CN116445346A - 一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用，所述改善***的罗伊氏乳杆菌命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株，保藏编号为CGMCC No.24408，保藏日期为2022年02月21日。该菌株能够有效改善***及其相关代谢水平紊乱、性激素水平异常的症状，能用于制备预防、缓解或治疗***的产品。

Description

一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用，具体涉及一种罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株、包含其的培养物、包含其的益生菌剂、及其在制备具有预防、缓解或治疗***功能的药物或保健品中的应用。
背景技术
***(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性最常见的生殖内分泌代谢性疾病。PCOS常见临床表现包括月经不规律、高雄激素相关表现、***障碍性***等，可同时伴有肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱、肠道菌群失调等代谢异常症状。远期还可能增加II型糖尿病、心脑血管疾病、代谢综合征、***相关性恶性肿瘤等疾病发病风险，严重影响患病女性生育力、远期健康及生活质量。
肠道菌群是我们身体不可或缺的“微生物器官”，在维持健康方面起着至关重要的作用。近年来，肠道微生物群和代谢疾病之间的联系成为研究人员关注的焦点，他们发现了肠道健康和***之间具有相关性，因此提出肠道微生物群中可能存在影响***的某些机制。
因此，如何提供一种可以有效改善PCOS、缓解相关代谢水平失衡、性激素分泌异常的微生物制剂，女性患者可尝试使用含有特定益生菌的保健品或药品，解决因***引起的生殖健康问题给患者带来的不良生活体验，以期能为基于肠道菌群为靶点治疗或辅助治疗PCOS提供新的帮助。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用，具体提供一种罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株、包含其的培养物、包含其的益生菌剂、及其在制备具有预防、缓解或治疗***功能的药物或保健品中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善***的罗伊氏乳杆菌，所述改善***的罗伊氏乳杆菌命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株(同种异名：罗伊氏黏乳杆菌Limosilactobacillus reuteri)，保藏编号为CGMCC No.24408，保藏日期为2022年02月21日。
本发明从江苏省苏州市健康人源母乳样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善***的罗伊氏乳杆菌，将其命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriLR38菌株，该菌株能够有效改善***及其相关代谢水平紊乱、性激素水平异常的症状，具体体现在：(1)显著改善***患者卵巢组织病理症状，包括囊性卵泡、黄体数量和睾酮水平等；(2)能够产具有丰富抗菌活性的短链脂肪酸，参与机体免疫反应和内分泌调控，从而调节宿主代谢水平和性激素分泌；(3)能够显著提高肠道菌群的多样性。因此，此罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株能用于制备预防、缓解或治疗***的产品(如药品等)。
另外，罗伊氏乳杆菌是一种益生菌，因此，本发明筛选得到的罗伊氏乳杆菌LR38用于预防、缓解或治疗***的产品(如药品等)中时，安全性高；且其不会产生抗药性，改善常规***患者因抗生素用药所带来生理和心理上的等不良反应发生，可长期用于预防、缓解或治疗女性***的产品中。
本发明所涉及的罗伊氏乳杆菌的筛选步骤如下：
(1)选取分离自江苏省苏州市健康人源母乳样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的3株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的3株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株耐胃酸和胆盐能力(人工模拟)、产SCFA(短链脂肪酸)量更优的单菌株，对其进行鉴定。
第二方面，本发明提供一种改善***的罗伊氏乳杆菌的培养物，所述培养物的制备方法包括：将第一方面所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株接种于培养基中在30-38℃下(例如30℃、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃等)培养18-24h(例如18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等)即得。
上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、L-半胱氨酸。
具体地，所述培养基(液体)的配方组成包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乳糖10g、酵母浸膏5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO4 0.01g、L-半胱氨酸1g。
本发明优选上述培养条件，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖等)利用能力。
第三方面，本发明提供一种具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂包括第一方面所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株。
本发明所涉及的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。
优选地，在所述益生菌剂中，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g，例如1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、5×108CFU/mL、8×108CFU/mL、1×109CFU/mL、5×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
所述益生菌剂的剂型可以为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、溶液剂等剂型。
优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂乳粉。
所述辅助添加剂包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、低聚木糖、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
进一步优选地，所述益生菌剂还包括嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilusLA88菌株；所述嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株的保藏编号为CGMCCNo.24109，2021年12月15日。
本发明还创造性地发现上述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株能够与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株进行复配使用用于预防、缓解或治疗***，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LR38菌株与LA88菌株在调节***患者代谢水平和性激素分泌异常等症状，提高患者肠道菌群丰度等方面具有协同增效作用。
优选地，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株的活菌数比为(2-5):1，例如2:1、3:1、4:1、5:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
第四方面，本发明提供根据第一方面所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri LR38菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备具有预防、缓解或治疗***功能的药物或保健品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明分离获得并保藏了一株新的能够改善***的罗伊氏乳杆菌，将其命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株，该菌株能够有效改善***及其相关代谢水平紊乱、性激素水平异常的症状，具体体现在：(1)显著改善***患者卵巢组织病理症状，包括囊性卵泡、黄体数量和睾酮水平等；(2)能够产具有丰富抗菌活性的短链脂肪酸，参与机体免疫反应和内分泌调控，从而调节宿主代谢水平和性激素分泌；(3)能够显著提高肠道菌群的多样性。因此，此罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri LR38菌株能用于制备预防、改善或治疗***的产品(如药品等)。
本发明还创造性地发现上述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株能够与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗女性***，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LR38菌株与LA88菌株在调节***患者代谢水平和性激素分泌异常等症状，提高患者肠道菌群丰度等方面具有协同增效作用。
附图说明
图1是罗伊氏乳杆菌LR38菌株和/或嗜酸乳杆菌LA88菌株干预对α多样性和差异菌群的检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24408，保藏日期为2022年02月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容中涉及的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24109，保藏日期为2021年12月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容中涉及的罗伊氏乳杆菌LR38菌悬液：将罗伊氏乳杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到罗伊氏乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
下述内容中涉及的嗜酸乳杆菌LA88菌悬液：将嗜酸乳杆菌LA88接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到嗜酸乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
下述内容中涉及的MRS培养基的配方组成包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乳糖10g、酵母浸膏5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸1g。
实施例1
本实施例筛选一株改善***的罗伊氏乳杆菌，步骤如下：
(1)选取分离自江苏省苏州市健康人源母乳样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为35％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：
(2.1)耐酸和胆盐能力测试：
使用MRS液体培养基、MRS固体培养基和分离培养基(在固体CMRS重加0.5％CaCO3)，主要试剂有胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆酸钠和CaCO3等。把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2％的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化ΔOD600值；在MRS培养基中添加0.1％牛胆盐，121℃下15min灭菌后按2％的接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养24h后测定其在24h过程中吸光度的变化ΔOD600值，最后选取两个ΔOD600值相对大的10个菌株做下一步实验。
耐酸性实验：以pH＝6.8的PBS缓冲液为基础，再用37％的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10％接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。
耐胆盐实验：菌种活化两代后的液体培养物以2％接种量接入含有不同胆盐浓度的MRS培养基中(培养基中分别喊0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、2％胆盐)，同时以不含胆盐的MRS培养基为对照，在37℃恒温培养24h后取样测定活菌数，结合上一个实验结果筛选出耐酸耐胆盐的优良菌株。
(2.2)产酸能力测试：
采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养24h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度/(g·L-1)＝(V1-V2)×c×100×V0-1(V1为样品消耗NaOH溶液的体积，mL；V2为空白对照消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为稀释液的总体积，mL；c为标准NaOH的浓度，mol/L)。
综合上述筛选实验，选择产酸能力、胃酸和胆盐耐受能力最强的一株菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
(1)形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落为乳白色且饱满的圆点状。挑选对数生长期的该菌株，进行光学显微镜检测，经涂片和革兰染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为杆状，无芽孢无鞭毛。
(2)16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2％比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养24h后进行离心分离，6000rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为罗伊氏乳杆菌。
SEQ ID No:1：
ATACATGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGOCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAGTCGTACAAG。
基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株。
实施例3
本实施例对罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株的培养条件进行优化，步骤如下：
将罗伊氏乳杆菌LR38接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如表1所示：
表1
2h 4h 8h 12h 20h 24h 30h 40h 48h
10℃ 0.359 0.550 0.558 0.558 0.562 0.565 0.565 0.566 0.565
20℃ 0.502 0.560 0.558 0.562 0.574 0.581 0.581 0.604 0.600
30℃ 0.495 0.506 0.617 0.683 1.075 1.774 2.359 2.634 2.700
35℃ 0.583 0.627 0.700 1.964 3.659 4.770 4.755 4.736 4.708
40℃ 0.576 0.604 0.711 1.563 3.374 4.581 4.554 4.406 4.390
45℃ 0.550 0.592 0.637 0.785 1.982 2.325 2.330 2.271 2.223
50℃ 0.519 0.521 0.585 0.610 0.759 1.425 1.420 1.411 1.408
结果显示，LR38在35-38℃，培养20-24h即可达到生长稳定期。
根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基(基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成)和API 50CH试验条对检测菌株LR38进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。
最后结果得到，菌株LR38可利用碳源葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖糖等多种糖源。
实施例4
本实施例验证罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株的耐胃酸、胆盐能力，步骤如下：
(1)制备人工胃液、胆盐：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
10％牛胆盐：称取10.0g牛胆盐(沃凯，国药集团化学试剂有限公司，中国上海)至100mL无菌水中，0.22μm滤膜过滤除菌。
含0.1％胆盐MRS培养基：按说明书配制MRS培养基(北京索莱宝科技有限公司)，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，加入适量10％牛胆盐溶液至终浓度为0.1％。
(2)耐胃酸能力测试：
取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR38菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，做3个平行。通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，
其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表2。
表2
人工胃液pH 活菌数N0(0h) 活菌数N1(3h) 存活率(％)
2.0 (6.82±0.21)×108 (5.34±0.25)×108 78.3
2.5 (6.79±0.15)×108 (6.14±0.21)×108 90.4
3.0 (6.80±0.23)×108 (6.44±0.29)×108 94.7
(3)耐胆盐能力测试：
取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR38菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，与9.0mL含0.1％牛胆盐MRS培养基混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，
其中，N1：胆盐处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表3。
表3
活菌数N0(0h) 活菌数N1(3h) 存活率(％)
(6.75±0.18)×108 (5.643±0.24)×108 83.6
由表2和表3可以看出，本发明所述的罗伊氏乳杆菌LR38具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达78.3％；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达90.4％；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达94.7％。良好的胃酸和胆盐耐受能力为其在胃肠道定植，改善机体代谢和激素分泌水平以及制备预防、改善或治疗***的产品创造了条件。
实施例5
罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株的使用安全性测试：
根据2010年版中国药典，选取6只SPF级小鼠(体重约20-25g)，于小鼠的腹腔注射0.6mL新鲜的MRS培养基培养得到的LR38培养液(活菌数约2×109CFU/只小鼠)，并于每天测量每只小鼠的体重变化，记录小鼠注射前后的精神状态、行为活动等生理变化情况。结果得到，一周内小鼠的体重轻微增长，未有明显中毒症状的发生，行为活动正常，无死亡现象，无不良反应，因此可认为罗伊氏乳杆菌LR38安全性高，属于正常无毒类益生菌。
实施例6
本实施例验证罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株缓解大鼠***症状的影响，步骤如下：
8周龄的雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠购自上海斯莱克实验动物中心，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会(伦理号：2022032003)的伦理批准。所有动物均饲养在特定的无病原体屏障条件下，12小时光照和12小时黑暗交替循环并提供饲料和水。动物实验严格遵循国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》。
(1)***大鼠模型的建立：根据现有技术常用方法(参考文献：WangMX,Yin Q,Xu X.ARat Model of Polycystic Ovary Syndrome with Insulin ResistanceInduced by Letrozole Combined with High Fat Diet.Med Sci Monit.2020May 25；26:e922136.DOI:10.12659/MSM.922136.)，使用来曲唑(letrozole，购于江苏恒瑞医药股份有限公司)诱导大鼠***。将48只大鼠随机分为6组：对照组(CTL)、未经治疗的***模型组(MC)、经罗伊氏乳杆菌LR38治疗的***组(LR38)、经嗜酸乳杆菌LA88治疗的***组(LA88)、经罗伊氏乳杆菌LR38和嗜酸乳杆菌LA88联合用药治疗的***组(LR38+LA88，活菌数比例3:1)、经罗伊氏乳杆菌ATCC53608和嗜酸乳杆菌LA88联合用药治疗的***组(ATCC53608+LA88，活菌数比例3:1)。各组菌剂干预均为4×109CFU/天，在给药前进行1周的适应期。为了评价益生菌对***的影响，我们用来曲唑(1mg/kg，1％羧甲基纤维素灌胃)连续21天诱导***症状，CTL大鼠灌胃用1％羧甲基纤维素代替来曲唑。所有大鼠均饲喂正常饲料，连续28天，每3天记录体重(结果如表4所示，单位：g)和饮食消耗。
(2)将上述各菌株分别接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在6000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到上清液；使用PBS重悬菌体，得到各菌悬液。
(3)血清分析：大鼠夜间禁食，第29天处死。采集血液样本，20℃保存1小时，然后在3000g下离心15min以获得血清。
代谢水平的测定：用生化分析仪(Beckman Coulter,CA)测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(结果如表5所示)。
性激素水平的测定：睾酮、促***(LH)、***(E2)、孕酮、抗缪勒管激素(AMH)、***释放激素(GnRH)采用酶联免疫试剂盒，按照制造商的方案(武汉纯度生物技术公司)进行测定(结果如表6所示)。
(4)口服糖耐量试验(OGTT)：大鼠夜间禁食，在第26天进行口服葡萄糖耐量试验。基线检测后，给大鼠灌胃葡萄糖(2.5g/kg体重，50％葡萄糖溶液)。给药后30、60、90和120min的血糖浓度通过使用血糖试纸(商品名：卓越金锐血糖试纸，Roche)进行尾静脉采血测定(结果如表7，单位：mmol/L)。
(5)粪便采样和短链脂肪酸检测：收集小鼠结肠、粪便于无菌试管中快速冷冻于-80℃保存。使用气相色谱-质谱法分析短链脂肪酸含量，检测回肠内容物、盲肠内容物、结肠内容物和粪便中的总SCFAs水平(结果如表8，单位：μmol/g)。
表4
由表4可得，对比CTL组，经过为期4周的干预MC组大鼠生长迅速，体重增长较快。在予益生菌干预组，LR38组大鼠体重增长的趋势有所减缓，整体生长速度较MC组有所下降；另外，意外发现当罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌组合干预时，即LR38+LA88组大鼠的减重效果更加明显，尤其是在第4周时，其平均体重有向CTL组趋近的趋势。
表5
由表5可得，对比CTL组，MC组的甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量较高，总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低，表明来曲唑成功诱导了大鼠的代谢紊乱。然而，当益生菌干预时，我们发现LR38组大鼠的TG和LDL-C水平有所下降，TC和HDL-C水平有所恢复。另外，我们意外的发现，在LR38+LA88组，大鼠各血清TC、HDL-C、TG、LDL-C水平基本都能恢复正常，更趋于CTL组。总的来说，罗伊氏乳杆菌LR38具有优异的改善***大鼠代谢紊乱症状的效果。
表6
表6数据反映了实验大鼠的内分泌状态。通过分析血清性激素浓度，我们发现MC大鼠的睾酮、LH以及GnRH水平明显偏高，呈现***症状，同时其孕酮、E2浓度和AMH水平偏低，反映MC大鼠卵巢功能异常。然而，在益生菌的干预下，LR38组大鼠的雄性激素睾酮水平呈现下降趋势，且***水平有所上升，即***症状有所改善。另外我们发现，复合益生菌组LR38+LA88对实验大鼠具有更加明显恢复其***水平的作用，使其***相关症状有所缓解。
表7
组别 0min 30min 60min 90min 120min
CTL 5.7 8.4 9.5 7.7 5.8
MC 5.6 12.5 14.4 9.8 8.6
LR38 5.7 9.6 10.0 8.4 6.5
LR38+LA88 5.8 8.7 9.5 8.0 6.1
LA88 5.5 10.3 12.8 9.2 7.6
ATCC53608+LA88 5.7 10.5 12.6 9.0 7.4
表7反映了实验大鼠在2小时内的血糖浓度变化情况，对比CTL组，MC大鼠自身血糖代谢调控受阻，无法正常调节血糖浓度，但是在LR38大鼠中，血糖代谢能力有所改善，基本能恢复正常，尤其是当LR38+LA88组合时，其对模型大鼠血糖代谢调控方面效果更明显。
表8
组别 盲肠总SCFAs 结肠总SCFAs 粪便总SCFAs
CTL 200.4 70.5 99.3
MC 176.3 55.2 76.5
LR38 227.6 84.9 165.9
LR38+LA88 252.8 92.2 170.4
LA88 189.6 80.6 133.6
ATCC53608+LA88 190.5 81.1 140.2
由表8结果可得，对比CTL组，MC组大鼠肠道菌群代谢产物在盲肠、结肠和粪便总SCFAs数量均有所减少，即***影响肠道菌群稳态从而降低了SCFAs含量，进而可能引发胰岛素抵抗等代谢紊乱，如表8所呈现的实验大鼠出现血糖调控受阻。但在益生菌干预下，我们LR38组实验大鼠肠道和粪便中的短链脂肪酸检测出的数量明显增多，也就是说，罗伊氏乳杆菌的干预能改善***肠道菌群失调的问题，提高SCFAs含量，从而有助于机体能量摄入、调节免疫、改善代谢水平等。另外，我们发现当LR38和LA88组合时，这一作用更明显。
实施例6
本实施例验证罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株对大鼠卵巢组织病理的影响：
(1)PCOS大鼠模型建立方法同实施例5。
(2)大鼠卵巢组织病理分析：
给予实验大鼠安乐死后，立即从CTL组、MC组、LR38组和LR38+LA88组体内取出卵巢和结肠样本，用4％多聚甲醛固定。进行苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化。参考文献中(Wang MX,Yin Q,Xu X.A Rat Model of Polycystic Ovary Syndrome with InsulinResistance Induced by Letrozole Combined with High Fat Diet.Med SciMonit.2020May 25；26:e922136.)对形态学的判断：颗粒细胞层变弱，膜细胞层变厚的卵泡被认为是囊性卵泡。同时，计算囊泡、囊泡占比(囊性卵泡占比＝囊性卵泡数/总卵泡数)和黄体的数量。结果如表9所示。
表9
组别 囊性卵泡数 黄体数(个) 颗粒细胞层厚度(μm)
CTL 0.13 8.63 56.93
MC 8.88 2.63 22.67
LR38 3.13 6.75 43.71
LR38+LA88 2.13 8.13 48.62
通常来曲唑诱导的***大鼠模型中，卵巢病理状态主要是因性激素水平紊乱导致的，卵巢呈现黄体减少、多囊泡等症状。由表9结果显示的大鼠卵巢病理学指标，对比CTL组，MC组大鼠的囊性卵泡数明显升高，伴随着黄体数量骤减，细胞层厚度变薄，但益生菌干预后，LR38组大鼠可以有效降低大鼠卵巢重量指数、囊性卵泡数量，同时部分恢复卵巢黄体数。另外，我们意外的发现，LR08+LA88组合大鼠卵巢形态基本恢复正常，黄体较为丰富，卵泡较多，基本趋于CTL组。换句话说，罗伊氏乳杆菌LR38能通过调节性激素水平从而恢复卵巢的形态学异常。
实施例7
本实施例验证罗伊氏乳杆菌LR38调节肠道菌群功能，步骤如下：
(1)PCOS大鼠模型建立方法同实施例5。
(2)肠道菌群分析：采集CTL组、MC组、LR38组和LR38+LA88组大鼠的粪便。使用QIAamp粪便DNA提取试剂盒(Qiagen)，从200mg粪便中提取总DNA。采用341F(SEQ ID No:2：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(SEQ ID No:3：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)引物PCR扩增16S rRNA V3-V4区。最终的16S rRNA基因扩增子文库在MiSeq平台(Illumina)上使用2×300bp配对末端方案进行测序。使用Usearch11合并获得的配对末端读数并保留长度≥400pb的读数进行以下分析。将所有质量过滤序列映射到无嵌合体的ASV，并使用具有默认设置的USEARCH11创建ASV丰度表。以RDP训练集(v18版)的16S rRNA数据库为参考数据库。基于ASVs丰度表，用Usearch计算Chao1和Shannon多样性的指数(α多样性)通过单因素方差分析(ANOVA)确定干预效应，并通过Tukey检验显著性差异检验事后分析各组间差异。罗伊氏乳杆菌LR38干预对α多样性检测结果如图1所示。
由图1可知，与CLT组相比，MC组大鼠的微生物群落α多样性显著下降。具体地，微生物丰富度下降(以Chao1指数表示)，以及微生物多样性下降(以Shannon指数表示)。LR38组与MC组对比显示，LR38增加了微生物群落的α多样性，且当罗伊氏乳杆菌LR38和嗜酸乳杆菌LR88共同作用时，益生菌复合制剂对***大鼠的肠道菌群多样性的提升效果更显著。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善***的罗伊氏乳杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种改善***的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述改善***的罗伊氏乳杆菌命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株，保藏编号为CGMCC No.24408，保藏日期为2022年02月21日。
2.一种改善***的罗伊氏乳杆菌的培养物，其特征在于，所述培养物的制备方法包括：将权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株接种于培养基中在30-38℃下培养18-24h即得。
3.一种具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株。
4.如权利要求3所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
5.如权利要求3所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.如权利要求3所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
7.如权利要求6所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂乳粉；
所述辅助添加剂包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、低聚木糖、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
8.如权利要求3所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株；所述嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA88菌株的保藏编号为CGMCCNo.24109，2021年12月15日。
9.如权利要求8所述的具有预防、缓解或治疗***的益生菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株与嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus LA88菌株的活菌数比为(2-5):1。
10.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR38菌株或权利要求2所述的培养物或权利要求3-9中任一项所述的益生菌剂在制备具有预防、缓解或治疗***功能的药物或保健品中的应用。
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