在一些实施方式中，本文的产品与一种或多种其他肿瘤免疫治疗药物组合，例如肿瘤疫苗、过继细胞免疫治疗、靶向T细胞的免疫调节药物、免疫检查点抑制剂(ICI)。

在一些实施方式中，其他肿瘤免疫治疗药物为PD1/PDL1抑制剂，如PD1抗体。在一些实施方式中，其他肿瘤免疫治疗药物为帕博利珠单抗。

在一些实施方式中，本文产品的形式适于选自下组的给予途径：经胃肠给予、非经胃肠给予，例如经静脉、黏膜、鼻腔、腹腔内、颅内、瘤内、舌下、颊部、透皮(如离子导入)等方式给予。例如可通过选自下组的途径给予：脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法以及复制缺陷腺病毒携带目的DNA法。

在一些实施方式中，本文产品选自：药物、试剂盒、医疗设备、或它们的组合。

在本文的一些方面中，提供了测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平的试剂在制备评估该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后和/或选择肿瘤免疫治疗方案的试剂盒中的应用。

在本文的一些方面中，提供了评估对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后和/或选择肿瘤免疫治疗方案的方法，其包括测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平，若该水平高于对照水平则表明该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后不良或所用肿瘤免疫治疗方案不佳；反之，则应答和/或预后和/或免疫治疗方案较佳。

在一些实施方式中，对照水平选自：该对象的癌旁样品、正常组织、治疗前样品或非癌对象样品的RBJ水平。

在本文的一些方面中，提供了测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平的试剂，其用于评估该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后。

在一些实施方式中，所述样品选自对象的肿瘤组织、肿瘤细胞。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：抑制RBJ基因表达可促进人与小鼠肿瘤细胞系中内源性逆转录病毒的产生及干扰素信号通路的活化。

A：使用干扰RNA抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)中RBJ基因的表达；

B：使用CRISPR/Cas9***敲除小鼠黑色素瘤细胞系(B16-F10)中的RBJ基因。

图A、B均为实时荧光定量PCR分析(“*”，P<0.05；“**”，P<0.01；“***”，P＜0.0005；“****”，P＜0.0001)。

图2：使用干扰RNA抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)中RBJ基因的表达可广泛激活I型干扰素通路相关基因集。

A：转录组测序分析中差异表达基因的火山图结果，左侧和右侧分别表示降低和升高的基因；

B：基于特征性基因集的分析结果；

C：针对siRBJ组和siNC组的差异基因(P＜0.05)进行GO分析的结果。其中横坐标表示基因集的规模，数值越大则差异基因集的规模越大；纵坐标为差异程度较高的15个通路；圆点的大小表示该通路中富集的基因数量，圆点越大表示富集的差异基因越多。

图3：抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)中RBJ的表达可导致炎症因子与免疫抑制性趋化因子的分泌显著减少。

A：ELISA分析(“**”，P<0.01)；

B：CBA分析(“*”，P<0.05；“**”，P<0.01)。

图4：Rbj基因敲除的黑色素瘤细胞荷瘤小鼠经PD1抗体治疗后可进一步显著抑制肿瘤细胞生长，延长小鼠生存期。

A：肿瘤生长曲线图；

B：小鼠生存期曲线图。

(“***”，P＜0.0005；“****”，P＜0.0001)。

图5：Rbj基因敲除的黑色素瘤细胞荷瘤小鼠经PD1抗体治疗的肿瘤微环境与免疫器官中的效应性细胞增多、免疫抑制性细胞减少，PD1抗体的免疫治疗效果进一步增强。图为流式细胞仪分析统计图(“*”，P<0.05；“**”，P<0.01；“***”，P＜0.0005；“****”，P＜0.0001)。

图6：Rbj基因敲除的黑色素瘤细胞荷瘤小鼠经PD1抗体治疗后血清中IL-6分泌水平显著降低。图为ELISA分析统计图(“****”，P＜0.0001)。

图7：经PD1抗体治疗的非小细胞肺癌肿瘤组织中RBJ分子的表达与患者免疫治疗效果及预后的相关性分析。

A：非小细胞肺癌患者肿瘤组织样本中RBJ蛋白染色强度示意图。

B：肿瘤细胞RBJ表达水平与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线。

C：肿瘤细胞RBJ表达水平与患者无病生存时间的Kaplan-Meier生存曲线。

D：肿瘤细胞RBJ表达水平与肿瘤组织样本中效应性与抑制性细胞浸润程度的相关性分析及统计图(“**”，P<0.01；“****”，P＜0.0001)。

具体实施方式

本申请中首次证明了RBJ与肿瘤微环境和免疫治疗的相关性，并提供了RBJ抑制物在肿瘤免疫治疗中的作用及其对抗肿瘤药物的促效甚至于协同作用。本申请中还提供了通过RBJ水平对肿瘤免疫治疗效果及预后进行预期的方法。

具体而言，为探究肿瘤细胞内在表达的RBJ是否能够通过影响肿瘤的免疫原性或肿瘤免疫抑制性因素影响肿瘤微环境(TME)中肿瘤免疫应答的效应，进而增强ICB疗法的抗肿瘤效果，使得无应答者(non-responder)变为有应答者(responder)、甚至于高应答者，发明人进行了细致而深入的研究，并获得了如下结果：

1.体外实验显示抑制RBJ表达能提高肿瘤细胞的免疫原性

在多种人肿瘤细胞系中，用干扰RNA(siRNA)抑制RBJ的表达均可显著促进内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses，ERVs)的表达与I型干扰素信号通路的活化。在利用CRISPR/Cas9方法进行Rbj敲除的小鼠肿瘤细胞系中同样得到了一致结果。

对使用干扰RNA(siRNA)、敲除等方法抑制RBJ表达的人或小鼠肿瘤细胞系进行转录本测序分析，结果均显示RBJ对干扰素刺激基因的表达存在广泛的抑制作用，且差异基因主要富集于I型干扰素信号通路相关基因集。

此外，通过ELISA实验检测了抑制RBJ后肿瘤细胞培养上清中细胞因子的水平，发现炎症性因子IL-6、趋化因子CCL5与CCL2的分泌明显减少。

以上结果提示RBJ可能抑制肿瘤免疫原性。

2.体内实验显示抑制RBJ表达可能提高肿瘤细胞的免疫原性，抑制免疫抑制性肿 瘤微环境形成，并对免疫治疗具有协同作用

我们在实验动物体内实验中观察到Rbj敲除后的肿瘤细胞生长受到显著抑制，小鼠生存期延长，脾脏肿大的情况被缓解。

进一步通过流式分析发现抑制RBJ后，肿瘤微环境与免疫器官(如脾脏、***)中的效应性细胞(CD8+T细胞、CD4+T细胞)增多，同时免疫抑制性细胞(Treg、MDSC、PD1+T细胞)减少，血清中分泌的IL-6水平降低，提示了抑制RBJ后可能阻碍了肿瘤细胞对于免疫抑制性细胞的招募。这种效应性细胞增多而抑制性细胞减少的现象，对于提高免疫治疗效果至关重要。

进一步使用免疫检查点抑制剂(PD1抗体)对皮下注射Rbj^+/+或Rbj^-/-肿瘤细胞的小鼠进行免疫治疗，结果发现皮下注射Rbj^+/+肿瘤细胞的小鼠在使用PD1抗体进行治疗后，肿瘤体积减小，免疫器官效应性细胞增多而抑制性细胞减少；而注射Rbj^-/-肿瘤细胞的小鼠在使用PD1抗体进行治疗后，与注射Rbj^+/+肿瘤细胞的小鼠治疗后相比，肿瘤大小进一步减小，免疫器官效应性细胞进一步增多而抑制性细胞进一步减少。以上表明靶向RBJ抑制其表达可协同增强ICB疗法的抗肿瘤效果。

3.临床肺癌标本研究显示RBJ低表达的高肿瘤细胞免疫原性增加，对免疫治疗具 有响应性

我们在非小细胞肺癌患者的肺部穿刺样本中对RBJ的表达进行检测，并根据表达量进行分组。结果发现RBJ低表达的患者样本中CD8+T细胞浸润增多，Treg减少，免疫原性增强，对PD1抗体免疫治疗反应性更强，这与体内实验结论一致。

综上所述，申请人发现了抑制肿瘤细胞内在表达的RBJ可通过增强肿瘤的免疫原性，抑制免疫抑制性肿瘤微环境形成，协同增强免疫治疗的抗肿瘤效果，具有重要的临床转化意义与前景。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

RBJ基因及其编码的蛋白质(多肽)

如本文所用，术语“RBJ基因”、“RBJ编码分子/序列”或“RBJ蛋白编码分子/序列”可互换使用，均是指一种编码本文所述的RBJ蛋白或多肽的序列。术语“编码分子”和“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本文所述RBJ基因可选自例如：AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列、在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对肿瘤的发生和发展具有一定促进作用。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的RBJ基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的RBJ基因优选获自人，获自其它动物的与人RBJ基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

如本文所用，术语“RBJ(多肽)”、“RBJ蛋白(多肽)”、“RBJ”可互换使用，是一种小G蛋白家族成员，其可存在于例如外周血单核细胞来源的树突状细胞中，其主要特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域：N端和中间的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、中间的Rab样功能域和C端的J功能域，并与Ras家族分子有较高同源性。RabJ的核苷酸序列和氨基酸序列以及制法也可参见中国专利申请CN01126826.3。

RBJ蛋白可为由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码，也可为其具有相同促肿瘤作用的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得RBJ的同源序列)、变异体或修饰形式。

例如，RBJ蛋白可选自例如：(a)由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码的蛋白质或其同源序列；(b)AAF44347.1所示的氨基酸序列或其同源序列；或(c)在(a)和(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有促肿瘤作用的衍生蛋白质或多肽。

应理解，本文所涉及的RBJ蛋白优选获自人，获自其它动物的与人RBJ蛋白高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它RBJ蛋白也在本发明优选考虑的等同范围之内。

RBJ蛋白或其编码序列的抑制剂

本申请中涉及RBJ或其编码序列的“抑制剂”。如本文所用，术语“抑制剂”、“抑制物”、“RBJ或其编码序列的抑制剂/物”或“对小G蛋白RBJ具有抑制作用的物质”可互换使用，是指可降低或甚至于消除RBJ蛋白或其编码序列的水平或活性的物质。

RBJ抑制剂可在各种层次上对RBJ进行调控，例如基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和/或翻译后水平。在一些实施方式中，RBJ抑制剂包括但不限于，针对RBJ或其编码序列的：抗体、siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、基因敲除工具(例如用于其CRISP/Cas敲除的各种手段和gRNA等)、化学小分子拮抗剂或阻断剂等。广义而言，该术语还包括可降低RBJ水平或活性的各种手段，例如基因干扰、基因沉默、以及利用翻译后修饰或表观遗传调控手段等在基因转录和翻译后水平进行表达抑制、通过酶活性抑制剂抑制GPT酶功能等。

可根据RBJ的序列和结构特征设计和获得其特异性抑制剂，例如设计并获得针对RBJ基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸；用于CRISP/Cas的gRNA等；筛选并获得针对RBJ蛋白的抗体等。

在一些实施方式中，可采用针对RBJ的siRBJ分子，其可选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2或其衍生分子。在一些实施方式中，可采用针对RBJ的gRNA以通过CRISP/Cas操作敲除Rbj基因，所述gRNA可具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。在一些实施方式中，可采用常规方法获得针对RBJ的单克隆抗体或其衍生物，例如针对RBJ的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体片段、多价抗体等。

可采用常用网站、数据库、供应商或本领域已知的方法来设计和/或获得RBJ抑制剂，并验证其效果。

根据本申请的内容，RBJ抑制剂可通过对RBJ的抑制来增强肿瘤的免疫原性，抑制免疫抑制性肿瘤微环境形成，增强免疫治疗的抗肿瘤效果(甚至于产生协同治疗效果)。

本文所用的术语“协同效应”指1种或多种肿瘤治疗剂和本公开的至少一种RBJ抑制剂联合作用以产生大于所给予各药物自身所得效果的简单叠加。协同效应能够用合适方法算出，如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe叠加性方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.PatholPharmacol.114:313-326(1926))和中效方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.EnzymeRegul.22:27-55(1984))。上述的各方程能应用于实验数据以产生对应图，从而协助评价药物组合效果。与上面所提方程相关的对应图分别是浓度-效应曲线、等效应图曲线和联合指数曲线。

药物、药物组合物或试剂盒

本文还提供了一种药物、药物组合物或试剂盒，其中含有有效量的本发明的RBJ或RBJ编码序列的抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”，是指RBJ蛋白或RBJ基因或其前体的抑制剂，以及与该抑制剂一起发挥抗肿瘤作用的其他药物。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的组合物中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

所用RBJ蛋白或基因抑制剂等活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸DNA或者蛋白质注射法；(2)将RBJ的cDNA、mRNA和蛋白质的抑制剂与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)DNA、RNA和蛋白质类活性抑制剂与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹DNA、RNA和蛋白质活性物质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)将DNA、RNA和蛋白质活性物质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将RBJ抑制剂相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将DNA、RNA和蛋白质导入靶细胞。

此外，本文的组合物中还可含有用于肿瘤治疗的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组：临床常用抗肿瘤药物、PD1/PDL-1途径抑制剂(例如PD1抗体)。

本文的RBJ相关的抑制剂可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于肿瘤免疫预防和治疗。

肿瘤免疫治疗应答和/或预后评估以及方案选择

在本文的一些方面中，提供了测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平的试剂在制备评估该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后的试剂盒中的应用。

在本文的一些方面中，提供了评估对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后的方法，其包括测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平，若该水平高于对照水平则表明该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后不良；反之，则应答和/或预后较佳。

该方法可包括，例如：(a)检测对象生物样本中的RBJ的表达量；(b)将(a)中检测到的RBJ表达量与正常对照值进行比较；(c)得到的检测结果显示生物样品中的RBJ分子的水平高于正常对照的，则提示所述生物样品的对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后不良和/或不适于采用所用免疫治疗方案进行肿瘤治疗；反之，则表明对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后较佳和/或适于采用所用免疫治疗方案进行肿瘤免疫治疗。

在一些实施方式中，对照水平选自：该对象的癌旁样品、正常组织、治疗前样品或非癌对象样品的RBJ水平。在本发明的一些实施方式中，检测RBJ的DNA水平、mRNA水平和/或蛋白质水平。在本发明的一些实施方式中，通过如下方法中的一种或多种来检测RBJ水平：免疫组化法、化学发光法、放射性同位素法、荧光发光法(如免疫荧光法)、酶标法、胶体金法、实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、蛋白质印迹法。

如本文所用，术语“宿主细胞”或“非肿瘤细胞”可互换使用，可包括肿瘤微环境中的非肿瘤细胞，例如包括但不限于：怀疑发生肿瘤转移组织中的细胞、肿瘤转移高风险组织中的细胞、已发生肿瘤转移组织中的细胞、已建立转移灶中的细胞或它们的组合，如肺上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞。从另一角度而言，所述非肿瘤细胞选自：肿瘤侵袭微环境中的细胞、转移微环境中的细胞、肿瘤转移前微环境中的细胞或它们的组合。

“肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)”是指肿瘤存在的细胞环境，主要由肿瘤细胞以及肿瘤相关细胞(非肿瘤细胞)组成，其可包括周围血管、血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、炎性细胞、免疫细胞等，肿瘤微环境包括肿瘤原位微环境、侵袭微环境以及转移微环境(可例如参见Hanahan,D.和Weinberg,R.A.，Hallmarks of cancer:the nextgeneration.Cell.2011；144：646-674)。肿瘤与其微环境密切相关并始终存在相互作用。

如本文所用，术语“检测试剂”是指特异性针对RBJ分子，且可用于直接或间接检测出该分子的存在和/或含量的试剂。

由于RBJ分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对RBJ分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对RBJ分子具有检测特异性的抗体、探针、基因芯片或蛋白质芯片。

为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。

如本文所用，术语“检测产品”是指包含检测生物样品中RBJ的物质的、可用于预测对象中肿瘤免疫治疗应答和/或评估对象肿瘤免疫治疗预后和/或选择肿瘤免疫治疗方案的产品。本发明的产品包括但不限于：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测笔、检测仪器或它们的任意组合。本发明的产品还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：抑制RBJ基因表达对人与小鼠肿瘤细胞系中内源性逆转录病毒 (endogenous retroviruses，ERVs)表达与I型干扰素信号通路活化的促进作用

(A)用针对RBJ的干扰RNA(siRBJ)及阴性对照(siNC)转染(转染试剂Lipofectamine RNAiMAX购自Invitrogen公司，转染试剂稀释液Opti-MEM购自Gibco公司)人非小细胞肺癌细胞系A549(购自ATCC细胞库)，8小时后更换新鲜培养基，继续培养24小时后收集细胞，抽提总mRNA(总RNA极速抽提试剂盒购自飞捷上海生物计数有限公司)后反转录(反转录试剂盒购自TAKARA公司)，将获得的cDNA进行RT-qPCR分析(实时荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司)。siRNA干扰后肿瘤细胞的实时荧光定量PCR结果及统计学分析如图1A所示。

针对RBJ的干扰(siRBJ)及阴性对照(siNC)购自Genephama公司，具体序列如下：

siRBJ序列：

5'-GCAGUGAAGAUGCCUUCAATT-3'(顺义，SEQ ID NO:1)；

5'-UUGAAGGCAUCUUCACUGCTT-3'(反义，SEQ ID NO:2)。

siNC序列：

5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(顺义，SEQ ID NO:3)；

5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反义，SEQ ID NO:4)。

(B)以Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector为基础(spCas91.1/sgRNA构建试剂盒购自北京唯尚立德生物科技有限公司)构建靶向Rbj的sgRNA(Rbj sg，源自CRISPOR(tefor.net)在线设计网站，由生工合成)表达载体(Cas9/gRNA-Rbj-sg)，具体序列如下：

Rbj sg序列：

5'-AAACACCGCCCCACTTCGGCGTTGCCCA-3'(顺义，SEQ ID NO:5)；

5'-CTCTAAAACTGGGCAACGCCGAAGTGGGG-3′(反义，SEQ ID NO:6)。

以小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10为基础，转染Cas9/gRNA-Rbj-sg(转染试剂X-tremeGENE购自Roche公司，转染试剂稀释液Opti-MEM购自Gibco公司)，24h后向培养基中加入嘌呤霉素(3μg/mL，购自Thermo)，持续筛选一周，至对照组细胞全部死亡，计数5000个具有嘌呤霉素抗性的细胞铺至10cm皿中，待单个细胞形成克隆时，挑取单克隆进行培养及鉴定。

提取细胞克隆的基因组，在各靶标位置上下游约300bp处设计引物，进行片段扩增测序，将其与野生型DNA片段进行比对：

上游引物：

5’-GCTGGCTGGGTGCGTAAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物：

5’-TGCTCTGGTGGTGGGAACAT-3’(SEQ ID NO：8)。

进一步利用Western印迹法进行鉴定，无RBJ表达者即为敲除细胞系。

收集成功敲除Rbj的细胞(Rbj sg)与对照组细胞(Ctrl sg)，抽提总mRNA(总RNA极速抽提试剂盒购自飞捷上海生物计数有限公司)后反转录(反转录试剂盒购自TAKARA公司)，将获得的cDNA进行RT-qPCR分析(实时荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司)。敲除Rbj肿瘤细胞的实时荧光定量PCR结果及统计学分析如图1B所示。

结果显示：与对照组相比，不论是经RNA干扰(图1A)或经CRISPR/Cas9技术敲除Rbj基因(图1B)的B16-F10细胞均可显著促进ERV家族基因(如Ervl、MusD、Line1)mRNA及I型干扰素信号通路相关基因(如Ifnα、Ifnb、Isg15、Oasl)mRNA水平。

上述结果表明：抑制RBJ基因表达可促进人与小鼠肿瘤细胞系中内源性逆转录病毒的产生及干扰素信号通路的活化。

实施例2：使用干扰RNA抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)中RBJ基因的表达可广 泛激活I型干扰素通路相关基因集

使用针对RBJ的干扰RNA(siRBJ)及阴性对照(siNC)转染人非小细胞肺癌细胞系A549(制备方法同实施例1)，8小时后更换新鲜培养基，继续培养24小时后收集细胞，并冻存于Trizol(购自Invitrogen公司)中。后续进行转录组测序与分析(交由南京派诺森基因科技有限公司完成)，如图2所示(差异表达基因P＜0.05)。

结果显示：与对照组相比，抑制A549中RBJ基因表达后大量干扰素刺激基因(ISGs，如ISG15、MX1、IFIT1、OASL等)的表达显著上调(图2A)；基于特征性基因集分析显示，抑制A549中RBJ基因表达后，RIG-I样受体信号通路与NOD样信号受体基因集发生显著上调(图2B)；抑制A549中RBJ基因表达后，大量差异基因主要富集于I型干扰素信号通路、抗病毒信号通路等生物学过程(图2C)。

上述结果表明：Rbj基因缺失对I型干扰素通路相关基因表达存在广泛促进作用。

实施例3：使用干扰RNA抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)中RBJ基因的表达可抑 制炎症因子与免疫抑制性趋化因子的分泌

使用针对RBJ的干扰RNA(siRBJ)及阴性对照(siNC)转染人非小细胞肺癌细胞系A549(制备方法同实施例1)，8小时后更换新鲜培养基，继续培养24小时后收集细胞培养上清，用ELISA试剂盒(购自Biolegend)检测炎性因子IL-6的分泌情况，用CBA检测试剂盒(购自BD pharmingen公司)检测免疫抑制性细胞因子(CXCL2、CXCL5)的分泌情况。

酶标仪检测的吸光度值与流式细胞仪检测的平均荧光强度值分别如图3A和图3B所示。

结果显示：与对照组相比，使用干扰RNA抑制人非小细胞肺癌细胞系(A549)可导致IL-6、CXCL2与CXCL5的分泌显著减少。

该结果表明：抑制肿瘤细胞中RBJ的表达可导致肿瘤细胞分泌炎症因子与免疫抑制性细胞因子的水平显著降低，提示抑制RBJ可抑制肿瘤细胞对免疫抑制性细胞的招募。

实施例4：抑制肿瘤细胞中RBJ的表达可显著增加免疫微环境中效应性细胞抑制荷 瘤小鼠体内肿瘤的生长，延长小鼠生存期

构建敲除Rbj的B16-F10细胞系(Rbj sg，同实施例1)。将5x10⁵个B16-F10对照组细胞(Ctrl sg)或敲除组细胞(Rbj sg)皮下注射入小鼠(8周雌性SPF级C57BL6小鼠，购自Sipper BK公司)右侧背部。每2-3天测量肿瘤大小，并动态观察小鼠生存期。小鼠PD1抗体(购自BioXcell公司，货号BE0273)与同型对照IgG2a抗体(购自BioXcell公司，货号BE0089)作为治疗组与对照组药物在小鼠荷瘤后第12、14、16、18天，分别使用腹腔注射的方法对小鼠进行治疗，每次注射量为100μg/只小鼠。荷瘤后第24天取小鼠脾脏、***、肿瘤组织进行单细胞消化及流式分析(消化用胶原酶购自Gibco公司，流式抗体均购自Biolegend公司)，同时使用眼球取血法收集小鼠血清，用ELISA试剂盒(购自Biolegend公司)检测血清中IL-6的水平。

小鼠肿瘤体积生长曲线结果如图4A所示，小鼠生存率的结果如图4B所示。对小鼠免疫器官及免疫微环境中的免疫细胞组成成分进行流式分析的结果如图5所示。对小鼠血清中IL-6分泌水平的ELISA检测结果如图6所示。

结果显示：Rbj^-/-肿瘤细胞与对照组(正常表达RBJ)相比，肿瘤生长受到显著抑制，小鼠生存期延长；肿瘤微环境与免疫器官(如***)中的效应性细胞(CD8+T细胞、CD4+T细胞)增多，同时免疫抑制性细胞(Treg、MDSC)减少；血清中分泌的炎症因子IL-6水平降低。使用抗小鼠PD1抗体(BioXcell)对两组小鼠分别进行治疗，发现注射Rbj^-/-肿瘤细胞的小鼠在使用PD1抗体进行治疗后，对照组小鼠治疗后相比，肿瘤大小进一步减小，生存期进一步延长(图4)；肿瘤微环境与免疫器官中的效应性细胞进一步增多、免疫抑制性细胞进一步减少(图5)；血清中IL-6的分泌进一步减少(图6)。

上述结果表明：抑制肿瘤细胞中RBJ的表达能够增强(甚至于协同增强)PD1抗体的抗肿瘤效果，显著抑制肿瘤生长并提高小鼠生存率。表现在可进一步诱导免疫器官与肿瘤微环境中的效应细胞增多、免疫抑制性细胞减少，重塑肿瘤微环境，抑制血清中IL-6的分泌，减少肿瘤细胞对免疫抑制性细胞MDSC的招募，因此进一步增强PD1抗体的免疫治疗疗效。

实施例5：非小细胞肺癌组织中RBJ分子的表达与患者免疫治疗预后的相关性分析

选取2020年至2021年20例使用帕博利珠单抗(抗PD1抗体)进行免疫治疗的非小细胞肺癌患者(组织切片来自上海长海医院医院)，患者在手术前未接受化疗及放疗。所有患者均签署知情同意书。

采用免疫组化方法，利用实施例5中的试剂盒针对该20例非小细胞肺癌患者免疫治疗前的肿瘤组织中RBJ蛋白的表达进行了染色(图7A)；RBJ表达与患者总生存率(OS，图7B)及无病生存时间(PFS，图7C)的相关性。并采用多色免疫荧光实验(多色免疫荧光试剂盒购自PerkinElmer公司)对该20例非小细胞肺癌患者免疫治疗前的肿瘤组织中CD8+T细胞与Treg细胞的特征性标志物(抗体均购自CST公司)进行了染色与统计学分析(图7D)。

免疫组化评分标准：评分由两位经验丰富的临床病理医生独立进行，取平均值。采用乘法快速评分法(multiplicative quickscore method，QS)评估RBJ蛋白的表达。这个评分***同时评估了细胞染色的强度和范围。首先对阳性细胞比例进行估计，并按1-6级给予评分(1＝1-4％、2＝5-19％、3＝20-39％、4＝40-59％、5＝60-79％、6＝80-100％)。阳性染色细胞的平均强度评分为0-3级(0＝阴性；1＝弱表达，2＝中表达，3＝强表达)。然后将百分比分数乘以强度分数来计算QS，从而得到评分(0<QS<18)。根据QS，RBJ表达分级为低(0-9)或高(10-18)。

结果显示，接受PD1抗体治疗的非小细胞肺癌患者，与肿瘤组织中RBJ高表达患者相比，RBJ低表达患者总生存率(OS)和无病生存时间(PFS)显著降低(图7A、B)，肿瘤样本中CD8⁺T细胞浸润增多(图7C)，PD1⁺T细胞数量减少(图7D)。

上述结果表明，低表达RBJ的肿瘤细胞免疫原性更好，患者对PD1抗体免疫治疗反应性更强，具有更好的预后与无病生存时间。因此，抑制肿瘤组织中RBJ的表达可协同PD1抗体增强机体抗肿瘤应答，提高免疫治疗的疗效，而患者RBJ水平的高低也可用于肿瘤免疫治疗效果的预期、预后判断。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 小G蛋白RBJ的抑制剂的应用

<130> 220226 1CNCN

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcagugaaga ugccuucaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

uugaaggcau cuucacugct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaacaccgcc ccacttcggc gttgccca 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctaaaact gggcaacgcc gaagtgggg 29

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctggctggg tgcgtaag 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgctctggtg gtgggaacat 20

Claims (10)

1.对小G蛋白RBJ或其编码分子或其形成具有抑制作用的物质在制备用于肿瘤免疫治疗或辅助治疗的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述小G蛋白RBJ选自：由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码的分子，或其同源序列、变异体或修饰形式；

例如，选自：

(a)由AF178983所示人RBJ基因序列或其CDS序列编码的蛋白质或其同源序列；

(b)AAF44347.1所示的氨基酸序列或其同源序列；或

(c)在(a)和(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有促肿瘤作用的衍生蛋白质或多肽。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述小G蛋白RBJ的编码分子选自：具有AF178983所示人RBJ基因序列的分子，其CDS序列，在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，且其中所述基因的表达对肿瘤的发生和发展具有促进作用。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质选自：抑制RBJ表达和/或功能的物质，优选特异性靶向RBJ的物质；

例如，所述物质选自：针对RBJ或其编码序列的：抗RBJ的抗体(优选单克隆抗体)、siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、基因敲除或敲减工具(例如用于其CRISP/Cas敲除的gRNA)、拮抗或阻断化合物。

5.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质选自下组：

选自如下序列的siRNA：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

选自如下序列的gRNA：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

6.如权利要求1所述的应用，其中，所述对象为哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物等，优选人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴；和/或

所述肿瘤选自：肺癌(如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、肝癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。

7.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品与一种或多种其他肿瘤免疫治疗药物组合，例如肿瘤疫苗、过继细胞免疫治疗、靶向T细胞的免疫调节药物、免疫检查点抑制剂(ICI)，例如PD1/PDL1抑制剂(如PD1抗体，帕博利珠单抗)。

8.如权利要求1所述的应用，其中，在一些实施方式中，所述药物或辅助药物的形式适于选自下组的给予途径：经胃肠给予、非经胃肠给予，例如经静脉、黏膜、鼻腔、腹腔内、颅内、瘤内、舌下、颊部、透皮(如离子导入)等方式给予。例如可通过选自下组的途径给予：脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法以及复制缺陷腺病毒携带目的DNA法；和/或

所述产品选自：药物、试剂盒、医疗设备、或它们的组合。

9.测定获自对象的样品中小G蛋白RBJ水平的试剂在制备评估该对象对肿瘤免疫治疗的应答和/或预后和/或选择肿瘤免疫治疗方案的试剂盒中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述样品选自对象的肿瘤组织、肿瘤细胞。