CN116458430A - 一种龙脷叶的组培培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种龙脷叶的组培培养基及其应用，属于植物组织培养技术领域。本申请的龙脷叶组培培养基包括不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基。本申请还提供了上述培养基在快速繁殖龙脷叶中的应用，包括外植体预处理、诱导不定芽处理、丛生芽增殖培养、诱导生根处理步骤。本申请通过选取不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基作为龙脷叶的快速繁殖培养基，能够缩短龙脷叶幼苗的繁殖时间，提高龙脷叶幼苗的繁殖效率。
Description
技术领域
本申请涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种龙脷叶的组培培养基及其应用。
背景技术
龙脷叶，大戟科。小灌木，高30～40cm，根属主根系。枝多，少扭曲。单叶互生，稍肉质，倒披针状或长圆状匙形。花夏季开放，很小，***，腋生。蒴果大如豌豆，外包宿萼。龙脷叶以叶入药，质量参差不齐，国内尚未进行龙脷叶的规模化种植。此外，龙脷叶生长缓慢，主要依赖分株繁殖，效率低下，难以满足目前的市场需求。因此，龙脷叶的规模化规范种植是发展的趋势，但是现在种苗数量少，目前很难形成规模，生产上急需解决的大量种苗问题。若想大规模种植，并在生产中提高产量、提高经济效益，无疑，促进龙脷叶的无性繁殖速度就显得非常重要。然而，目前针对龙脷叶组织培养的相关报道较少，也未有龙脷叶的工厂化生产，因此急需一种能够短期内大量提供龙脷叶种苗的快速繁殖方法，以保障市场需求。
发明内容
本申请的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够缩短龙脷叶繁殖周期，提高繁殖系数的龙脷叶快速繁殖培养基及其应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种龙脷叶的快速繁殖培养基，包括不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基；
所述不定芽诱导培养基包括以下组分：MS培养基，0.1-0.2mg/L NAA，0.5-1.0mg/L6-BA，pH值为5.8-6.0；
所述丛生芽增殖培养基包括以下组分：MS培养基，0.1-0.15mg/L NAA，1.5-2.0mg/L 6-BA，pH值为5.8-6.0；
所述生根培养基包括以下组分：1/2MS培养基，0.1-0.5mg/L NAA，pH值为5.8-6.0。
本申请通过选取不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基作为龙脷叶的快速繁殖培养基，能够缩短龙脷叶幼苗的繁殖时间，提高龙脷叶幼苗的繁殖效率。本申请的不定芽诱导培养基和丛生芽增殖培养基在MS培养基的基础上添加生长激素NAA和6-BA，能够有效提高不定芽的诱导率和丛生芽的增殖系数；生根培养基在1/2MS培养基的基础上添加植物生长激素NAA，能够有效提高不定根的诱导率。NAA是一种具有生长素类似活性的植物激素，具有促进植物不定根生成的效果；6-BA是一种人工合成的细胞***素，能够促进植物细胞***、非分生组织分化、诱导芽分化等作用。NAA和6-BA均为人工合成的植物生长激素，容易获得并且价格低廉，能够降低快速繁殖龙脷叶的成本。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述不定芽诱导培养基包括以下组分：MS培养基，0.1mg/L NAA，1.0mg/L 6-BA，pH值为5.8；
所述丛生芽增殖培养基包括以下组分：MS培养基，0.1mg/L NAA，2.0mg/L6-BA，pH值为5.8；
所述生根培养基包括以下组分：1/2MS培养基，0.1mg/L NAA，pH值为5.8。
在优选配比下，龙脷叶的不定芽的诱导率、丛生芽的增殖系数以及生根率最高，诱导率为114％、增殖系数为3.6倍和生根率为88.9％。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基还包括6-8g/L琼脂和28-32g/L蔗糖。
本申请在组培培养基中加入琼脂，终浓度为6-8wt％，形成固体培养基，由于琼脂的含量在6-8wt％范围内，制备得到的培养基能够使龙脷叶处理培养基表面，并且硬度适中，适合龙脷叶幼苗的根部生长，后续炼苗步骤时起到保湿的作用；在组培培养基中加入碳源蔗糖，有利于龙脷叶的生长。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基还包括7g/L琼脂和30g/L蔗糖。
第二方面，本申请提供了上述培养基在快速繁殖龙脷叶中应用。
作为本申请所述应用的优选实施方式，包括以下步骤：
外植体预处理：选取龙脷叶单株幼嫩带侧芽茎段作为外植体，对龙脷叶植株的幼嫩带侧芽茎段进行清洁和表面消毒，得到无菌外植体；
诱导不定芽处理：将无菌外植体切割为带有一个腋芽的小茎段，放入上述不定芽诱导培养基中培养20-30天，得到龙脷叶的不定芽；
丛生芽增殖培养：将龙脷叶的不定芽转移至上述丛生芽增殖培养基中培养25-30天，得到带有龙脷叶的丛生芽；
诱导生根处理：将龙脷叶的丛生芽分切后转移至上述生根培养基中培养25-30天，得到带有根系的龙脷叶幼苗。
本申请通过选取健康的龙脷叶作为外植体，经过清洁和表面消毒的步骤，再转入不定芽诱导培养基诱导分生不定芽、转入丛生芽增殖培养基诱导分生丛生芽、转入生根培养基诱导生根，达到在短时间内快速繁殖龙脷叶组培苗的效果。
作为本申请所述应用的优选实施方式，在外植体预处理中，对龙脷叶植株采用0.125wt％的多菌灵喷淋，再进行清洁和表面消毒。
作为本申请所述应用的优选实施方式，在外植体预处理中，所述龙脷叶茎段的清洁和表面消毒具体步骤如下：
将茎段放入表面活性剂中浸泡5min后，冲洗15min，得到清洁后的龙脷叶茎段；
将清洁后的龙脷叶茎段转入75wt％乙醇中消毒30s，无菌水漂洗2次，0.1wt％升汞消毒10min，无菌水漂洗3-5次，每次漂洗4-5min，得到无菌外植体。
本申请将龙脷叶茎段在表面活性剂中浸泡，能够有效去除茎段表面的泥土等污染物，并且去除茎段表面的脂质；在清洁后对茎段采用75wt％乙醇和0.1wt％升汞进行消毒，能够有效消灭茎段表面的微生物，避免龙脷叶茎段在组织培养阶段被自然界中的微生物污染，使MS培养基中繁殖大量微生物，导致龙脷叶组培苗的生长被限制甚至死亡。
作为本申请所述应用的优选实施方式，在诱导不定芽处理中，所述带有一个腋芽的小茎段的长度为1-1.5cm。在诱导不定芽处理中将无菌外植体切割为带有一个腋芽的小茎段，并且长度为1-1.5cm，保留腋芽结合生长激素能够促进外植体生成不定芽。切割为1-1.5cm的长度，可以最大程度利用外植体，若是长度过长会反而会抑制外植体的生长，若是长度过短则会导致生长过慢。
作为本申请所述方法的优选实施方式，在诱导不定芽处理或丛生芽增殖培养或诱导生根处理中，所述培养条件如下：光照时间为14h/天，光照强度为2000lx，培养温度为25±1℃。
作为本申请所述应用的优选实施方式，所述应用还包括炼苗移栽步骤，具体操作如下：
将带有根系的龙脷叶幼苗在自然光下遮阴放置2-3天，揭开瓶盖加入无菌水保持培养基湿润，放置2-3天，得到炼苗后的龙脷叶幼苗；
将炼苗后的龙脷叶幼苗从生根培养基中取出，洗去根部的培养基，移栽至泥炭土中并定植于田间。
本申请多次实验发现快速繁殖得到的龙脷叶幼苗经过炼苗处理能够提高其移栽后的存活率。若是不经过炼苗直接将龙脷叶幼苗移栽至土壤中，龙脷叶幼苗突然从结构单一、无菌的培养基转移至复杂的土壤环境中，容易造成龙脷叶幼苗的应激反应，导致龙脷叶幼苗的移栽存活率降低。在经过多次移栽实验发现在炼苗后再将龙脷叶幼苗移栽至土壤中，结合田间管理(保持湿度为90％、适当遮荫、保持通风和增加光照时长)能够大大提高龙脷叶幼苗的移栽存活率，并且使龙脷叶的品质更稳定。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
(1)本申请通过选取不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基作为龙脷叶的组培培养基，能够缩短龙脷叶幼苗的繁殖时间，有效提高龙脷叶快速繁殖过程中不定芽的诱导率、丛生芽的增殖系数和幼苗的生根率，能够再短时间能获得大量的龙脷叶幼苗。
(2)本申请的龙脷叶快速繁殖技术工艺路线简单、可行，操作容易，以龙脷叶茎段为外植体，通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了龙脷叶离体再生植株，建立龙脷叶组织培养快速繁殖技术体系，为节约栽培生产中的用种量，为市场大量提供优质的龙脷叶种苗打定基础。同时，本申请选用NAA和6-BA作为植物生长激素添加至组培培养基中，能够大大降低组培培养基的成本，提高龙脷叶的经济效益。
附图说明
图1为本申请实施例1快速繁殖得到的龙脷叶幼苗；
图2为本申请实施例1～3的龙脷叶快速繁殖得到的龙脷叶的不定芽生长情况，其中A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3；
图3为本申请实施例1、实施例4～5的龙脷叶快速繁殖得到的龙脷叶的丛生芽生长情况，其中A为实施例4，B为实施例5，C为实施例1；
图4为本申请实施例1、实施例6、对比例7的龙脷叶快速繁殖得到的龙脷叶幼苗生长情况，其中A为实施例1，B为实施例86，C为对比例7。
具体实施方式
为更好地说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例、对比例、效果例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1～6
实施例1～6的龙脷叶快速繁殖培养基中的不定芽诱导培养基和丛生芽增殖培养基均在MS培养基的基础上加入7g琼脂、30g蔗糖、NAA和6-BA，NAA和6-BA的用量见表1；生根培养基在1/2MS培养基的基础上加入7g琼脂、30g蔗糖和NAA，NAA的用量见表1。
实施例1～6的龙脷叶快速繁殖方法为：
(1)外植体预处理：选取龙脷叶单株幼嫩带侧芽茎段作为外植体，采用0.125wt％多菌灵喷淋龙脷叶植株后，将龙脷叶植株的幼嫩带侧芽茎段放入表面活性剂中浸泡5min后，冲洗15min，再转入75wt％乙醇中消毒30s，无菌水漂洗2次，0.1wt％升汞消毒10min，无菌水漂洗3-5次，每次漂洗4-5min，得到无菌外植体；
(2)诱导不定芽处理：将消毒后的龙脷叶茎段在无菌条件下切割为1-1.5cm带有一个腋芽的小茎段，放入不定芽诱导培养基中培养20-30天，得到龙脷叶的不定芽；培养条件为光照时间14h/天，光照强度2000lx，培养温度25±1℃，培养时间；
(3)丛生芽增殖培养：将龙脷叶的不定芽转移至丛生芽增殖培养基中培养25-30天，得到带有龙脷叶的丛生芽；培养条件为光照时间14h/天，光照强度2000lx，培养温度25±1℃；
(4)诱导生根处理：将龙脷叶的丛生芽分切后转移至生根培养基中培养25-30天，得到带有根系的龙脷叶幼苗；培养条件为光照时间14h/天，光照强度2000lx，培养温度25±1℃；
(5)炼苗移栽：将带有根系的龙脷叶幼苗在自然光下遮阴放置2-3天，揭开瓶盖加入无菌水保持培养基湿润，放置2-3天，得到炼苗后的龙脷叶幼苗；
将炼苗后的龙脷叶幼苗从生根培养基中取出，洗去根部的培养基，移栽至泥炭土中并定植于田间。
实施例1炼苗移栽后的龙脷叶幼苗如图1所示，龙脷叶幼苗叶片较大、生长状态良好。
表1实施例1～6的快速繁殖培养基部分组分组成
对比例1～2
对比例1～2的快速繁殖培养基与实施例1相似，不同之处为不定芽诱导培养基中不添加NAA，加入IBA以及6-BA的用量不同，具体用量见表2；龙脷叶的快速繁殖方法与实施例1的相同。
表2对比例1～2的不定芽诱导培养基中生长激素的组成及其用量(单位为mg/L)
对比例3～4
对比例3～4的快速繁殖培养基与实施例1相似，不同之处为丛生芽增殖培养基中不添加NAA，加入IBA以及6-BA的用量不同，具体用量见表3；龙脷叶的快速繁殖方法与实施例1的相同。
表3对比例3～4的丛生芽增殖培养基中生长激素的组成及用量(单位为mg/L)
对比例5～7
对比例5～7的快速繁殖培养基与实施例1相似，不同之处为生根培养基的组分不同，具体用量见表4；龙脷叶的快速繁殖方法与实施例1的相同。
表4对比例5～7的生根培养基组分
效果例1不同配方的不定芽诱导培养基对龙脷叶快速繁殖的影响
按照实施例1的快速繁殖方法计算实施例1～3、对比例1～2的龙脷叶经不定芽诱导培养基培养后的出芽总数、诱导率和平均芽高，结果见表5，实施例1～3龙脷叶的生长情况见图2。诱导率的计算公式如下：
诱导率(％)＝出芽总数(个)/外植体接种总数(个)×100％
表5不同不定芽诱导培养基对龙脷叶的影响
如表5和图2所示，本申请的不定芽诱导培养基对龙脷叶的诱导率均达100％以上，并且龙脷叶的生长状态良好，当6-BA的浓度越高，外植体出芽个数越多，总体上来看实施例1的效果最佳。实施例与对比例相比，实施例的龙脷叶诱导率更高、芽高也有所提升，表明本申请的不定芽诱导培养基能够在快速繁殖的过程中提高龙脷叶的诱导率和芽高。
效果例2不同配方的丛生芽增殖培养基对龙脷叶快速繁殖的影响
按照实施例1的快速繁殖方法计算实施例1、实施例4～5、对比例3～4的龙脷叶经丛生芽增殖培养基培养后的芽总数、增殖系数和生长情况，结果见表6，实施例1、实施例4～5的龙脷叶生长情况见图3。增殖系数的计算公式如下：
增殖系数(倍)＝芽总数(个)/接种数(株)
表6不同丛生芽增殖培养基对龙脷叶的影响
如表6和图3所示，龙脷叶的芽体在一定浓度范围内，6-BA的浓度越高，龙脷叶的增殖系数呈增长的趋势，总体上来看实施例1的增殖系数和生长情况最好。实施例与对比例相比，实施例的龙脷叶增殖系数更高，并且能够提升组培苗的生长形状，尽管实施例5的增殖系数略低于对比例4，但是实施例5的生长情况优于对比例4，表明本申请的丛生芽增殖培养基能够在龙脷叶快速繁殖的过程种提高龙脷叶的增殖系数和生长形状。
效果例3不同配方的生根培养基对龙脷叶快速繁殖的影响
按照实施例1的快速繁殖方法计算实施例1、实施例6、对比例5～7的龙脷叶经生根培养基培养后的生根数、生根率和生长情况，结果见表7，实施例1、实施例6、对比例7的龙脷叶生长状态见图4。
表7不同生根培养基对龙脷叶的影响
如表7和图4所示，实施例1与对比例7相比，实施例1的生根率更高，表明1/2MS培养基能够有效促进龙脷叶生根；实施例1与对比例5、6相比，实施例的龙脷叶根系更发达，长势更好，生根率更高；实施例6的生根率略低于对比例7，但是对比例5的植株长势不如实施例6，表明本申请的生根培养基能够在龙脷叶快速繁殖的过程种提高龙脷叶的生根率以及植株长势。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种龙脷叶的组培培养基，其特征在于，包括不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基；
所述不定芽诱导培养基包括以下组分：MS培养基，0.1-0.2mg/L NAA，0.5-1.0mg/L 6-BA，pH值为5.8-6.0；
所述丛生芽增殖培养基包括以下组分：MS培养基，0.1-0.15mg/L NAA，1.5-2.0mg/L 6-BA，pH值为5.8-6.0；
所述生根培养基包括以下组分：1/2MS培养基，0.1-0.5mg/L NAA，pH值为5.8-6.0。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述不定芽诱导培养基包括以下组分：MS培养基，0.1mg/L NAA，1.0mg/L 6-BA，pH值为5.8；
所述丛生芽增殖培养基包括以下组分：MS培养基，0.1mg/L NAA，2.0mg/L6-BA，pH值为5.8；
所述生根培养基包括以下组分：1/2MS培养基，0.1mg/L NAA，pH值为5.8。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基还包括6-8g/L琼脂和28-32g/L蔗糖。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述不定芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基和生根培养基还包括7g/L琼脂和30g/L蔗糖。
5.如权利要求1-4任一项所述的培养基在快速繁殖龙脷叶中应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
外植体预处理：选取龙脷叶单株幼嫩带侧芽茎段作为外植体，对龙脷叶植株的幼嫩带侧芽茎段进行清洁和表面消毒，得到无菌外植体；
诱导不定芽处理：将无菌外植体切割为带有一个腋芽的小茎段，放入不定芽诱导培养基中培养20-30天，得到龙脷叶的不定芽；
丛生芽增殖培养：将龙脷叶的不定芽转移至丛生芽增殖培养基中培养25-30天，得到带有龙脷叶的丛生芽；
诱导生根处理：将龙脷叶的丛生芽分切后转移至生根培养基中培养25-30天，得到带有根系的龙脷叶幼苗。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在外植体预处理步骤中，所述龙脷叶茎段的清洁和表面消毒具体步骤如下：
将茎段放入表面活性剂中浸泡5min后，冲洗15min，得到清洁后的龙脷叶茎段；
将清洁后的龙脷叶茎段转入75wt％乙醇中消毒30s，无菌水漂洗2次，0.1wt％升汞消毒10min，无菌水漂洗3-5次，每次漂洗4-5min，得到无菌外植体。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在诱导不定芽处理步骤中，所述带有一个腋芽的小茎段的长度为1-1.5cm。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在诱导不定芽处理或丛生芽增殖培养或诱导生根处理中，所述培养条件如下：光照时间为14h/天，光照强度为2000lx，培养温度为25±1℃。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用还包括炼苗移栽步骤，具体操作如下：
将带有根系的龙脷叶幼苗在自然光下遮阴放置2-3天，揭开瓶盖加入无菌水保持培养基湿润，放置2-3天，得到炼苗后的龙脷叶幼苗；
将炼苗后的龙脷叶幼苗从生根培养基中取出，洗去根部的培养基，移栽至泥炭土中并定植于田间。
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| CN202310487842.3A CN116458430A (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一种龙脷叶的组培培养基及其应用 |
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| CN116458430A true CN116458430A (zh) | 2023-07-21 |
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Citations (3)
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| CN1748482A (zh) * | 2005-10-14 | 2006-03-22 | 嘉应学院 | 守宫木快速繁殖的方法 |
| US20160219801A1 (en) * | 2015-02-03 | 2016-08-04 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Method of regenerating rubber tree, method of propagating rubber tree, method of inducing shoot, method of elongating shoot, method of rooting shoot, and method of acclimatizing young plant |
| CN108476983A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-09-04 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种龙脷叶的组培培养基及其快速繁殖方法 |
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2023
- 2023-04-28 CN CN202310487842.3A patent/CN116458430A/zh active Pending
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