CN116421499A - 一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体及其制备方法与应用，纳米醇质体包括以下质量份组分：0.5‑5份磷脂、5‑30份小分子多元醇、0.5‑4份青花椒挥发油、0.5‑2份神经酰胺E、0.5‑5份樟树提取物、水补足至总质量份为100份。本发明还公开了上述复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法。本发明的复合青花椒挥发油纳米醇质体温和无刺激，抗炎、修护、抗菌效果好、贮藏稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及纳米制剂领域，尤其涉及一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体及其制备方法与应用。
背景技术
青花椒主要分布于包括中国在内的亚洲国家。青花椒含有丰富的挥发油、生物碱、酰胺、香豆素和木脂素等成分，具有抗菌、抗病毒、镇痛、提高机体免疫力、保护心血管等功效。然而，青花椒挥发油具有较强的刺激性，其作为护肤品的活性成分进行使用时，往往容易引起皮肤的刺激或其他的不良反应。此外，青花椒油还具有光/热不稳定和难吸收的问题，大大限制了青花椒挥发油在化妆品领域中的应用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，且该纳米醇质体温和无刺激、贮藏稳定。
本发明另一目的在于提供上述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，包括以下质量份组分：0.5-5份磷脂、5-30份小分子多元醇、0.5-4份青花椒挥发油、0.5-2份神经酰胺E、0.5-5份樟树提取物、水补足至总质量份为100份。
作为优选方案，所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体包括以下质量份的组分：0.5-2份磷脂、10-25份小分子多元醇、1-3份青花椒挥发油、0.5-1.5份神经酰胺E、1-3份樟树提取物、水补足至总质量份为100份；更优选地，所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体包括以下质量份的组分：1份磷脂、20份小分子多元醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、74份水。
作为优选方案，所述磷脂包括大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱中的一种或几种。
作为优选方案，所述小分子多元醇包括1,3-丙二醇、甘油、1,2-丁二醇、戊二醇、1,2-己二醇中的一种或多种；更优选地，所述小分子多元醇为1,2-己二醇。
作为优选方案，所述樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树树叶提取物＝1-5:1；更优选地，所述樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物质量比为樟树树皮油：樟树树叶提取物＝1:1。
本发明还提供了上述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将磷脂、小分子多元醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物混合，获得有机相；
(2)将步骤(1)的有机相加入水中，混合，获得混合液；
(3)将步骤(2)混合液均质分散，获得粗醇质体；
(4)将步骤(3)粗醇质体均质，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
作为优选方案，步骤(1)中所述的混合在25-30℃、150-600rpm下混合10-30min。
作为优选方案，步骤(2)中所述的将有机相加入水中为在搅拌下通过蠕动泵将有机相匀速滴入水中；更优选地，所述搅拌转速为150-600rpm，所述蠕动泵的滴加速率为1.0-5.0ml/min。
作为优选方案，步骤(2)中所述的混合在25-35℃、150-600rpm下混合10-30min。
作为优选方案，步骤(3)中所述的均质分散为5000-9000rpm高速剪切均质分散5-20min。
作为优选方案，步骤(4)中所述的均质采用高压，压力为600-1200bar，循环次数为2-6次。
还提供了上述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体在制备化妆品中的应用。
作为优选方案，所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体在制备化妆品中的添加量为0.5-10wt％。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、本发明的复合青花椒挥发油醇质体具有较小的粒径和较高的包封率，与青花椒挥发油、复合青花椒挥发油脂质体和复合青花椒挥发油纳米乳相比，表现出更优异的透皮吸收性能、抑菌效果、抗炎修护效果，在不同环境下能够稳定贮藏3个月，具有更好的贮藏稳定性，并且温和无刺激。
2、本发明的复合青花椒挥发油醇质体通过青花椒挥发油、神经酰胺E和樟树提取物复配，协同增效，使产品更温和，抗菌、抗炎、修护效果更好。
附图说明
图1是实施例1和对比例1、9、10的样品在3个月内的粒径变化率。
图2是实施例1和对比例1、9、10的样品在3个月内的包封率变化率。
图3是实施例1～3、对比例5的样品在3个月内的粒径变化率。
图4是实施例1～3、对比例5的样品在3个月内的包封率变化率。
图5是实施例1，4～8的样品在3个月内的粒径变化率。
图6是实施例1，4～8的样品在3个月内的包封率变化率。
图7是实施例1，对比例1～4，对比例6～10的样品在3个月内的粒径变化率。
图8是实施例1，对比例1～2，对比例6～10的样品在3个月内的包封率变化率。
图9是使用实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油溶液前后TNFα的抑制率。
图10是使用实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油溶液前后各时段的皮肤经皮水分流失变化率(与损伤值对比)。
图11是使用实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油溶液前后各时段的皮肤红色素含量变化率(与损伤值对比)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1～6
实施例1～6分别提供一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，配方见表1，其中樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树叶提取物＝1：1，制备方法包括以下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、1,2-己二醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物在30℃、300rpm下搅拌15min，获得有机相；
(2)在300rpm磁力搅拌下，通过蠕动泵将有机相以2.0ml/min匀速滴入去离子水中，在30℃、300rpm下搅拌10min，获得混合液；
(3)将混合液在6000rpm下高速剪切均质分散10min，获得粗醇质体；
(4)将粗醇质体进行高压均质，压力为800bar，循环4次，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
表1实施例1～6的复合青花椒挥发油纳米醇质体配方/按质量份计
| 组别 | 大豆卵磷脂 | 1,2-己二醇 | 青花椒挥发油 | 神经酰胺E | 樟树提取物 | 去离子水 |
| 实施例1 | 1 | 20 | 2 | 1 | 2 | 74 |
| 实施例2 | 1 | 20 | 1 | 1 | 2 | 75 |
| 实施例3 | 1 | 20 | 4 | 1 | 2 | 72 |
| 实施例4 | 1 | 5 | 2 | 1 | 2 | 89 |
| 实施例5 | 1 | 10 | 2 | 1 | 2 | 84 |
| 实施例6 | 1 | 30 | 2 | 1 | 2 | 64 |
实施例7～8
实施例7～8分别提供了一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，制备方法与实施例1相同，配方与实施例1基本相同，不同之处如下：
实施例7的小分子多元醇为1,3-丙二醇；
实施例8的小分子多元醇为丙三醇。
实施例9
实施例9提供了一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，按质量份计配方为：1份氢化卵磷脂、20份1,2-己二醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、74份去离子水，其中樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树叶提取物＝1：1。
制备方法包括以下步骤：
(1)将氢化卵磷脂、1,2-己二醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物在35℃、300rpm下搅拌20min，获得有机相；
(2)在400rpm磁力搅拌下，通过蠕动泵将有机相以1.5ml/min匀速滴入去离子水中，35℃、200rpm下搅拌10min，获得混合液；
(3)将混合液在8000rpm下均质分散10min，获得粗醇质体；
(4)将粗醇质体在1000bar压力下均质，循环3次，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
实施例10
实施例10提供了一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，按质量份计配方为：1份鞘磷脂、20份1,2-己二醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、74份去离子水，其中樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树叶提取物＝1：1。
制备方法包括以下步骤：
(1)将鞘磷脂、1,2-己二醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物在25℃、300rpm/ml下搅拌15min，获得有机相；
(2)在500rpm磁力搅拌下，通过蠕动泵将有机相以1.0ml/min匀速滴入去离子水中，在30℃、200rpm下搅拌20min，获得混合液；
(3)将混合液在6000rpm下高速剪切均质分散5min，获得粗醇质体；
(4)将粗醇质体进行高压均质，压力为600bar，循环6次，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
实施例11
实施例11提供了一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，按质量份计配方为：5份大豆卵磷脂、30份1,2-己二醇、4份青花椒挥发油、2份神经酰胺E、5份樟树提取物、54份去离子水，其中樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树叶提取物＝1：1。
制备方法包括以下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、1,2-己二醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物在30℃下搅拌20min，获得有机相；
(2)在150rpm磁力搅拌下，通过蠕动泵将有机相以2.0ml/min匀速滴入去离子水中，30℃、500rpm下搅拌10min，获得混合液；
(3)将混合液在7000rpm下高速剪切均质分散8min，获得粗醇质体；
(4)将粗醇质体进行高压均质，压力为800bar，循环3次，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
对比例1～8
对比例1～8分别提供一种复合青花椒挥发油纳米醇质体，配方见表2，制备方法与实施例1相同。
表2对比例1～8的复合青花椒挥发油纳米醇质体配方/按质量份计
| 组别 | 大豆卵磷脂 | 1,2-己二醇 | 青花椒挥发油 | 神经酰胺E | 樟树提取物 | 去离子水 |
| 对比例1 | 1 | 20 | 2 | 0 | 0 | 77 |
| 对比例2 | 1 | 20 | 5 | 0 | 0 | 74 |
| 对比例3 | 1 | 20 | 0 | 5 | 0 | 74 |
| 对比例4 | 1 | 20 | 0 | 0 | 5 | 74 |
| 对比例5 | 1 | 20 | 5 | 1 | 2 | 71 |
| 对比例6 | 1 | 20 | 2 | 1 | 0 | 76 |
| 对比例7 | 1 | 20 | 2 | 0 | 2 | 75 |
| 对比例8 | 1 | 20 | 0 | 1 | 2 | 76 |
对比例9
对比例9提供了一种复合青花椒挥发油脂质体，按质量份计配方为：1份大豆卵磷脂、0.1份胆固醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、93.9份去离子水。
制备方法包括以下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物溶于30％的乙醇中，在60℃、150rpm搅拌30min，获得有机相；
(2)将有机相旋转蒸发除去乙醇，加入去离子水，800w超声分散30min，0.45μm有机微孔滤膜过滤，获得复合青花椒挥发油脂质体。
对比例10
对比例10提供了一种复合青花椒挥发油纳米乳，按质量份计配方为：2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、15份辛酸/癸酸甘油三酯、10份1,2-己二醇、70份去离子水。
制备方法包括以下步骤：
(1)将青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物、辛酸/癸酸甘油三酯在80℃下搅拌15min，加入1,2-己二醇，获得油相；
(2)通过蠕动泵将去离子水以2.0ml/min匀速滴入油相中，获得混合液；
(3)将步骤(2)的混合液在15000rpm下高速剪切，再以800bar高压均质，高压均质循环4次，获得复合青花椒挥发油纳米乳。
对比例11～12
对比例11～12分别提供了一种复合花椒挥发油纳米醇质体，制备方法与实施例1相同，配方与实施例1基本相同，不同之处如下：
对比例11青花椒挥发油换为红花椒挥发油；
对比例12樟树提取物换为玫瑰木油。
效果例1对各实施例及对比例进行表征
测定对象：实施例1～11、对比例1～12的样品。
测定项目：粒径、粒径分散系数(PDI)以及包封率。
粒径和PDI采用马尔文Nano ZS90粒径电位检测仪检测，测试角为90°，测试温度为25℃，每组实验设置3次平行实验，取算术平均值，实验结果如表3所示。
分别取200μL实施例1～11、对比例1、2、5～12的样品，9000rpm超滤离心30min，测定滤液中的花椒生物碱含量，以此标定醇质体溶液中未被包裹的游离花椒挥发油的含量；另取醇质体溶液，按照体积比醇质体溶液：甲醇＝1:9，加入甲醇，超声破乳30min，0.45μm有机相滤膜过滤后，测定花椒生物碱含量，以此标定醇质体溶液中花椒挥发油的总含量。花椒生物碱含量测定参考文献：李洋.花椒生物碱和挥发油含量的近红外光谱无损检测[D].西北农林科技大学,2012,13-14.
包封率(EE)根据下述公式计算，结果见表3：
其中，C1为醇质体溶液中未被包裹的游离花椒挥发油的浓度；C0为经甲醇超声破乳后，醇质体溶液中花椒挥发油的总浓度。
表3实施例1～11、对比例1～12样品的表征数据
将实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体、对比例1的青花椒挥发油醇质体、对比例9的脂质体、对比例10的纳米乳进行分析。与对比例1的相比，实施例1的粒径和PDI更小，包封率更高，说明添加了神经酰胺E和樟树提取物的纳米醇质体具有更小的粒径、更窄的粒径分布以及更高的包封率。实施例1的粒径、PDI小于、包封率大于对比例8、对比例9样品，说明相较于脂质体和纳米乳，采用纳米醇质体剂型制备的包裹体具有更小的粒径、更窄的粒径分布以及更高的包封率。纳米载体的粒径越小，越容易发挥纳米载体的透皮吸收性能。因此，本发明的复合青花椒挥发油纳米醇质体与青花椒挥发油纳米醇质体、脂质体和纳米乳相比，具有更优异的透皮吸收性能。
将实施例1与对比例11、对比例12进行分析，从表3可知，实施例1与对比例11的粒径、PDI和包封率差异较小，实施例1的粒径、PDI和包封率优于对比例12的，说明青花椒挥发油替换为红花椒挥发油对醇质体的包封率影响不大，但是樟树提取物替换为玫瑰木油使醇质体的包封率下降，因此制备复合青花椒挥发油纳米醇质体中加入樟树提取物能够提高其包封率。
将实施例1～3与对比例5的复合青花椒挥发油纳米醇质体进行分析。实施例1～3与对比例5的复合青花椒挥发油纳米醇质体的区别在于包载青花椒挥发油的用量不同。对比例3的复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径大于、包封率低于实施例1～3。因此，在本发明中，为了制备粒径较小和包封率较高的复合青花椒挥发油纳米醇质体，青花椒挥发油应设置为0.5～4份。
将实施例1、实施例4～11的复合青花椒挥发油纳米醇质体进行分析。实施例1、实施例4～6、11的复合青花椒挥发油纳米醇质体的区别在于组分的用量不同；实施例1、7、8的复合青花椒挥发油纳米醇质体的区别在于使用的小分子多元醇种类不同；实施例1、9、10的复合青花椒挥发油纳米醇质体的区别在于磷脂的种类及用量不同。从表3可知，实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径最小，包封率最高，实施例1的组分及其用量为本发明的最优选。实施例1、4～6的样品的粒径随着1,2-己二醇的添加量增加复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径先降低后增大，包封率先增大后下降，当1,2-己二醇用量为20质量份时粒径最小，包封率最高，因此本发明复合青花椒挥发油纳米醇质体中的多元醇分子用量优选20质量份。实施例7和8的样品的粒径大于、包封率低于实施例1的样品，说明多元醇分子结构中碳的数目越多，越有利于制备复合青花椒挥发油纳米醇质体。实施例9、10的样品的粒径大于、包封率低于实施例1的样品，说明磷脂中的大豆卵磷脂能够更好地降低样品粒径，提高包封率。实施例11的样品的粒径大于、包封率低于实施例1的样品，说明本发明复合青花椒挥发油纳米醇质体各组分的最优用量为1份磷脂、20份小分子多元醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、74份水。
效果例2贮藏稳定性测定
取600mL样品，分装于6个无色透明样品瓶中，每瓶100mL。将6个样品瓶分别放置在不同的贮藏环境中，测定6个样品瓶中的样品在不同贮藏环境下的外观、粒径和包封率的变化，考察样品的贮藏稳定性，实施例结果见表4，对比例结果见表5，实施例及对比例的粒径和包封率变化情况见图1-8。
测定对象：实施例1～11、对比例1～12的样品。
贮藏环境：-18℃、4℃、室温避光、室温光照、高低温交变循环、45℃。
样品状态考察时间点：初始化状态、贮藏1个月、2个月和3个月。
根据每个时间点的粒径和包封率计算样品贮藏3个月内的粒径变化率和包封率变化率绝对值，计算公式如下：
其中，n表示为1、2或3。
其中，n表示为1、2或3。
表4实施例1～11的样品贮藏稳定性测试结果
表5对比例1～12的样品贮藏稳定性测试结果
根据表4、5及图1、图2可得，实施例1在3个月内的粒径变化率以及包封率变化率的绝对值均小于对比例1、9和10的粒径变化率和包封率变化率的绝对值，上述结果说明，复合青花椒挥发油纳米醇质体比复合青花椒挥发油脂质体、复合青花椒挥发油纳米乳具有更优的稳定性。
根据表4及图3、图4可得，实施例1-3的复合青花椒挥发油纳米醇质体在3个月内的粒径变化率以及包封率变化率的绝对值均小于对比例5的复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径变化率以及包封率变化率的绝对值。因此，青花椒挥发油的添加量会影响复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径、包封率以及稳定性。当青花椒挥发油添加量超过4份时，复合青花椒挥发油纳米醇质体对青花椒挥发油的包封率降低，且放置一段时间后，纳米醇质体易发生团聚，其粒径明显变大。
根据表4及图5-8可看出，实施例1的粒径变化率的绝对值小于实施例4～8、对比例1～4、对比例6～8的粒径变化率的绝对值，实施例1的包封率变化率的绝对值小于实施例4～8、对比例1～2、对比例6～8的包封率变化率的绝对值。结合效果例1的结果可得，复合青花椒挥发油纳米醇质体的粒径、包封率和稳定性均受各组分的种类及其用量的影响，因此最优选为实施例1的组分种类及用量。实施例1的粒径变化率的绝对值均小于对比例6～10，尽管包封率变化率的与实施例相差不大，但是粒径过大，不符合本发明的目的。实施例1的粒径和包封率变化率与对比例11的相似，优于对比例12，结合效果例1的结果可得，复合青花椒挥发油纳米醇质体中的青花椒挥发油对醇质体的包封率稳定性影响不大，但是樟树提取物替换为玫瑰木油使醇质体的包封率稳定性下降。
效果例3抗菌性测试
测试对象：实施例1、对比例1～12的样品。
测试条件：将大肠杆菌菌种活化，以1.0×105CFU/mL为初始浓度，取20mL菌液进行铺板。将金黄色葡萄球菌菌种活化，以5×107CFU/mL为初始浓度，取20mL菌液进行铺板。各吸取10μL样品原液分别加入至上述大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液中，混合均匀，培养24h后，计算活菌菌落数。以1×PBS代替试验样品，重复上述步骤，作为对照样品。测试结果以抑菌率表示，结果见表6，抑菌率计算公式如下：
抑菌率(％)＝[(对照样品平均菌落数-试验样品平均菌落数)/对照样品平均菌落数]×100％
表6实施例1、对比例1～12的样品抑菌率
根据表6的结果可得，实施例1与对比例1～4、6～8相比除脂质和小分子多元醇外仅添加了青花椒挥发油、神经酰胺E和樟树提取物的复合青花椒挥发油纳米醇质体具有更好的抑菌效果，说明青花椒挥发油、神经酰胺E和樟树提取物可以起到抑菌的协同作用。对比例9脂质体和对比例10纳米乳样品对大肠杆菌的抑菌率均低于实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体的抑菌率，说明相较于脂质体和醇质体，复合青花椒挥发油纳米醇质体的抑菌效果更好。对比例11的纳米醇质体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率低于实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体的抑菌率，说明相较于复合红花椒挥发油纳米醇质体，复合青花椒挥发油纳米醇质体的抑菌效果更好。对比例12的纳米醇质体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率低于实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体的抑菌率，说明使用青花椒挥发油和樟树提取物复配得到的醇质体的抑菌效果更好。
效果例5皮肤刺激性测试
测试对象：实施例1、对比例1、对比例2、对比例9～12的样品，2％的青花椒挥发油溶液。
测试方法：按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)对白色家兔进行皮肤刺激性检测，每个样品4只家兔，试验部位为家兔背部脊椎两侧的被毛，去毛范围各为3×3cm，取0.5mL的样品涂抹在一侧皮肤上，涂抹面积为2.5×2.5cm，另一侧不作处理，每天涂抹一次，持续14天，从涂抹的第二天开始，每次涂抹前需对测试区域进行去毛处理，用纯水清楚残留受试物，涂抹1h后根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺激反应评分表及皮肤刺激强度分级考察样品的刺激性，考察结果见表7。
测试前对样品进行预处理，实施例及对比例的样品加入去离子水稀释至10％的溶液。
表7实施例1、对比例1、2、9～12的样品及2％青花椒挥发油刺激性测试结果
根据表7结果可得，在皮肤刺激性测试中实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体表现为无刺激性，对比例1青花椒挥发油纳米醇质体表现为轻刺激性，说明添加了神经酰胺E和樟树提取物能够适当降低复合青花椒挥发油纳米醇质体对皮肤的刺激性，使产品更温和。对比例9脂质体和对比例10纳米乳样品均表现为轻刺激性，2％青花椒挥发油样品表现为中刺激性，说明相较于脂质体和纳米乳，纳米醇质体包裹方式更有效地降低复合青花椒挥发油对皮肤的刺激性，使产品温和无刺激。对比例11的复合红花椒挥发油纳米醇质体表现为无刺激性，表明该体系能够降低花椒挥发油对皮肤的刺激性；对比例12的复合青花椒挥发油纳米醇质体表现为轻刺激性，表明樟树提取物添加到复合青花椒挥发油纳米醇质体体系中，能够进一步降低青花椒挥发油的刺激性。因此，采用纳米醇质体的包裹技术，结合神经酰胺E和樟树提取物，共同作用降低青花椒挥发油对皮肤的刺激性，本发明实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体降低皮肤刺激性的效果最优。
效果例5抗炎测试
测试对象：实施例1、对比例1～12的样品，2％青花椒挥发油溶液。
测试项目：细胞毒性以及细胞TNFα抑制率。
下述实验采用的材料或试剂来源说明如下：
小鼠巨噬细胞Raw 264.7，购自中国科学院昆明细胞库；
TNFα酶联免疫分析ELISA试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，Mouse TNF-αELISA Kit；
其余材料无特别说明均为市售。
(1)细胞毒性测试
利用MTT染色法测定不同浓度的测试样品对小鼠巨噬细胞的毒性。
采用小鼠巨噬细胞Raw 264.7进行细胞毒性测试，细胞株在10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。下述培养基(液)无特别说明均为10％胎牛血清的高糖DMEM培养基；细胞孵育无特别说明均为37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行。
对样品进行前处理，通过培养基将样品分别稀释为1.25％、2.5％、5％和10％浓度的溶液。注：所述2％青花椒挥发油溶液作为整体样品再与培养基稀释，上述的4个浓度并非青花椒挥发油的终浓度。
利用培养基制备细胞悬液，取100μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板，细胞数为3×104个/孔，培养24h后弃去孔中原培养基，每孔加入100μL测试样品，培养箱孵育24h后，每孔中加入100μL 0.1mg/mL的MTT溶液，孵育4h后去除孔中液体，每孔中加入150μL DMSO，振荡15min后，通过酶标仪在570nm波长处测定吸光度。对照组以100μL培养液代替测试样品，每个样品设置3个平行。以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性，结果见表8，细胞活性≥90％的浓度作为巨噬细胞最高安全浓度，抗炎测试浓度选择范围不应超过最高安全浓度。
表8实施例1，对比例1～12的样品及2％青花椒挥发油细胞毒性测试结果
从表8结果可得，实施例1和对比例1-12以及2％青花椒挥发油的样品在5％浓度范围内，细胞无明显细胞毒性，因此将TNFα含量测定的样品浓度选择为3％。
(2)TNFα抑制率测定
通过LPS体外刺激巨噬细胞建立验证模型，采用酶联免疫方法测定细胞的TNFα含量并计算TNFα抑制率，TNFα含量测定的具体步骤按照试剂盒说明书进行，细胞株及培养方法与细胞毒性测试相同。
对样品进行前处理，通过培养液将样品稀释为3％浓度的溶液。注：所述2％青花椒挥发油溶液作为整体样品再与培养基稀释，上述的4个浓度并非青花椒挥发油的终浓度。
本实验共有设置4组，分别为实验组、阴性对照组(空白)以及建模组(LPS组)。实验组添加样品和脂多糖；阴性对照组仅添加培养液；建模组添加培养液和脂多糖。
巨噬细胞于96孔细胞培养板孵育24h后，弃去孔中培养液，实验组各孔加入100μL样品溶液，阴性对照组及建模组为200μL培养液，实验组和阳性对照组各孔分别加入100μL培养液，孵育2h后，除阴性对照组外其余组分别加入10ng/mL的脂多糖，孵育24h后，取孔中培养液离心保留上清，测定上清液中TNFα的含量，以LPS组的TNFα含量为标准，设置TNFα相对含量为100，实施例及对比例组别的相对含量以此进行计算得到，根据下述公式计算得到实施例及对比例的TNFα生成的抑制率，TNFα抑制率结果见图9。
TNFα抑制率＝(LPS组的TNFα相对含量-实验组的TNFα相对含量)×100％
实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油的抗炎测试结果如图9所示。与LPS组相比，实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油溶液样品对炎症因子TNFα生成的抑制率分别为71.8％(实施例1)、51.7％(对比例1)、62.0％(对比例2)、25.3％(对比例3)、42.9％(对比例4)、65.9％(对比例5)、52.7％(对比例6)、48.3％(对比例7)、28.2％(对比例8)、44.9％(对比例9)、37.6％(对比例10)、49.7％(对比例11)、57.8％(对比例12)、44.7％(2％青花椒挥发油溶液)，说明实施例1对炎症因子TNFα生成的抑制效果优于对比例1～12以及2％青花椒挥发油溶液。因此，上述结果可说明与对比例1～12和2％青花椒挥发油相比，实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体的抗炎效果最优。
效果例6人体修护功效测试
测试对象：通过实施例1、对比例1～12的样品，以及2％青花椒挥发油溶液分别制备得到的乳液，乳液配方如表9所示，制备方法包括以下步骤：
(1)测试样品、合成角鲨烷、新戊二醇二(乙基己酸)酯、维生素E和山茶籽油混合，在90℃条件下加热至液体状，得到A相；
(2)将咪唑烷基脲和水混合均匀，得到B相；
(3)将丙三醇、羟苯甲酯、EDTA二钠、卡波姆、精氨酸和水混合，得到C相；
(4)A相搅拌降温至45℃时，加入B相，混合均匀后加入C相，混合均匀得到乳液。
表9样品乳液配方
人体修护功效测试志愿者人数为30人，年龄在18-40岁，身体健康，无正在接受皮肤科治疗或一个月内测试部位有美容、伤口、磨损、温升、丘疹等影响结果判定及其他可能影响测试结果的情况，每个样品设置15位志愿者进行测试。
每一位志愿者的双臂设置5个样品测试区域和1个空白对照区域(每一前臂内侧划分3个区域)，将样品及空白对照区按测试区域随机分布表分布于志愿者前臂内侧区域。在测试区域用3×3cm的胶带反复粘贴8次建立物理损伤模型，使用一次性医用棉签沾取0.0172-0.0189g样品乳液，在测试区域来回均匀涂抹5次，使用干净的棉签重复涂抹操作1次，空白对照组区域不涂抹任何样品，测定该区域皮肤不同时期的皮肤经皮水分流失以及皮肤色素。
通过三探头式皮肤水分流失测试探头Tewameter TM330T对测试区域进行皮肤经皮水分流失的检测，每个区域各测1次，每次检测30s，取后20s的平均值为测量值。
通过皮肤色素测试探头Mexameter MX18对测试区域进行皮肤血红素含量的检测，每个区域分别检测3次，取3次检测值的平均值作为测量值。
皮肤经皮水分流失及皮肤色素检测的时间点为胶带损伤前(原始值，记为D0)、胶带损伤后(损伤值，记为D1)、使用乳液2天后(修复2天值，记为D3)、使用乳液4天后(修复4天值，记为D5)、使用乳液6天后(修复6天值，记为D7)。
根据皮肤经皮水分流失测量值计算平均值、差值以及变化率，平均值结果见表10，平均值、差值和变化率的计算公式如下：
其中，xn表示个体参数检测值，，n表示有效数据数量。
其中，
表示使用后第n个时间点检测时的参数平均值，/>
表示使用前检测的参数平均值。
其中，
表示使用前检测的参数平均值，变化率表示相对于初始值的均值变化程度。
根据皮肤红色含量测量值计算平均值、差值以及变化率，平均值结果见表11，计算公式与皮肤经皮水分流失测量值相同。
表10各样品乳液皮肤水分流失的测定结果(平均值)
根据表10可得，除空白对照外各组的D7(修复6天)与D1(损伤值)对比，D7的皮肤经皮水分流失降低，表明使用实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油样品对应乳液后，在一定程度上可改善皮肤经皮水分流失。由图11可知，在D7阶段，使用实施例1、对比例1～12样品和2％青花椒挥发油对应乳液样品后，皮肤经皮水分流失变化率分别为-14.5％(实施例1)、-10.0％(对比例1)、-10.9％(对比例2)、-11.4％(对比例3)、-8.6％(对比例4)、-11.2％(对比例5)、-10.1％(对比例6)、-11.0％(对比例7)、-6.8％(对比例8)、-9.0％(对比例9)、-7.5％(对比例10)、-9.4％(对比例11)、-5.2％(对比例12)、-8.2％(2％青花椒挥发油溶液)，说明实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体对改善皮肤经皮水分流失最有效，优于对比例1-12的样品和2％青花椒挥发油溶液样品。
表11各样品乳液的皮肤红色素含量的测定结果(平均值)
根据表11可得，除空白对照外各组的D7(修复6天)与D1(损伤值)对比，D7的皮肤红色素含量降低，表明使用实施例1、对比例1-12样品和2％青花椒挥发油对应乳液后，可改善皮肤炎症。在D7阶段，使用实施例1、对比例1-12样品和2％青花椒挥发油样品后，皮肤红色素含量变化率分别为-18.8％(实施例1)、-10.2％(对比例1)、-12.3％(对比例2)、-9.7％(对比例3)、-8.2％(对比例4)、-13.1％(对比例5)、-8.1％(对比例6)、-8.8％(对比例7)、-7.3％(对比例8)、-10.6％(对比例9)、-10.1％(对比例10)、-6.9％(对比例11)、-10.6％(对比例12)、-7.0％(2％青花椒挥发油样品)，说明实施例1的复合青花椒挥发油纳米醇质体对降低皮肤红色素含量的效果最优。
综上所述，本发明的复合青花椒挥发油纳米醇质体能够有效改善人体皮肤经皮水分流失和皮肤红色素含量，达到抗菌、抗炎、修护的效果，具有优异的透皮吸收性能，贮藏稳定性好，并且温和无刺激。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，其特征在于，包括以下质量份的组分：0.5-5份磷脂、5-30份小分子多元醇、0.5-4份青花椒挥发油、0.5-2份神经酰胺E、0.5-5份樟树提取物、水补足至总质量份为100份。
2.如权利要求1所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，其特征在于，包括以下质量份的组分：0.5-2份磷脂、10-25份小分子多元醇、1-3份青花椒挥发油、0.5-1.5份神经酰胺E、1-3份樟树提取物、水补足至总质量份为100份。
3.如权利要求2所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，其特征在于，包括以下质量份组分：1份磷脂、20份小分子多元醇、2份青花椒挥发油、1份神经酰胺E、2份樟树提取物、74份水。
4.如权利要求1-3任一项所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，其特征在于，包括以下各项中的至少一项：
所述磷脂包括大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱中的一种或几种；
所述小分子多元醇包括1,3-丙二醇、丙三醇、1,2-丁二醇、戊二醇、1,2-己二醇中的一种或多种；
所述樟树提取物为樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物，质量比为樟树树皮油：樟树叶提取物＝1-5:1。
5.如权利要求4所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体，其特征在于，所述樟树树皮油和樟树叶提取物的混合物质量比为樟树树皮油：樟树树叶提取物＝1:1。
6.如权利要求1-5任一项所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将磷脂、小分子多元醇、青花椒挥发油、神经酰胺E、樟树提取物混合，获得有机相；
(2)将步骤(1)的有机相加入水中，混合，获得混合液；
(3)将步骤(2)的混合液均质分散，获得粗醇质体；
(4)将步骤(3)的粗醇质体均质，获得复合青花椒挥发油纳米醇质体。
7.如权利要求6所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法，其特征在于，包括以下各项中的至少一项：
步骤(1)中所述的混合在25-30℃、150-600rpm下混合10-30min；
步骤(2)所述的将有机相加入水中为在搅拌下通过蠕动泵将有机相匀速滴入水中；
步骤(2)中所述的混合在25-35℃、150-600rpm下搅拌10-30min；
步骤(3)中所述的均质分散为5000-9000rpm高速剪切均质分散5-20min；
步骤(4)中所述的均质为高压均质，均质压力为600-1200bar，循环次数为2-6次。
8.如权利要求7所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体的制备方法，其特征在于，包括以下各项中的至少一项：
步骤(2)所述的将有机相加入水中的蠕动泵滴加速率为1.0-5.0ml/min；
所述搅拌转速为150-600rpm。
9.如权利要求1-5任一项所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体在制备化妆品中的应用。
10.如权利要求9所述具有抑菌、抗炎和修护功效的复合青花椒挥发油纳米醇质体在制备化妆品中的添加量为0.5-10wt％。
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| JP2010018558A (ja) * | 2008-07-11 | 2010-01-28 | Toyobo Co Ltd | バイオサーファクタントを含有する化粧品組成物 |
| JP2014114290A (ja) * | 2013-12-13 | 2014-06-26 | Showa Denko Kk | 化粧料または皮膚外用剤 |
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| CN114177109A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-03-15 | 广州集妍化妆品科技有限公司 | 一种复合神经酰胺纳米组合物及其制备方法和应用 |
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Patent Citations (5)
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